Kmenové /lad MUDr. Iva Slaninová, Ph.D. Biologicky ústav LF MU ipokorna@med.muni.cz PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Hierarchie buněk v tkáních Kmenové buňky - „self-renewaľ - klon Stí-m "-ŕI G Progeniíorové buňky - s každým dělením více diferencované Progenitor eels *7\ Progenitor cell divisions 0 00 [OnCe] 0000 [twice] 00000 D00 [3 řjjiies] 00000000000ÜÜÜÜÜ 14 times] 00000000000000000000000000000000 [5 times] XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX etc Plně diferencované buňky - postmitoticke - málo progenitorů tvoří spoustu diferencovaných bb Differentiated cells PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Symetrické a asymetrické dělení SYMMETRIC DIVISION ASYMMETRIC DIVISION O. xx TRANSIT AMPLIFYING hQ CELLS * O EMBRYONAL STEM CELLS LOGARITHMIC EXPANSION GERMINAL AND SOMATIC STEM CELLS LINEAR EXPANSION ^. Sell S. Crit Rew. Oncol Hematol: 51, 2004 Symetrické dělení - každá dceřinná bb stejná jako mateřská (klon buněk) - Self- renewaJ - sebBobnovöni Asymetrické -jedna dceřinná bb stejná, druhá zahajuje proces diferenciace -progenitorové bb - uchovávají si schopnost proliferace -obnova tkání - Diferenciace PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Kmenové bunky f É3 Přítomny ve všech tkáních jako zásoba bb pro obnovu* tkání a orgánů Potenciál pro terapii Potenciál pro vznik nádorů > aktivní mechanismus sebeobnovy (self-renewal), vysoká proliferační aktivita > větší pravděpodobnost vzniku a kumulace mutací > nemusí dediferencovat Proqenitorové bb - transformace je podmíněna znovuzískáním self-renewal - dědění existujících mutací do dalších generací, pak už stačí k transformaci 1 mutace fft-JTW PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Nádorové buňky Mutace normálních bb Mutace kmenových bb !!Jen některé nádorové bbjsou schopny u imunodeficientních myší vyvolat nádor!! - tumorigennf bb Existence nádorových kmenových buněk (cancer stem cells) byla předpovězena před více než 40 lety (jako funkční heterogenita nádorů), ale až v posledním desetiletí byly tyto bb charakterizovány u hematopoetických malignit, i u nádorů prsu a mozku. Clarke, M.F., Biology of Blood and Marrow transplantation 11. 2005 PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Kmenové a nádorové buňky ipolečné vlastnosti ) Extenzívní proliferační potenciál a schopnost dát vznik nové tkáni (normální x abnormální) 2) Schopnost sebeobnovy (self- renewal) - společné mechanismy - nesmrtelnost 3) Schopnost tvořit vyzrálé bb - diferenciace 4) Nádorové kmenové bb mohou vznikat z normálních k.b. 5) Metabolické signální dráhy, které jsou porušeny při nádorové transformaci hrají významnou roli při regulaci vývoje kmenových buněk (Wnt, Shh, Notch) 6) Schopnost invazibility migrace a růstu v místech vzdálených od svého vzniku PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Kmenové a nádorové buňky 7) Dlouhé telomery, vysoká telomerázová aktivita 8) Vysoká exprese ABC transportérů - resistence k cytostatikům 9) Sekrece růstových faktorů a cytokinů 10) Sekrece chemoatraktantů pro endoteliální progenitory -angiogeneze 11) Mobilita - migrace normálních k.b.f metastázování nádorových 12) Exprese podobných povrchových receptoru (CXCR4, Sca-1 antigen, CD133) PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Kmenové a nádorové buňk Table 1. Normál tíssueorgan-specifie stem cells are origin of cancer stem cells for different tumors Normal tissue Corresponding tumor Hematopoietic stem cells Leukemias Neural stem cells Brain tumors Bronchial endocrine stem cells Small cell lun^ cancel Ma mína ry £ land epithel ium stem cells Breast cancer Skeletal muscle satellite cells Rh a bdomyosa reo ma Neuroectodermal stem cells Neuroblastoma Renal tubular epithelium stem cells Willms tumor Retina pigment epithelium stem cells Retinoblastoma L i ver oval stem cells Hepatoblastoma Ovarian epithelium item cells O vana n cancer Ce rvi ca 1 epithelium stem cells Cervical cancer Ratajczak, Folia Histochemica and Cytobiologica, 43, 2005 í FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz 91 Vztah mezi stupněm diferenciace a typem rakoviny EMBRYONAL STEH CELL O "O TRANSIT AMPLIFYING CELLS WITH INCREASING DIFFERENTIATION {TISSUE PROGENITOR CELLS) EMBRYONAL CELL CARCINOMAS XX. POORLY DIFFERENTIATED CANCERS O Dl TERMINALLY DIFFERENTIATED CELL WELL DIFFERENTIATED CANCERS Ö BENIGN TUMORS HAIR FOLLICULE BULGE CELLS TRICHOEPITHELIOMA Q BASAL CELLS """"V^ LOWER TRANSIT-AMPLIFYING f J UPPER TRANSIT-AMPLIFYING O. BASALCELL CARCINOMA CELLS SQUAMOUS CELL CARCINOMA PAPILLOMAS TERMINALLY DIFFERENTIATED KERATINIZED CELL Sell S. Crit Rew. Oncol Hematol: 51, 2004 PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Signální dráhy regulující vývoj kmenových buněk i nádorovou transformaci Dráhy zapojené v sebeobnovování kmenových bb a udržení jejich multipotence A zároveň jejich narušení vede k nádorové transformaci Wnt Shh Srno Stem/txogenilor cell aatf-renewal H&íiUBtůpoietlo Epcdérirdl Qut Í O Haemal opoletlc "i -.. '.i I Germ line & % Notch ■V-'-IJ 1 Notóh'1 / r7 Haematopoietic o< N.i. ;ľ Gfrfm line TumorKjenesIs Colon oaitinCiiTia :i ili:"i':>: lumourfi Medullů&aslcma Basal ceil carcinoma Leukaemia Mammary tumours *•/•< *& Apoptóza - např. zábrana apoptóze zvýšenou expresí bcl-2 Reya T., et al., Nature: 414, 2001 PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Signální dráha Wnt/ß-catenin Pokud dráha není aktivována ß-catenin je navázán na adheriny v buněčných spojích neboje v komplexu s axinem -fosforylován, přístupny degradaci. Vazba Wnt na receptor - fosforylace Dsh proteinu, který asociuje s axinem a brání Gsk-3 ve fosforylaci negativních regulátorů - axinu a APC (adenomatous polyposis coli) a ß-cateninu . Nefosforylovany ß-catenin je chráněn před destrukcí -je transponován do jádra, kde aktivuje transkripční faktory (Tcf a Lef) a umožňuje transkripci genů podmiňujících proliferaci (cyclin D1, c-jun, c-myc). Wnt -onkogen Wnt/ß-catenin signalizace - důležitá v proliferaci a diferenciaci - důležitá při vývoji a při kancerogenezi Figure 1 The canonical Wnt sigrailing pathway. In the absence of Wnt signalling (left panel), ß-catenin is in a complex with axin, APC and GSK3-3, and gets phosphorated and targeted for degradation. ß-Catenin also exists in a cadherin-□oundform and regulates cell-cell adhesion. In the presence of Wnt signalling (right panel), ß-catenin is uncoupled from the degradation complex and translocates to the nucleus, where its binds Lef/Tcf transcription factors, thus activating target genes. (Adapted from ret. 44.) Reya and Clevers, Nature434,14 April, 2005 PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Mechanismy vzniku nádoro 1) Transformací tkáňově specifických k.b. (NSC) nebo progenitorů 2) Z bb kostní dřeně inkorporovaných v nesprávný čas na nesprávné místo (chronický zánět, devastace tkání zářením) 3) Z aberantních depozit embryonálních kmenových bb(ESC) (Virchovova hypotéza) 4) Mutace vedoucí k dediferenciaci a imortalizaci diferencovaných bb (familiární rakoviny) PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint. cz Kmenové bb jako terče mutací U vétšiny nádorů jsou terče transformace neznám v Určité typy leukémií - kumulace mutací v hematopoetických kmenových bb Důkazy: AML (akutní myeloidní leukémie) - fenotyp CD34+CD38-stejnýjako kmenové bb -jsou schopné transferovat leukémii do imunodeficientních myší, bb CD34+CD38+ to nedovedou AML T8/21 - AML1-ETO chimérický transkript - u pacientů v remisi je tento transkript i v normálních hematopoetických kmenových bb v kostní dřeni - tyto bb nejsou leukemické a mohou diferencovat —► translokace vzniká v normálních hematopoetických kmenových bb a až další mutace vedou k leukémii PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Progenitorové bb jako terče mutací Model myší s myeloidní leukémií vzniklé z progenitoru - exprese antiapoptotického bcl2 - zábrana apoptóze - klíčová událost při vzniku myeloidních leukémií Mutace se akumulují v kmenových bbf ale jsou exprimovány až u progenitorových bb PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Embryonal rest" hypotéza Tkáňové kmenové bbjsou ekvivalentem dříve popsaných „embryonal rests" a většina nádorů vzniká na základě zástavy dozrávání buněčné linie derivované z těchto bb !!! Nádorová tkáň je méně diferencovaná než normální tkáň !!! Stupeň diferenciace - důležitý prognostický znak (grading) PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Embryonal rest" hypotéza V19. a začátkem 20. století Virchow, Cohnheim, Ribbert a další -domněnky o embryonálním původu nádorů - rakovina vzniká z progenitorů podobných embryonálním nebo germinálním bb lokalizovaným na nesprávných místech (Virchow's embryonal rests) Teratokarcinomy - embryonální karcinomy - struktury připomínající embrya - výskyt u mladších dospělých v místech podél migrace embryonálních bb Nádory dětského věku: Wilmsův tumor (nefroblastom) - ledviny -nediferencovaná mesodermálnítkáň Neuroblastomy Mladší děti horší prognóza, starší - nádor diferencovanější, příznivější PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Dediferenciační hypotéza Rakovina může být vnímána jako blok ontogeneze, problém kontroly progenitorových bb svým okolím (niche) nebo narušení morfogeneze a diferenciace kmenových bb chemikáliemi Mutagenní faktory (chemikálie, záření, viry), způsobí indukci dediferenciace již diferencované bb -anaplazie PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Nádor jako specifický orgán Aberantnf orgán iniciovaný nádorovou bb, která získala schopnost neomezeného dělení díky akumulaci mutací Kmenové bb nádoru vzácné bb s neomezeným proliferačním potenciálem, řídí růst a propagaci nádoru Nádor i normální tkáň - heterogenní kombinace bb s různým diferenciacním potenciálem. Nádorové bb podléhají procesům analogickým self-renewal a diferenciaci. Jen některé bb nádoru jsou schopny extenzívní proliferace (1z 10000 1 ze 100 nádorových bbje schopna tvořit kolonie Klonogenní leukemické bb = leukemické kmenové bb !!! Nová teorie vzniku nádorů vycházející z kmenových bb!!! PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Možnosti chovaní kmenovvch bb a Depletion Q Stem cell Progenitor >~7\ I '-"" Differentiated cells b Maintenance c Expansion (Qí Stem cell (^Commitment to differentiation programme Dick, J.E. Nature:423, 2003 Jen málo nádorových buněkje tumorigenních = tumorigenní bb jsou patrně nádorové kmenové bb PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Teorie vzniku a šíření nádorů (a) Stochastic model •i KP öS ®« Tumor gmwrh Wang and Dick, Trends in Cell Biology 15, 2005 (b) Cancer stem cell model Tumor growth No tumor TOEHDSiiCrtB/Mcgy 1) Všechny bb nádoru mají nízkou pravděpodobnost extenzívní proliferace a v klonogenní assay se chovatjako nádorové kmenové bb -stochasticky model 2) Většina bb nádoru má jen omezenou možnost proliferace a nemůže se chovatjako kmenové bbf ale malá část bbje schopná extenzivně proliferovat a tvořit nádor - model nádorových kmenových bb PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Metastázování Podobné faktory regulují transport normálních kmenových bb při regeneraci tkání a metastázování nádorových bb 1 K* ť\ KV-* f\ *"\fr K*"\ Ixl" *"* K*^1* f *"\ Normal SC Gradient unemoatraKtanty a receptory __ 'ľV/ÍV HGF/SF I O 3 -;! UPREGULATED BTí Chronický zánět • ZA.* V SOF1 * ■ 6 ■ H /(>ni;i Radiace <&$*\ _^ ,:**f: LIF - Ti»ueřoiyin injury - nfl,ni,i1inr Poranění, poškození «5^ - RAdio/chen»4harapy tkáně »* Inkorporace v Cancer SC nesprávný čas na nesprávné místo Ratajczak, Folia Histochemica and Cytobiologica, 43, 2005 Jedním z vedlejších účinků radio- a chemoterapie je vytváření prostředí přitahujícího metastázující bb do určitých orgánů PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Terapie Růst nádoru - řízen minoritními bb odolnými vůči terapii (resistence k cytostatikům - ABC transportéry, exprese antiapoptotickych proteinů). Klí na = Komplikace terapie Drugs that kill tumour stem cells Tumour loses its ability to generate new ceils Drugs that kill tumour, ceils but notoancer stem ceils Tumour ^egěneratesy Klasická terapie zmenší nádor usmrcením bb s limitovaným proliferačním potenciálem, kmenové bb zůstanou a obnoví nádor!! ^^^^^^^^^^^^^^ !!! Terapie cílená na kmenové bb!!!! Tumour Sjírinks jpwš back Reya T, et al., Nature: 414, 2001 PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz !!! Vyšší stupeň diferenciace-nižší malignita !!! Pokusy s naočkováním bb teratokarcinomu do normálni myší blastocysty. Blastocysta nejen kontrolovala růst těchto nádorových bbf ale bb byly i začleněny do vyvyejícího se embrya - dospělá myš s normálně fungující tkání nádorového původu - chiméra. Samec Terry Tom takto vyvinuté myši měl potomky s genotypem nádorových bb. Injekce leukemických bb do placenty 10 denního myšího plodu -indukce hematopoetické maturace a výskyt normálních bílých krvinek nesoucích znaky leukemických bb I bb neuroblastomu a melanomu byly diferencovány v embryonálním prostředí PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Diferenciační terapie !!! Nádorové bb mohou zastavit proliferaci a diferencovat Terapeutická aplikace diferenciacnfch látek - RA (retinoid acid, Vitamin A) ATRA (all-trans-retinoic acid) - akutní promyelotická leukémie PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Leukémie - příklad malignity kmenových bb Haematopoietic stern cell Ď- ?S ^5 Lang ternu Short leim Multipotenl progenitor Loukaemlc mguse. madafa GMML MRPHtBCL-2 AML MRPS-BCL2Xfcr/lpr APML MRPR-Ph/.L RARiř CMUBIast MRPQ-QCRaWKQCL-a Reya T., et al., Nature: 414, 2001 CMP B Cells T cells NKgbI«5 Oendrilic cells -----------------*■ /pS w^r I A. JK GMP --------*li Granulocytes Mactiofihigej %Q^ Platelets 0*a Red oell& CLP - common lymphoid progenitors - prekurzory všech lymphoidních bb CMP - common myeloid progenitors - prekurzory všech myeloidních bb PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Leukémie - příklad malignity kmenových bb Hřímal ťiaefna.tíH>oieslíi, D Mature Calls ft Stein celu Progenitor Üligolineag* r eil precursors mr Cancer i* stem caAls ^ Csrtcsrin urogenital' ÍŠTĚT Ctll Pyogenic- (;eH ^ MrirurPüfif/ AML- nediferencované blasty -přežití měsíce CML - středně diferencované bb - přežití roky Chronická lymfocytární I. -dobře diferencované - přežití desetiletí Vzhledem k vysokému stupni sebeobnovováníjsou kmenové bb dobrým terčem leukemické transformace CML (chronická myeloidní leukémie) - první příklady genetických abnormalit spojených s rakovinou a potvrzení klonálního charakteru AML (akutní myeloidní leukémie) klonální choroba aberantní hematopoeza -akumulace funkčně nezralých blastů, které neumí normálně diferencovat PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Model iniciace a progrese leukémie Initial hit causes expansion oftransfomned stem cell pool. Subsequent mutations occur i n this expanded target pool Acquired genetic changes disrupt norma I developme ntal programs in downstream leukemic progenitors, leading to further expansion Self-renewing stem cell << Commitment and differentiation Restricted progenitors & Initial hit is retained but does not cause expansion of transformed stem cell pool m Additional transforming events in restricted progenitors lead to expansion. In order to generate LSCs, these mutations must react vate the cell's self-renewal machinery. tfflfc Leukemia Wang and Dick, Trends in Cell Biology 15, 2005 T»?ŕ^g j r Cf šľ'^>- Transformující mutace v kmenových bb - a) klonální expanze - terče pro další mutace - tyjsou přenášeny na progenitorové bb (leukemické kmenové bb = kmenové bb) b) Iniciační mutace nevede ke klonální expanzi, ale přetrvává i v dalších generacích, další mutace v progenitorovýh bb může vést k obnově self-renewal a tvorbě leukemických kmenových bb (leukemické kmenové bb = progenitorové bb). PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Proč je jednodušší transformace kmenových bb 1 a) U bb kde je aktivní self-renewal, je vysoká proliferační aktivita a tím i vyšší pravděpodobnost transformace b) U progenitorů musí nejdříve dojít k obnově self renewal a až další mutací k transformaci c) Pokud dojde k mutaci nevedoucí k self-renewal - bb odumře nebo diferencuje Loss of self-renewal potential Long-term ^populating stem cell Short-term Depopulating stem cells Restricted progenitors Functionally matu ne blood cells cm ,'' (e) ^ Initial transforming event in self-renewing stem cell Initial transforming event Reactivates stem cell self-renewal machinery Initial transforming event in non-renewing cell (qJ&P No expansion of pod of transformed progenitors c«§ Q- rt-«ff Long-term leukemia stem cells Short-term leukemia stem cells Leukemic progenitors fc *V Loss of transfonned cells through terminal differentiation «Sd Leukemia Aberrantly differentiated leukemic blast cells; phenotype depends on transforming events Tf&HOS>r.CríBvtegy Wang and Dick, Trends in Cell Biology 15, 2005 PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Důkazy existence kmenových nádorových bb Jen malá část populace nádorových bb je schopná extenzívní proliferace colony-forming assay - myší myelom -1 z 10000-100 bb byla schopná tvořit kolonie naočkování zdravé myši -1-4% bb tvořilo kolonie ve slezině Klonogenní leukemické bb = leukemické kmenové bb Jen 1 z 1000-5000 bb CA plic, ovaria nebo neuroblastomu tvořila kolonie V případech solidních nádorů bylo nalezeno malé množství diseminovaných nádorových bb u pacientů, kteří neměli metastázy - možná jim imunitní systém nedovolí se rozrůst nebo to potvrzuje domněnku, že jen některé (a to kmenové) bb jsou schopny expanze Transplantace nádorové kmenové bb - stejná historie vývoje nádoru i hierarchie bb, jako u původního nádoru. Hierarchie bb je podobná jako u vyvíjející se tkáně. Neúspěšnost léčby - vyšší resistence kmenových bb - vysoká exprese ABC transportérů a antiapoptotických proteinů PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz Teorie kmenových nádorových bb předpokládá: Rakovina je hierarchická nemocjejíž rozvoj je podporován populací vzácných kmenových bb Pro úspěšnou terapii nádorů je nutné zasáhnou nádorové kmenové bb. Proto je nutné stanovit a charakterizovat vlastnosti těchto bb Studium charakteristik kmenových bb může odhalit i vlastnosti bb nádorových PDF byl vytvořen zkušební verzí FinePrint pdfFactory http://www.fineprint.cz