MASARYKOVA UNIVERZITA MUSS478966 1 Posudek oponenta habilitační práce Masarykova univerzita Fakulta Obor m/i n i l . li.i/ti Pracov išli- uiha/cčť 11.ihilii.it m práce Oponent Pracoviště oponenta Lékařská Lékařská mikrobiologie Mgr. Martina Lengerová, Ph.D. Sekce oportunnich infekci CMBGT MOK FN Brno a LF MU , Včasná diagnostika oportunnich infekci pomoci molekulárně biologických metod lha. R \Dr. I ladimir Buchta, CSc. Ústav klinické mikrobiológie FN a LF UK Hradce Králové Test posudku Předložená hahilitaCni prace je vc formátu komentáre k publikovaným vedeckým pracím, které vyšly v rcccn/ovaných odborných períodicich (převážné s IF). Celkový ro/sah habilitaéni práce je 143 stran. / toho komentáre zaujímají 44 stran a přílohy 99 stran. Komentář je doplnén 5 tabulkami a 1 obrá/kem. seznamem 86 literárních citaci a kompletní bibliografií uchazečky Pfilohy tvoří 7 odborných, originálních sdéleni v časopisech s IF. 4 sdělení v recenzovaných (Českých) časopisech, doplněné 2 patenty. Téma habilitační práce, molekulárné-biologická diagnostika oportunnich infekci, je vysoce aktuální, protože moderní medicínské postupy vyznačující se nezřídka agresivním působením na imunitu hostitele se stávají běžným standardem a jsou aplikovány na stále rostoucí populaci rizikových pacientu, kteří potom v důsledku základního onemocněni anebo léčby procházejí kritickým obdobím s výrazně oslabenou obranyschopnosti, což vytváří vhodné podmínky pro širší uplatněni oportunnich infekčních agens. Bohužel infekční komplikace spojené s touto rizikovou skupinou pacientu podstatné přispívají k jejich morbiditě a mortalitě. Zkušenosti ukazuji, že terapeutický management těchto infekcí je extrémně závislý na včasné a přesné diagnostice, která zásadním způsobem rozhoduje o přežiti těchto pacientů, a tedy i úspěchu léčby základního onemocněni. A právě na tuto oblast diagnostik) se zaměřilo lišili uchazečky. Originální sděleni uchazečky ukazují na systematickou práci zaměřenou na metodiku detekce a identifikace oportunnich patogenů. od návrhu metody, jejího vypracováni, zavedeni do praxe resp ověřeni klinické použitelnosti, až po patentovou ochranu nově vypracovaných postupů. Práce je zaměřena na původce invazivnich houbových infekci, zejména aspcrgilózu a mukormykozu. dále na virové infekce ze skupiny herpesvini Metodicky bylo ušili směrováno do vývoje metod, které by byly dostatečně citlivé a zároveň specifické, tj. byly schopné detekoval a identifikovat v relevantních klinických vzorcích hlavni původce aspergilózy a mukormykózy. V případě aspergilózy \ rámci tvůrčího týmu vypracovala kvantitativní real-timc PC R pro stanoveni aspergilové ribozomálni DNA (gen ľľS2 u A.spergillm fitniixiiitiy I fluvus I terreus. i niger) v BAL tekutině s ohledem na v České republice nej frekventovanější druhy a hlavně na možnost rozlišeni kolonizace od patologické nálože. To je pro klinickou rozvahu velmi cenné, protože samotný nález mykotického agens nemusí nutné znamenat houbovou infekci, resp. v případě druhové identifikace, citlivost jednotlivých druhů aspergilů se muže významně lišit jak k mozolovým derivátům, lak k pobertovým antimykotikům. To. že uchazečka. potažmo tym. dokážou věci 1 MASARYKOVA UNIVERZITA dotáhnout do konto, je dokladováno overením nového testu na morčecim modelu, navie \e spolupráci na prestižním americkém pracovišti, které potvrdilo klinickou užitečnost výsledku u rutinné používaných biologických vzorku (BAL tekutina, hioptické vvorky) s ohledem na přesnost a detekci časné fá/c infekce. Originálni řešeni bylo /voleno při vývoji metody detekce původců mukormykó/v. která kombinuje klasickou PCR metodu, ve které původné časové i finančné náročná sekvenace byla nahrazena analýzou křivek táni s vysokým rozlišením (HRM). Metoda byla validována pro vzorky tkáni u BAL tekutinu tak. že umožnila stanovil kvantitativní nálož DNA mukormycet ve vzorcích, a tím zvýšit možnost odlišeni aktivní infekce od kolonizace resp. kontaminace vzorku. Nabyté zkušenosti s vývojem molekulárních metod vy užívající HRM analýzu vedly k vypracováni na křivkách tání odvozené panfungálni PCR metody, která umožnila rozšířeni zábéru zachytit méné obvyklé opomním zástupce hub (Fusariiim. Six-dnsporium). přitom podstatné urychlila cely proces identifikace (2 hod). Druhou skupinou infekčních agens. na kterou se uchazečka zamérila. byly herpetické viry. které u hcmaloonkologických pacientu patri k vůdčí ctiologii virových infekci. Diagnostika téchto infekci je o to složitější, že většina téchto viru je latentné přítomna \ populaci a jednotlivé metodiky nemusí vždy poskytovat spolehlivé výsledky, zejména pokud jde o stanoveni velikosti virové nálože, která rozlisuje počínající nebo již přítomnou infekci. I xhazečka prokázala, že při volbé cílového genu l'LI23]c nutné vžit v úvahu přirozenou variabilitu cy tomegaloviru. která muže mít za následek, že část vzorků bude vykazovat falešné negativní vvslcdkv reakce. Podobné důsledky variability genomu siru se moli.m negativně projevit při léébé antiviroliky v případe mutace genů UL54 a VI.9". která vede u CMV k rezistenci na ganciklovir. Autorský kolektiv uchazečky analyzoval pomocí tři metod PCR kmeny CMV u pacientů poalogenni transplantaci hematopoetickych kmenových buněk l HSC 11 a prokázal, že pacienti jsou osídleni heterogenní populací, ve které se měni zastoupeni citlivých a rezistentních klonů CMV. 7árovcň prokázali, že selektivní tlak aniivirotika muže proporci téchto kmenů ovlivňovat a jakmile pomine, rezistentní klon může být nahrazen klonem citlivým. To. pokud by se overilo na vétsim souboru pacientů, by melo prakticky dopad na léčbu CMV infekcí. Rovnéž studium viru I pstein-Barrové (I BV) poskytlo klinicky cenne informace I kázalo, že se v prubéhu sledované periody (2007-2011) EBV infekce významné podílely (9%) na infekčních komplikacích HSCT pacientů ve FN Brno zejména v prvních 3 mésicich po transplantaci a zároveň byla stanovena virová nálož (1000 kopií na ug DNA) pro zahájeni antivirové terapie. / předložených výsledku práce je zřejmé, že uchazečka prokázala, nejen schopnost systematické práce při navrhováni, realizaci a ověřováni metod molekulárne biologické diagnostiky, ale že je si plně vědoma nejen přednosti, ale i limitu a úskalí tohoto přístupu, tedy předpokladů, které umožni postihnout diagnostiku oportunnich infekci vysoce rizikových pacientů v celé její sítí a snižují tak riziko zjednodušujících závěrů a interpretaci. Přitom takové metody musí být relativně dostupné a přiměřené nákladové efektivní. Po formální stránce je text komentárů vécný. srozumitelný, prakticky bez překlepů, vytknout lze umístěni nadpisu tabulek (u tabulky 3 na str. 17 navíc chybí nadpis úplné, místo něho jsou vysvetlivky: kromě toho metodu Kultivace bych nahradil, v případě viru. presnejším Nepřímá kultivace), absence kurzívy při psaní genů. neúplné psaní diabetes mellitus (str. 11 a 14). ../dvojeni" ve smyslu druhú na str. 13. 13. řádek („sp." je u Aspergillus nadbytečné, vzhledem k uvozeni „několika druhů"), podobný problém na str. 15. 3. odsl.. kde v závorce bud" ponechat samotný l\/H-rf;illu.s Imíněn rod) nebo spp (míněno více Jrulnii. na sir 1 7. 2.