1
MASARYKOVA UNIVERZITA
Lékařská fakulta
Neurologická klinika, Fakultní nemocnice Brno
HABILITAČNÍ PRÁCE
Úloha genetické predispozice
a vybraných biomarkerů v imunopatogenezi
roztroušené sklerózy
MUDr. Yvonne Benešová, Ph.D.
Brno 2018
2
Práce byla vypracována na Neurologické klinice Lékařské fakulty Masarykovy
univerzity Brno a Fakultní nemocnice Brno.
Prohlašuji, že jsem habilitační práci vypracovala samostatně s využitím zdrojů
uvedených v soupisu literatury.
MUDr. Yvonne Benešová, Ph.D.
Neurologická klinika LF MU a FN Brno
…………………………………………
podpis autora
3
Obsah
Prohlášení autora
Poděkování
I Přehled problematiky ........................................................................................................... 6
1 Úvod ....................................................................................................................................... 6
2 Definice roztroušené sklerózy ............................................................................................. 8
3 Epidemiologie roztroušené sklerózy ....................................................................................9
3.1 Geografický gradient ........................................................................................................ 9
3.2 Vliv etnika na riziko rozvoje roztroušené sklerózy .......................................................10
3.3 Vliv pohlaví na riziko rozvoje roztroušené sklerózy .................................................... 11
3.4 Vliv migrace na riziko rozvoje roztroušené sklerózy .................................................. 12
4 Etiopatogeneze roztroušené sklerózy ............................................................................... 14
4.1 Environmentální faktory ................................................................................................ 14
4.1.1 Virové infekce ................................................................................................................ 14
4.1.2 Sluneční záření a nedostatek vitamínu D3 ..................................................................... 18
4.1.3 Stres ................................................................................................................................ 25
4.1.4 Vliv výživy, sociální a kulturní faktory.......................................................................... 26
4.2 Genetické faktory ............................................................................................................ 28
4.2.1 Hlavní histokompatibilní komplex (MHC) .................................................................... 30
4.2.2 Asociace HLA s roztroušenou sklerózou ....................................................................... 35
4.2.3 Molekulární mimikry u roztroušené sklerózy ................................................................ 38
4.2.4 Terapie založená na ovlivnění HLA .............................................................................. 39
4.2.5 Souhrn ............................................................................................................................ 39
4.2.6 Funkční studie a epigenetické faktory u roztroušené sklerózy…................................... 39
4.3 Závěr ................................................................................................................................ 42
5 Patofyziologie roztroušené sklerózy ................................................................................. 43
6 Matrix metalloproteinázy ...................................................................................................46
6.1 Definice ............................................................................................................................. 46
6.2 Rozdělení MMPs ..............................................................................................................46
6.2.1 Matrix metalloproteináza - 9 a matrix metalloproteináza-2 ........................................... 46
6.3 Struktura genů pro MMPs ............................................................................................. 48
4
6.4 MMPs u roztroušené sklerózy ....................................................................................... 49
7 Klinická manifestace roztroušené sklerózy ..................................................................... 51
8 Diagnostická kritéria roztroušené sklerózy ..................................................................... 55
II Výzkumné práce…............................................................................................................. 57
1 Cíle projektů ....................................................................................................................... 57
1.1 Genetická studie .............................................................................................................. 57
1.2 Studie hladin enzymů ...................................................................................................... 57
1.3 Hypotéza........................................................................................................................... 58
2 Materiál a metodika ........................................................................................................... 61
2.1 Genetická studie .............................................................................................................. 61
2.1.1 Soubor ............................................................................................................................ 61
2.1.2 Genetická analýza .......................................................................................................... 61
2.2 Studie hladin enzymů ...................................................................................................... 65
2.2.1 Soubor ............................................................................................................................ 65
2.2.2 Stanovení hladin enzymů ............................................................................................... 65
3 Komentovaný soubor vlastních prací................................................................................ 66
4 Závěry ............................................................................................................................... 109
4.1 Genetické studie .............................................................................................................109
4.2 Studie hladin metalloproteináz a jejich inhibitorů .....................................................110
5 Diskuse............................................................................................................................... 110
6 Souhrn ............................................................................................................................... 117
7 Seznam použitých zkratek................................................................................................ 118
8 Seznam použité literatury….............................................................................................121
5
Poděkování
Chtěla bych tímto poděkovat paní prof. MUDr. Anně Vašků, CSc., za možnost
realizace projektu na Ústavu patologické fyziologie LF MU, odborné konzultace, cenné rady
a pomoc při hodnocení získaných výsledků. Děkuji také přednostovi Neurologické kliniky FN
Brno, prof. MUDr. Josefu Bednaříkovi, CSc., který mi umožnil habilitační práci vypracovat a
za jeho podporu vzdělávání a vědecké činnosti na našem pracovišti. Dále bych chtěla bych
tímto poděkovat prof. MUDr. Zdeňku Kadaňkovi, CSc., který byl mým školitelem v rámci
postgraduálního studia a prof. MUDr. Jiřímu Litzmanovi, CSc. za cenné rady v průběhu
postgraduálního studia.
Rovněž bych chtěla poděkovat všem svým kolegům a spolupracovníkům, kteří se
podíleli na realizaci projektů. Laborantkám, zejména paní Svatavě Tschöplové za
genotypizaci vzorků na Ústavu patologické fyziologie LF MU, RNDr. Haně Novotné a
laborantkám, které prováděly stanovení hladin metalloproteináz na Oddělení klinické
hematologie a biochemie FN Brno, doc. MUDr. Pavlu Štouračovi, Ph.D. a MUDr. Magdaléně
Hladíkové, Ph.D. za spolupráci. Poděkování patří také sestrám na neurologické ambulanci FN
Brno. Dík patří také všem pacientům a zdravým dobrovolníkům, kteří se výzkumu zúčastnili.
V neposlední řadě děkuji také za podporu Interní grantové agentuře Ministerstva
zdravotnictví IGA MZ ČR č. NR 8832-4/2006: „Matrix metalloproteinázy v imunopatogenezi
roztroušené sklerózy. “
6
I. Přehled problematiky
1 Úvod
Roztroušená skleróza mozkomíšní (RS) je chronické, zánětlivé, autoimunitní,
demyelinizační onemocnění centrálního nervového systému (CNS). Odhaduje se, že postihuje
více než 2.5 milionu lidí na světě, navíc jeho incidence a prevalence v posledních letech stále
narůstá. (Hartung et al., 2004; Marie RA, 2013; http://www.atlasofms.org). Patří mezi
nejčastější neurologická onemocnění, které vede k závažnému postižení mladých lidí ve věku
od dvaceti do čtyřiceti let. Tato nemoc může významně zhoršit kvalitu života nemocných
(Berrigan et al., 2016; Giordano et al., 2012; Hadgkiss et al., 2013; Lobentanz et al., 2004) a
má významný socioekonomický dopad (Cadden et al., 2015).
Etiopatogeneze RS není dosud zcela uspokojivě objasněna, předpokládá se vliv
genetických, enviromentálních a epigenetických faktorů (Hartung et al., 2004; Brutting et al.,
2016). Genetická predispozice k rozvoji choroby je podložena mnoha genetickými a
epidemiologickými studiemi (Bashinskaya et al., 2015; Hafler et al., 2007; Sawcer et al.,
2015). Nejvyšší vnímavost k rozvoji onemocnění byla zjištěna u severoevropanů, zejména
skandinávské populace (Compston et al., 1997; Oksenberg et al., 2013), naopak orientální
rasa má až desetkrát nižší vnímavost k rozvoji choroby ve srovnání s rasou indoevropskou
(Christiano et al., 2013; Langer-Gould et al., 2013; Langer-Gould et al., 2014; Makhani et
al., 2014). Také familiární výskyt nemoci vliv dědičnosti potvrzuje. Bylo prokázáno zvýšené
riziko postižení u příbuzných nemocného, zejména u jednovaječných dvojčat, u kterých se
pohybuje v rozmezí od 24 % do 40 % a 3-5 % u dvouvaječných dvojčat (Cree B, 2008; Willer
et al. 2003; Ristori et al., 2006).
Jedná se o komplexní onemocnění s polygenní dědičností, neboť na spuštění
autoimunitního procesu se pravděpodobně podílí velké množství vysoce polymorfních genů.
Tyto geny se u daného jedince vyskytují ve vazbách a různých kombinacích, což podmiňuje
výraznou interindividuální variabilitu choroby (Ebers 1995; Bashinskaya et al., 2015). Velmi
důležitou, avšak značně proměnnou komponentou, která zřejmě podmiňuje rozvoj i další
průběh vlastního onemocnění, jsou zevní vlivy (Burrell et al., 2011; Correale et al., 2015;
Handunnetthi et al., 2010; Steelman AJ, 2015) a faktory epigenetické (Akkad et al., 2015; Wu
et al., 2016).
7
Dosud však nebyly nalezeny dostatečně spolehlivé genetické markery, které by
umožnily zjistit míru individuálního rizika rozvoje RS, diagnostické a prediktivní markery
dalšího průběhu onemocnění ani odpovídavosti daného jedince na specifickou léčbu.
Biomarkery měřitelné v periferní krvi, poskytující informace o patofyziologickém procesu,
aktivitě, tíži a prognóze onemocnění.
Slibnými kandidáty jsou geny a jejich varianty, tzv. polymorfismy, které
ovlivňují komplexní patogenetický process. Jedná se o geny pro lidské leukocytární antigeny
(HLA), které hrají klíčovou roli ve zpracování antigenů myelinu, jejich prezentaci Tlymfocytům
a iniciaci autoimunitního procesu (Lincoln et al., 2005; Sadovnic 2012; Schmidt
et al., 2007). Dalším velmi významným faktorem, podmiňujícím rozvoj a progresi
onemocnění je porušení hemato-encefalické bariéry (HEB), umožňující přestup zánětlivých
buněk do CNS. Důležitou úlohu v tomto procesu mají geny pro matrix metalloproteinázy
(MMPs) (Goodin et al., 2002; Mirshafiey et al., 2014; Shimizu et al., 2014; Waubant et al.,
2003). a angiotensinogen (Wosik et al., 2007). Na progresi vlastního zánětlivého postižení a
aktivaci infiltrujících imunokompetetních buněk se podstatně podílí geny kódující
prozánětlivé cytokiny (Gregory et al., 2007; Mkjikian et al., 2011; Jäger et al., 2013). Velmi
důležitou roli hraje též variabilita vitaminu D, který je významným environmentálním
faktorem. Navozuje silné antiproliferativní, prodiferenciační a imunomodulační účinky
(Munger et al., 2006; Munger et al., 2014; Simon et al., 2012).
Cílem předkládané práce je nalézt genetické polymorfismy, které se podílí na
zvýšené vnímavosti k RS v české populaci, vyhodnotit jejich vliv na progresi choroby a zjistit
případné rozdíly mezi pohlavími, neboť RS jako všechna ostatní autoimunitní onemocnění se
častěji vyskytuje u žen. Nalézt vhodné biomarkery jednoduše měřitelné v séru a zhodnotit
vztah jejich hladin ke klinickému průběhu, tíži onemocnění a stupni postižení.
Očekáváme, že práce by mohla přispět ke zjištění individuální genetické
predispozice k rozvoji, další progresi onemocnění a odpovídavosti na cílenou terapii. Mohli
bychom získat laboratorní markery, které by byly použitelné v klinické praxi, umožňující
monitorovat průběh onemocnění a sledovat efekt léčby.
Rozšíření současných znalostí imunopatogenetických mechanismů RS může
významně napomoci k vývoji nové, specifické, účinné farmakoterapie a zlepšit prognózu
tohoto závažného onemocnění.
8
2 Definice roztroušené sklerózy
Roztroušená skleróza mozkomíšní (RS) je chronické, zánětlivé, autoimunitní,
demyelinizační onemocnění centrálního nervového systému (CNS), postihující mozek, míchu
a optické nervy. Dochází k poškození a ztrátě myelinu v zánětlivých ložiscích bílé hmoty
CNS a současně již od počátku vede k axonální ztrátě (Zoukos, 2004; Hartung et al., 2004).
Poprvé byla popsána jako samostatná choroba již v roce 1868 francouzským neurologem
Jean-Martin Charcotem (1825–1893). Po shrnutí dřívějších nálezů, vlastních klinických
pozorování a patologických studií Charcot nemoc nazval sclérose en plagues. Před
Charcotem popsal mnoho klinických detailů choroby britský profesor patologie Robert
Carswell (1793–1857) a francouzský profesor anatomické patologie Jean Cruveilhier (1791–
1873). Typickou známkou RS je opakující se demyelinizace CNS, diseminovaná v prostoru
a čase. Rozvíjí se zpravidla mezi 20. - 40. rokem života, zřídka se onemocnění klinicky
manifestuje již v dětství nebo po 60. roce věku. Jedná se o onemocnění společensky
a zdravotnicky velmi závažné, neboť patří mezi nejčastější příčiny chronické invalidity
mladých lidí.
Obr. 1 Jean-Martin Charcot (1825-1893)
Zdroj: The International MS Journal 2008; 15: 59-61.
9
3 Epidemiologie roztroušené sklerózy
3.1 Geografický gradient
Odhaduje se, že RS postihuje více než 2,5 miliónu lidí na světě, navíc jeho incidence
a prevalence v posledních letech stále mírně stoupá (Obr. 2, 3).
Byla provedena řada studií, které prokazují, že prevalence onemocnění se zvyšuje se
vzdáleností od rovníku. Proto hovoříme o geografickém gradientu (Obr. 2, 3).
Nejvíce se vyskytuje na severu Spojených států amerických (USA), v Kanadě
a severní Evropě, kde činí prevalence až 300/100 tis. obyvatel. Na jihu USA a v jižní Evropě
činí okolo 80/100 tis., v Austrálii 90/100 tis. a na Středním východě 4–39/100 tis. obyvatel
(Vachová, 2012). Mezi oblasti nízkého rizika s prevalencí do 20/100 tis. obyvatel řadíme
Latinskou Ameriku, nejnižší riziko s prevalencí 5/100 tis. pak vidíme v Asii a Africe (Obr. 2,
3). Prevalence v České republice je vysoká, činí přibližně 150/100 tis. obyvatel (Havrdová,
2002). Pravidlo o stoupající prevalenci se zvyšující se zeměpisnou šířkou však neplatí
absolutně, neboť prevalence na Sicílii činí 53/100 tis. obyvatel.
Rozložení RS popsal poprvé již v roce 1921 Charles Davenport v USA (Davenport
CB, 1921). Zjistil, že se onemocnění více vyskytuje v severních státech, zejména
v oblasti Great Lakes. Novější data v souladu s těmito staršími nálezy potvrzují vzrůstající
prevalenci RS jiho-severním gradientem v rozmezí od 22/100 tis. do 106/100 tis. obyvatel
(Compston A and Confavreux C, 2006). Interpretace těchto nálezů je však problematická
vzhledem k vlnám imigrace do USA, neboť musíme vzít v úvahu rasovou distribuci a vliv
etnického pozadí na prevalenci RS v určité geografické oblasti.
Naopak v Austrálii je možné zkoumat geneticky relativně homogenní populaci, kterou
tvořili až do konce 20. století přistěhovalci z Anglie (Compston A and Confavreux C, 2006).
Byly zde také prokázány významné geografické rozdíly s vyšší prevalencí na jihu
a v Tasmánii ve srovnání se severní Austrálií. Výsledky však mohou být částečně ovlivněny
koncentrací obyvatelstva ve městech. Tato data jsou v souladu s předchozími nálezy, že
prevalence RS vzrůstá s narůstající zeměpisnou šířkou, a to na severní i jižní polokouli
zrcadlově. Protože je australské obyvatelstvo geneticky homogenní, potvrzují tyto nálezy
významný vliv environmentálních faktorů vázaných pravděpodobně na geografickou oblast
a klimatické vlivy.
Analogická asociace mezi RS a geografickým gradientem byla prokázána v severní
Evropě. V norské studii však k nárůstu prevalence nemoci se vzrůstající zeměpisnou šířkou
10
nedošlo, což ukazuje na možný vliv protektivního environmentálního faktoru (Compston A
and Confavreux C, 2006).
Nejnovější a nejlépe doložitelná studie byla zpracována ve Francii. Data byla získaná
z databáze národního zdravotního pojištění zemědělců (Mutualité Sociale Agricole), která
zahrnovala informace čtyř miliónů francouzských rolníků a jejich rodin (Vukusic et al., 2007).
Tato populace je relativně stálá a málo migrující mezi regiony. V roce 2003 bylo do této
databáze zařazeno 4 098 477 lidí, z nichž u 2 667 byla diagnostikována RS. Nemoc byla
registrována již v době diagnózy. Byla nalezena prevalence 63/100 tis. obyvatel, přičemž
v severovýchodní oblasti byla signifikantně vyšší (100/100 tis. obyvatel) ve srovnání
s oblastí jihozápadní (50/100 tis.). Vyšší riziko rozvoje RS je tedy asociováno s narůstající
zeměpisnou šířkou.
3.2 Vliv etnika na riziko rozvoje roztroušené sklerózy
Frekvence výskytu nemoci se liší u jednotlivých etnik, nejvyšší vnímavost má
indoevropská rasa, černá rasa poloviční a orientální nejnižší. Z epidemiologických studií je
zřejmá vysoká vnímavost k onemocnění zejména u skandinávské populace, zvýšené riziko
nalézáme také u dalších severoevropanů. Irské nálezy z Orknejí a Shetlandů potvrzují vyšší
prevalenci RS u nordických potomků ve srovnání s keltskými. V USA byla vyšší prevalence
RS zjištěna u původních skandinávských přistěhovalců v okolí oblasti Great Lakes.
Obr. 2 Prevalence RS ve světě v roce 2008.
Zdroj: World Health Organisation. Multiple sclerosis International Federation [on-line]. Atlas Multiple sclerosis
resources in the world 2008. Dostupné z WWW: <http://www.atlasofms.org/>.
11
Obr. 3 Prevalence RS ve světě v roce 2013.
Zdroj: World Health Organisation. Multiple sclerosis International Federation [on-line]. Atlas Multiple sclerosis
resources in the world 2013. Dostupné z WWW: <http://www.atlasofms.org/>.
3.3 Vliv pohlaví na riziko rozvoje roztroušené sklerózy
RS postihuje častěji ženy, ve srovnání s muži v rozmezí od 1,5–2,5× a tento nepoměr
se v posledních letech dále zvyšuje (Orton et al., 2006). Častější postižení žen je prokázáno
také u jiných autoimunitních chorob, např. systémový lupus erythematodes se u žen vyskytuje
dokonce až v poměru 9:1.
Faktory, které přispívají ke zvýšené predispozici žen k rozvoji RS a ostatním
autoimunitním onemocněním ve srovnání s muži, nejsou jednoznačně objasněny. Vzhledem
k tomu, že nejčastěji dochází k rozvoji autoimunitních onemocnění v období časné dospělosti,
která souvisí s hormonálními změnami, předpokládá se vliv pohlavních chromozomů a rovněž
i vliv hormonální. Pohlavní hormony ovlivňují imunitní systém, HEB a parenchymální buňky
CNS, modulují také expresi mnoha genů, včetně genů kódujících cytokiny (Nicot A, 2009).
Estrogeny prostřednictvím intranukleárních estrogenních receptorů ovlivňují tzv. E2
senzitivní geny. V experimentální studii autoimunitní encefalomyelitidy (EAE) bylo
prokázáno ovlivnění exprese TNFα, cytotoxického T lymfocytárního antigenu-4, TGFβ, IL-
18, IFNγ, chemokinů, adhezivních molekul a metalloproteináz estradiolem (Matejuk et al.,
2002). Estrogeny zvyšují také expresi genů, které ovlivňují aktivitu T-regulačních buněk
(Offner H, 2004).
12
Je pravděpodobné, že u mužů se na spuštění autoimunitního procesu podílí větší počet
účinnějších rizikových genů a mají pravděpodobně vyšší riziko přenosu onemocnění na své
potomky. Tento fenomén je známý jako tzv. Carterův efekt (Kantarci et al., 2006).
Na základě provedených studií byly zjištěny rozdíly v imunitních reakcích mezi muži
a ženami (Whitacre et al., 1999). Ženy mají tendenci k Th-l typu imunitní odpovědi, pouze
v těhotenství dochází k posunu ve prospěch Th-2. U mužů převažuje Th-2 typ imunitní
odpovědi. Důležitou roli v tomto procesu hrají pravděpodobně pohlavní hormony, které mají
pleiotropní efekt (Ebers, 1998). Závisí na jejich koncentraci, zejména u estrogenů, konverzi
na jiné metabolity a interakcích s vnitřním prostředím na mnoha úrovních. Pohlavní hormony
ovlivňují vývoj, proliferaci, apoptózu a aktivaci lymfohematopoetických buněk, produkci
cytokinů a protilátek. Vlivem komplexních interakcí mezi pohlavními hormony a imunitním
systémem dochází ke zvýšení nebo útlumu autoimunitní patologické reakce (Nicot A, 2009).
Do roku 1970 byla prevalence onemocnění u žen zhruba dvojnásobná ve srovnání
s muži, avšak v posledních desetiletích dochází k dalšímu posunu tohoto nepoměru. Data
kanadské studie čerpané z databáze Canadian Collaborative Project on Genetic Susceptibility
to Multiple Sclerosis (CCPGSM) prokazují, že v současné době v souboru 27 074 kanadských
pacientů vzrostl nepoměr žen ve srovnání s muži až na 3.2:1 (Willer et al., 2003). Příčina
dosud zjištěna nebyla, avšak je pravděpodobné, že se na tomto posunu podílí spíše zevní
faktory než genetická predispozice. Uvažuje se o možném vlivu hormonální antikoncepce,
kouření (Orton et al., 2006) či mikrochimérismu. Tento jev je podmíněn přenosem cizích
buněk z těla plodu do mateřského organismu v průběhu těhotenství a naopak. K výměně
buněk v děloze dochází také mezi dvojčaty. Tato asociace s RS byla pozorována
u monozygotních i dizygotních dvojčat ženského pohlaví. (Willer et al., 2006).
3.4 Vliv migrace na riziko rozvoje roztroušené sklerózy
Byla provedena také řada klinických studií zaměřených na ovlivnění vnímavosti k RS
migrací mezi různými geografickými oblastmi. Poprvé se touto otázkou ve 40. letech
devatenáctého století zabýval Geofferey Dean a jeho spolupracovníci, kteří studovali vliv
migrace z oblasti s vyšším rizikem onemocnění do regionu s nižším rizikem v Jižní Africe
(Dean G, 1967). Prevalence v této oblasti je extrémně nízká, činila méně než 5/100 tis.
ve smíšené populaci. V anglicky mluvící bělošské populaci přistěhovalců činila 15/100 tis.
ve skupině nemocných, kteří imigrovali v dětství a 60/100 tis. u těch, kteří se přistěhovali do
13
Jižní Afriky v dospělosti. Tyto výsledky ukázaly, že prevalence závisí nejen na etniku, ale
také na věku imigrace do Jižní Afriky. Také studie na Martiniku a Guadeloupe tento vliv
migrace potvrzuje (Cabre et al., 2005). Prevalence onemocnění je v této oblasti velmi nízká,
činí asi 20/100 tis. u původních obyvatel. V populaci přistěhovalců do Francie se prevalence
zvýšila na 40/100 tis. a u imigrantů, kteří se přistěhovali před 15 rokem věku činí dokonce až
140/100 tis. Také ostatní studie dospěly k obdobným závěrům a prokazují vliv migrace
v geneticky rozdílných populacích.
Ačkoli je prevalence RS velmi variabilní, byly nalezeny také tzv. klastry nemocných
ve velmi ohraničené geografické oblasti. Nejznámějším příkladem je výskyt onemocnění na
Faerských ostrovech, které se nachází mezi Norskem a Islandem v severním Atlantickém
oceánu. Vzhledem k jejich umístění na severu lze předpokládat vysokou prevalenci RS, avšak
do roku 1943 zde nebyl popsán žádný případ onemocnění. V roce 1943 studoval tuto oblast
Kurtzke a popsal několik vln epidemií, jež začaly v roce 1943 (Kurtzke et al., 2001). Jejich
příčina není objasněna, předpokládá se, že by mohly být způsobeny infekcí přenesenou
britskými vojáky, kteří ostrovy v průběhu II. světové války okupovali. Nabízí se však řada
otázek, jež věrohodnost těchto údajů zpochybňují. Není jasné, jestli se RS skutečně v této
oblasti před rokem 1943 nevyskytovala, neboť v oblasti nebyli přítomni dánští neurologové.
Také spekulace, že ostrovy byly izolovány od okolí, není opodstatněná. Obyvatelé Faerských
ostrovů se živili hlavně rybolovem a byli v kontaktu s ostatními komunitami v oblasti
Severního atlantického oceánu. Další klastry RS sice popsány byly, ale jejich věrohodnost
není potvrzena.
14
4 Etiopatogeneze roztroušené sklerózy
Etiopatogeneze RS není dosud zcela uspokojivě objasněna. Předpokládá se, že u
geneticky predisponovaného jedince je onemocnění spuštěno vlivem vnějších faktorů,
důležitou roli hrají efekty epigenetické a stochastické (Akkad et al., 2015; Ebers, 1995; Ebers,
2007; Sadovnic et al., 2012; Wu et al., 2016).
4.1 Environmentální faktory
Prevalenci RS mohou ovlivnit výše uvedené migrační faktory, geografická distribuce
a environmentální faktory, které se uplatňují pravděpodobně zejména v průběhu dětství nebo
časné adolescence. Mezi nejvýznamnější zevní faktory řadíme:
• Virové infekce.
• Sluneční záření a nedostatek vitamínu D3.
• Stres.
• Sociální a kulturní faktory.
4.1.1 Virové infekce
Za nejdůležitější jsou považovány virové infekce, které často předcházejí rozvoji nebo
další atace nemoci. Hypotéza, že infekční agens spustí onemocnění u disponovaných jedinců,
je jednou z nejstarších teorií, kterou popsala již v roce 1884 Pierre Marie. Opírá se
o imunopatologické nálezy z mozku, krve a mozkomíšního moku, které jsou pro RS proces
charakteristické. Nálezy zvýšených titrů protivirových protilátek prokazují, že infekční agens
může onemocnění navodit. Zásadní slabinou této teorie je však skutečnost, že dosud nebylo
nalezeno žádné příčinné infekční agens v CNS nemocných. Infekce může tedy spustit
onemocnění, ale při vzniku prvních symptomů již není v CNS přítomna. Je také možné, že
infekční agens dosud nebylo nalezeno, nebo že se na spuštění RS u vnímavých jedinců může
podílet více infekcí současně. Vzájemnou interakcí dvou či více faktorů mohou být navozeny
patofyziologické procesy, které následně vedou k rozvoji nemoci (Tab. 1).
Mezi potenciální mikroorganismy, které se podílejí na riziku rozvoje RS, řadíme také
retroviry (Nexø et al., 2015) a paramyxoviry. Paramyxoviry jsou obalené živočišné viry, které
obsahují jednovláknovou ribonukleovou kyselinu (RNA). Patří k nim viry vyvolávající
spalničky, zarděnky nebo infekci virem Epsteina-Barrové (EBV). Infekce virem spalniček
nebo virem EBV může vyvolat akutní diseminovanou encefalomyelitidu, způsobit
15
demyelinizaci a poškození nervů (Ebers, 1998). Tato teorie je podporována též pozitivitou
tzv. MRZ (M-morbilli, R-rubella, Z-varicella zoster) reakce v nálezech mozkomíšního moku.
Jedná se o syntézu specifických antivirových protilátek proti neurotropním virům spalniček,
zarděnek a neštovic.
Tyto viry se však v populaci vyskytují běžně, v aktivaci choroby virovými infekcemi
se tedy pravděpodobně uplatňuje několik mechanismů (Ebers, 1998).
Tab. 1 Infekční etiologie RS - možné kandidátní mikroorganismy
Chlamydia pneumoniae
Herpetické viry
Human herpesvirus type 6 (HHV-6)
Herpes simplex virus (HSV)
Cytomegalovirus (CMV)
Epstein-Barr virus (EBV), HHV-4
Varicela zoster virus (VZV)
Canine distemper virus
Measles virus
Mumps virus
Rubella virus
Human T-cell leukaemia virus type 1 (HTLV-1)
Human endogenous retrovirus (HERV)
Corona virus
Bordetella pertussis
Papovaviruses
16
Byly popsány tyto hypotézy:
• Aktivace superantigenem, kterým mohou virové a bakteriální produkty navodit
aktivaci T-lymfocytů.
• Zkřížená reaktivita mezi infekčním antigenem a vlastní tkání-hypotéza molekulárních
mimiker. Byla nalezena zkřížená reaktivita mezi fragmenty viru hepatitis B,
chřipkových antigenů a myelinovým bazickým proteinem (MBP), dále antigenů EBV
a proteolipoproteinem (PLP).
• Latentní infekce stimuluje imunitní odpověď, která navodí zkříženou reaktivituhypotéza
perzistentní infekce molekulárních mimiker.
• Latentní infekce oligodendrocytů vede k lokálnímu zánětu v CNS bez potřeby
lymfocytární infiltrace nebo fagocytózy myelinu - přímá infekční hypotéza.
• Infekce způsobí dysregulaci imunitního systému, který vede k orgánově specifickému
autoimunitnímu onemocnění. Hypotéza imunitní deregulace.
• Aktivace T-lymfocytů vlastními antigeny, vzniklými zánětlivým procesem nebo
štěpením, které nejsou za normálních okolností vystaveny imunitní kontrole – tzv.
bystander aktivaci. Bylo prokázáno, že alfa B-crystallin, který vzniká štěpením
myelinu a není za normálních okolností dostupný rozpoznání imunitnímu systému,
navozuje výraznou aktivaci T-lymfocytů.
• Infekce mohou mít i protektivní vliv, např. expozice v dětství může chránit jedince
proti rozvoji nemoci v pozdějším životě, což je základem hygienické hypotézy.
Virus Epsteina-Barrové a riziko rozvoje roztroušené sklerózy
Jedná se o neurotropní virus, který se reaktivuje stresem. Vyskytuje se s vysokou
prevalencí v běžné populaci. Byla provedena řada studií prokazující možný vliv EBV
v etiologii RS (Ascherio et al., 2000; Lang et al., 2002; Levin et al., 2003; Levin et al., 2005;
Levin et al., 2010; Sundstrom et al., 2004). Metaanalýzou osmi publikovaných studií byla
prokázána přítomnost anti-EBV protilátek u více než 99 % RS pacientů ve srovnání
s kontrolním souborem, v němž byla nalezena pouze u 90 % osob (Ascherio et al., 2000).
Přestože byla u pacientů s RS prokázána vyšší serologická prevalence, zvýšené titry anti-EBV
17
protilátek by měly být přítomny již před začátkem onemocnění, abychom mohli prokázat
kauzální souvislost. Jejich přítomnost by mohla také svědčit o systémové imunitní
dysregulaci. Výsledky několika studií podporují tento příčinný vztah. Ve studii v souboru
3 miliónů vojáků v USA byly hodnoceny sérové hladiny anti-EBV protilátek před vstupem do
armády a následně byly měřeny každé dva roky. U 83 vojáků, kteří onemocněli RS byl
vzestup jejich hladin nejvýznamnějším prediktorem rozvoje nemoci (Levin et al., 2003; Levin
et al., 2005). Pozitivní asociace byla zjištěna již 5 let před rozvojem onemocnění, kdy došlo
ke zvýšení titru protilátek na dvoj až trojnásobek ve srovnání s kontrolním souborem. Jejich
dynamika tedy prokazuje časovou závislost mezi prodělanou infekcí EBV a rozvojem RS
(Levin et al., 2003; Levin et al., 2005).
Metaanalýzou 14 studií bylo také zjištěno nízké riziko rozvoje RS u lidí, kteří nikdy
neprodělali infekci EBV, naopak zvýšené riziko rozvoje RS u jedinců, kteří byli infikovaní
v adolescenci či později (Thacker et al., 2006). Důležitou roli by mohla hrát zejména
symptomatická infekce EBV-infekční mononukleóza. Epidemiologie infekční mononukleózy
a RS je velmi podobná. Obě onemocnění se vyskytují zejména u mladých jedinců, kopírují
zeměpisnou šířku a vyskytují se vzácně u lidí, kteří prodělali EBV virózu v časném dětství.
Skutečnost, že lidé s infekční mononukleózou v anamnéze mají vyšší riziko RS vede
k předpokladu, že zejména pozdní EBV infekce je možným příčinným faktorem (Thacker et
al., 2006). Další informace o dlouhodobém vlivu pozdní EBV infekce jsou získané z dánské
studie, do které bylo zařazeno 25 234 pacientů s infekční mononukleózou. RS se vyvinula
u 104 pacientů a riziko rozvoje nemoci zůstalo trvale zvýšené po dobu 30 let (Nielsen et al.,
2007). Tato studie však nepotvrdila, že hlavním a jediným rizikovým faktorem rozvoje RS
bylo časové okno po prodělané infekci. Z těchto nálezů lze vyvodit, že v prevenci RS by se
mohla uplatnit buď expozice malých dětí v časném období života EBV, nebo ochrana starších
lidí před touto infekcí.
Dále byly prokázány protilátky proti antigenu EBV v mozkomíšním moku nemocných
s RS (Bray et al., 1992; Cepok et al., 2005) a vyšší počet autoimunitních T-buňek
u nemocných RS schopných rozpoznat EBV ve srovnání s kontrolními jedinci (Ascherio et
al., 2001; Lang et al., 2002).
Možný mechanismus ovlivnění rozvoje RS virem EBV není dosud objasněn.
Předpokládá se mechanismus molekulárních mimiker, tj. zkřížená reaktivita mezi
antigeny EBV a PLP (Christensen T, 2006, Lang et al., 2002; van Sechel et al., 1999)
a bystander aktivace (Pender et al., 2003).
18
Herpetické viry
Human herpesvirus type 6 (HHV 6) a riziko rozvoje roztroušené sklerózy:
Jedná se o ubikvitární virus, který se vyskytuje až s 90 % prevalencí v populaci. Jako
ostatní neurotropní viry může vyvolat akutní encefalomyelitidu, navodit demyelinizaci
a poškození axonů. Integruje se do hostitelského genomu a reaktivuje se za určitých okolností,
např. stresem.
Byl prokázán nejen v oligodendrocytech v plakách RS, ale též v CNS lézích jiné
etiologie, např. ischemických. Jeho úloha v etiopatogeneze RS není dosud objasněna. Byly
prokázány zvýšené titry HHV-6 protilátek u RS, výsledky asociačních studií jsou však
nejednoznačné (Ablaschi et al., 2000; Sanders et al., 1996; Soldan et al., 1997). Pozitivní
asociace byla nalezena u 50 % RS studií a u 78 % studií, pokud byl testován zvlášť aktivní
a latentní virus (Ablaschi et al., 2000).
4.1.2 Sluneční záření a nedostatek vitamínu D3
Hypotéza o souvislosti nedostatku vitaminu D3 s rizikem rozvoje RS v určité
geografické oblasti je podložena narůstající prevalencí onemocnění se zvyšující se vzdáleností
od rovníku. Dochází k nedostatečné produkci vitaminu D3 vzhledem k nízké intenzitě
slunečního záření, zejména v zimních měsících (Jablonski and Chaplin, 2000) (Obr. 4).
V přímořských oblastech, kde je zajištěn vyšší příjem vitaminu D3 potravou, se prevalence
onemocnění snižuje (Presthus, 1960) (Obr.5).
Obr. 4 Počet měsíců v roce, během kterých není produkován dostatek vitaminu D3 vzhledem
k nízké intenzitě slunečního záření.
19
Zdroj: Multiple Sclerosis: Epidemiology, Genetics and Environmental Factors: www.msforum.net)
a) Nedostatek vitaminu D> než 6 měsíců/rok.
b) Nedostatek vitaminu D>1-6 měsíců/rok.
c) Dostatek vitaminu D celý rok.
d) Nedostatek vitaminu D>1-6 měsíců/rok.
e) Nedostatek vitaminu D> než 6 měsíců/rok.
A – Finnmark (2003) >83
B – Troms (2003) >104
C – Nordland (1999) 106
D – Nord Trøndelag (1999) 164
E – Oppland (2002) 190
F – Hordaland (2003) 151
G – Oslo (2005) 154
Obr. 5 Prevalence RS onemocnění v jednotlivých oblastech Norska (/105). Prevalence RS
v Norsku nevzrůstá se zvyšující se zeměpisnou šířkou jako v ostatních zemích Evropy a USA
Zdroj: Kampman MT et al. J Neurol 2007; 254: 471–477)
20
Sluneční záření, syntéza vitaminu D3 a prevalence roztroušené sklerózy
Zvýšené riziko rozvoje RS je spojeno se zvyšující se zeměpisnou šířkou a s tím
korelující sníženou expozicí slunečnímu (zejména ultrafialovému B, UVB) záření na severní
i jižní polokouli zrcadlově. Sluneční záření hraje zásadní roli při syntéze vitaminu D3 v kůži.
Vitamin D3 (cholekalciferol) je produkován v kůži po aktivaci cholesterolu. Po vstupu do krve
je metabolizován v játrech hydroxylací na 25 (OH) D3 a poté v ledvinách transformován na
aktivní formu 1,25- dihydroxycholecalciferol (l,25 (OH)2 D3), známý jako kalcitrol. Vazbou
na receptor vitaminu D je ovlivněna transkripce mnoha genů, což má prolongovaný
imunologický efekt. Cirkulující hladina 1,25 (OH)2 D3 je závislá na expozici UVB a příjmu
vitaminu D potravou.
Vitamin D3 je vlastně hormon-steroid, jehož aktivní forma se podílí na metabolismu
kalcia, fosforu, ovlivňuje vývoj a zachování správné stavby kostí, zubů a je také důležitým
imunomodulátorem (Munger et al., 2006). Receptor vitaminu D (VDR) je členem steroidní
receptorové nadrodiny, který funguje jako aktivační transkripční faktor. Je exprimován
v mnoha tkáních lidského těla včetně imunitního systému. Je přítomný v tenkém střevě,
tračníku, osteoblastech, aktivovaných T a B lymfocytech, pankreatických beta buňkách
Langerhansových ostrůvků, mozku, srdci, kůži, pohlavních orgánech, prostatě, buňkách
mléčné žlázy (Holick et al., 2004). Aktivace VDR navozuje silné antiproliferativní,
prodiferenciační a imunomodulační účinky (Tab. 2). Je ovlivňován řadou dalších faktorů
a zvyšuje/snižuje transkripci určitých genů. Aktivní metabolit vitaminu D3, 1.25 (OH)2 D3
a VDR se vzájemně ovlivňují. Po navázání 1.25 (OH)2 D3 na VDR se vytvoří heterodimer
s retinoidním X receptorem (RXR). Tento heterodimer se následně váže na VDRE, což jsou
specifické DNA sekvence v promotorové oblasti 1.25 (OH)2 D3 responzivních genů.
Komplex VDR/RXR po vazbě na VDRE moduluje transkripci velkého množství 1.25 (OH)2
D3 responzivních genů a tímto mechanismem může kalcitrol přímo regulovat genovou expresi
v 1.25 (OH)2 D3 odpovídajících buňkách. Současné pokroky v genomové technologii,
např. mikroarray analýzy nebo genome-wide studie umožňují výzkum genetických
a biochemických změn, které jsou asociovány s fyziologickým účinkem 1.25 (OH)2 D3
(Dusso et al., 2005). Detailní analýza molekulárních účinků 1.25 (OH)2 D3 a VDR umožní
nalézt řadu dalších responzivních genů a objasnit komplexní účinky vitaminu D (Wang et al.,
2005).
21
Tab. 2 Biologické a imunomodulační účinky vitaminu D3
Podporuje immunosupresi, zvyšuje apoptózu dendritických buněk a fagocytózu
makrofágů, zvyšuje aktivitu natural killer buněk, indukuje expresi IL-10
a antimikrobialních peptidů.
Inhibuje diferenciaci a maturaci dendritických buněk, funkci IL-1 (prozánětlivý),
inhibuje produkci Th1 indukovaných cytokinů, produkci interleukinu-2 , transkripci
IFNγ vazebných genů a genů kódujících neutrofilní chemotaktický faktor IL-8.
Má neuroprotektivní efekt, indukuje expresi nervového růstového faktoru a chrání
proti oxidačním radikálům.
Má anti-tumorózní aktivitu.
Reguluje homeostázi kalcia, hladiny kalcia a fosforu, jejich absorpci z potravy a
reabsorpce kalcia v ledvinách, podporuje mineralizaci kostí.
Fyziologické funkce vitaminu D
Vzhledem k expresi VDR v mnoha tkáních lidského těla a velkému množství tzv. D3
responzivních genů je zřejmé, že vitamin D3-cholekalciferol ovlivňuje široké spektrum
fyziologických funkcí, např. kalciovou homeostázu, uplatňuje se v prevenci některých druhů
rakoviny, neuroprotekci a systémové imunitní regulaci.
Neuroprotektivní účinky vitaminu D
Předpokládá se, že 1.25(OH) 2 D3 ovlivňuje funkci nervového systému a má řadu
neuroprotektivních účinků (Garcion et al., 2002; Nakagawa et al., 2006) (Tab. 2), neboť
VDR byl nalezen také v neuronech a gliových buňkách. Mozkové buňky produkují také
enzymy, které se podílí na metabolismu 1.25 (OH) 2 D3. Jsou potřebné další studie
k objasnění potenciálního využití těchto nálezů v klinické praxi.
Regulace imunitního systému
1.25 (OH)2 D3 je silný imunomodulátor, neboť VDR je přítomný v aktivovaných T i B
lymfocytech. V mnoha experimentálních zvířecích modelech autoimunitních chorob podání
22
1.25 (OH)2 D3 buďto snižuje, nebo vede k úplnému zastavení rozvoje nemoci. Ve studii
experimentální alergické encefalomyelitidy (EAE) na myších bylo zjištěno, že kalcitrol je
silným inhibitorem EAE. Jeho podání těžce postiženým myším vedlo ke zlepšení tíže
postižení (Cantorna et al., 1996; Spach et al., 2006). 1.25 (OH)2 D3 zvyšuje protizánětlivou
aktivitu IL-10, který ovlivňuje mozkové parenchymální buňky (Spach et al., 2006).
Dalším zajímavým nálezem je aktivace receptoru PD-Ll vitaminem 1.25 (OH)2 D3.
Tento receptor je exprimován na antigen-prezentujících buňkách (APC), aktivovaných
T buňkách a v různých tkáních (Latchman et al., 2004). V první fázi imunitní reakce se PD-Ll
podílí na stimulaci proliferace T lymfocytů, v pozdějších fázích však zvýšená exprese PD-Ll
vede k inhibici T buněk a apoptóze. V experimentálním modelu u myší, u nichž byl receptor
PD-Ll odstraněn, byla potvrzena vyšší vnímavost k rozvoji EAE (Latchman et al., 2004).
Tato molekula hraje tedy pravděpodobně klíčovou roli v T-buněčné toleranci. Úloha
1.25 (OH)2 D3 v procesu apoptózy může vést k dalšímu možnému objasnění mechanismu
účinku, kterým by mohla dostatečná hladina vitaminu D chránit před rozvojem
autoimunitních onemocnění včetně RS (Munger et al., 2006).
Kalcitrol je také důležitým induktorem vlastní imunity, což umožňuje rychlou obranu
proti mikrobiálním patogenům. Byla prokázána přítomnost VDREs v promotorech genů pro
antimikrobiální peptidy cathecidin a defensin β 2 a 1.25 (OH)2 D3 navozuje jejich přímou
expresi v keratinocytes, monocytech i neutrofilech. Kultury buněčných linií inkubované s
1.25 (OH)2 D3 vykazují antimikrobiální aktivitu proti E-coli a Pseudomonas aeruginosa,
avšak bez přítomnosti vitaminu D3 není antimikrobiální efekt přítomen (Wang et al., 2004).
Bylo také prokázáno, že se aktivní metabolit vitaminu D podílí na aktivaci toll-like receptorů,
která navozuje přímou antimikrobiální odpověď v monocytech a makrofázích proti buněčným
bakteriím, například Mycobacterium tuberculosis (Liu et al.,2006).
Tyto nálezy ukazují, že navození exprese antimikrobiálních genů prostřednictvím 1.25
(OH)2 D3 hraje významnou roli v UVB indukované individuální vlastní imunitě. Vitamin D
může být tedy účinný v léčbě oportunních infekcí, naproti tomu jeho deficit může zvýšit
vnímavost k některým mikrobiálním infekcím, např. k již zmíněnému Mycobacterium
tuberculosis. Nedostatek vitaminu D v zimních měsících by mohl také vysvětlit výskyt
některých sezónních infekcí, např. chřipky nebo běžného nachlazení (Cannel et al., 2006).
Imunomodulační efekt kalcitrolu musí být ještě podrobněji studován a objasněn.
23
Vliv vitaminu D u roztroušené sklerózy
Vitamin D se může významně podílet na spuštění autoimunitního procesu u RS a
podstatně ovlivnit další vývoj choroby vzhledem ke svému komplexnímu
imunomodulačnímu, imunosupresivnímu, neuroprotekticvnímu účinku i podílu na inhibici
oportunních infekcí, které mohlou aktivovat imunitní systém a navodit autoimunitu
v pozdějším životě.
Souhrn
Je dlouhodobě známo, že vitamin D hraje klíčovou roli v homeostáze kalcia.
V poslední době bylo zjištěno, že má také mnoho dalších neuroprotektivních
a imunomodulačních účinků. Podílí se např. na buněčné proliferaci a diferenciaci a řada
dalších účinků ještě není pravděpodobně objasněna. Významné biologické účinky
zprostředkované vitaminem D jsou umožněny prostřednictvím tkáňově specifické exprese
VDR. Výsledky současných epidemiologických studií prokazují, že chronický nedostatek
vitaminu D3 v potravě a nedostatek slunečního záření, zejména v zimních měsících, může
zvýšit riziko rozvoje některých chronických nemocí, zejména autoimunitních onemocnění,
jako RS, revmatoidní arthritis, diabetes mellitus typu I, dále rakoviny, afektivních
onemocnění, hypertenze či snížené obraně proti mikrobiálním infekcím (Holick, 2004).
Uvažuje se také o možném vlivu slunečního záření v průběhu těhotenství na
vnímavost k RS. V souboru pacientů z Kanady, Británie, Dánska a Švédska bylo u jedinců
narozených v květnu prokázáno zvýšené riziko rozvoje nemoci o 19 % ve srovnání s lidmi
narozenými listopadu. Zvýšené riziko u lidí narozených v květnu by mohlo být zapříčiněno
sníženou expozicí matky slunečnímu záření v zimních měsících v průběhu gravidity, vedoucí
k deficitu vitaminu D (Willer et al., 2006).
Proto je velmi důležité věnovat dostatečnou pozornost optimální suplementaci
vitaminem D3. V současné době probíhá řada studií k objasnění této problematiky. Hlavním
zdrojem vitaminu D je syntéza v kůži, důležitou roli hraje také přívod potravou. Významný
nedostatek vitaminu D způsobuje křivici a osteomalacii. Dosud však není objasněno, jaká
dávka tohoto vitaminu je potřebná k optimálnímu zajištění ostatních výše uvedených
fyziologických procesů.
24
Bylo zjištěno, že současná doporučená denní dávka 400 IU vitaminu D3 pro dospělé je
velmi nízká a nedostatečná pro zachování cirkulujících hladin 25(OH)D3 v krvi a zajištění
biologických funkcí vitaminu D. Bylo rovněž prokázáno, že v zimních měsících při
nedostatečné expozici slunečnímu záření je potřeba suplementovat dávkou vitaminu D3 až
1000 IU/den, aby byla zachována optimální hladina 25(OH)D3 v krvi (Heaney et al., 2003)
(Obr. 6).
Vzhledem k tomu, že rozsáhlá část světové populace je vystavena velmi nízkému
UVB záření v průběhu roku, mohl by deficit vitaminu D představovat významné zdravotní
riziko. Proto by měla být tato problematika podrobně zkoumána.
Obr. 6 Cirkulující hladiny 25(OH)D3 ve vztahu k perorálnímu příjmu vitaminu D3
Zdroj: Heaney RP et al. Am J Clin Nutr 2003; 77: 204–210.
25
4.1.3 Stres
Stres je dalším rizikovým faktorem rozvoje a progrese RS. Je prokázáno, že nervový,
imunitní a endokrinní systém se navzájem ovlivňují (Ebers, 1998). Stresovou reakci může
vyvolat nadměrná psychická nebo fyzická zátěž. Krátkodobý stres, jehož podstatou je
vyvolání obranné či únikové reakce na aktuální nebezpečí a dochází k potlačení imunitni
reakce může mít pozitivní vliv. Po jeho odeznění dochází během několika týdnů
k normalizaci stavu a následně mezi 4-6 týdnem k sekundární aktivaci imunitního systému.
V tomto období dochází také k nejčastějšímu rozvoji atak u nemocných s RS (Ebers 1998).
Také chronický, dlouhodobý stresující faktor hraje významnou roli v aktivaci imunitního
systému a může přispět k rozvoji řady onemocnění, včetně RS. Stres negativně působí na
nervový i hormonální systém organismu. Vědci z University California v Los Angeles shrnuli
poznatky z molekulárních a experimentálních výzkumů na zvířatech, z klinických i
epidemiologických studií (Gold et al., 2005). Nálezy ukazují, že stres může navodit aktivaci
RS a rozvoj ataky prostřednictvím dysregulace hypotalamo-hypofyzární osy (HPA) a
autonomního nervového systému. V počátečních stadiích onemocnění dochází pravděpodobně
ke snížení aktivity HPA systému, která spolu se sníženou senzitivitou leukocytů ke
glukokortikoidům vede k aktivaci zánětlivého procesu. Naopak při progresi choroby se
aktivita HPA zvyšuje, dochází ke snížené senzitivitě leukocytů k beta adrenergní stimulaci a
dochází k progresi neurodegenerativního procesu (Gold et al., 2005). Důležitou roli v aktivaci
imunitního systému stresujícím faktorem může hrát také cirkadiální rytmus.
V experimentálních studiích na krysách bylo prokázáno, že stres v půběhu dne vede k aktivaci
zánětlivého procesu a produkci prozánětlivých cytokinů v hippocampu a mikroglii. Pokud byl
stresující faktor aplikován v noci, k elevaci prozánětlivých cytokinů nedošlo (Fonken et al.,
2015). Vliv stresu na imunitní systém potvrdila také studie na 14 zdravých studentech (Lalive
et al., 2002). Bylo prokázáno, že před stresující událostí, v tomto případě státní závěrečnou
zkouškou, došlo ke snižení hladiny prozánětlivého tumor nekrotizujícího faktoru a následující
den k jejímu opětovnému zvýšení. Zvýšení hladiny TNF-a u pacientů s RS může navodit
aktivaci autoimunitního procesu a ataku onemocnění (Lalive et al., 2002).
26
4.1.4 Vliv výživy, sociální a kulturní faktory
Možný vliv mikrobiomu na riziko rozvoje roztroušené sklerózy
V posledních letech bylo také zjištěno, že důležitou roli v lidském vývoji a patofyziologii
hraje střevní mikrobiom. Tvoří střevní biologickou bariéru proti patogenům a hraje
významnou úlohu v udržení střevní rovnováhy, vývoji, výživě i imunitě člověka (Hooper et
al., 2015). Bakterie střevního mikrobiomu obsahují okolo 3 miliónů genů a asi 100krát
převyšují počet genů lidského genomu (Brüls et al., 2012). Weisntock et al. v genetickém
výzkumu vyšetřil genomy u 101 druhů střevních bakterií, které se běžně nacházejí v lidském
střevě. Bylo zjištěno, že genomy vybraných bakteriálních druhů obsahují okolo 10 miliónů
polymorfizmů, které se navíc lišily mezi hostiteli četnými inzercemi a delecemi (Weisntock et
al., 2012). Bylo také prokázáno, že střevní mikrobiom jednotlivých lidí je z genetického
hlediska velmi stabilní. Dědičná informace střevního mikrobiomu je tedy pro jednotlivce
jedinečná podobně jako jeho vlastní DNA; hovoří se o tzv. druhém genomu (Brüls et al.,
2012). Individuální reakce na léky nebo rozdíly v metabolismu jsou do značné míry ovlivněny
nejen individuálními rysy lidského genomu, ale také specifickými variantami genů střevního
mikrobiomu a jejich vzájemnou interakcí. Změny složení střevní mikroflóry v důsledku
změny životního stylu, nadbytku sladidel, lepku, geneticky modifikovaných potravin,
konzumaci alkoholu, nadužívání antibiotik a další narušuje střevní ekosystém a vzniká střevní
dysbióza, která může vyvolat řadu onemocnění; kromě gastrointestinálních také diabetes,
autoimuitmí choroby, alergická či neuropsychiatrická onemocnění (Wekerle H., 2012).
Udržení zdravé mikroflóry může být proto slibnou léčbou některých výše uvedených
onemocnění, včetně RS (Wekerle H., 2012; Xu et al., 2015).
Vyšetření metabolického profilu
Další slibnou, neinvazivní metodou je vyšetření metabolického profilu (metabolomu)
nemocných s RS pomocí H-NMR spectroskopie. Její velkou výhodou je vysoká
reprodukovatelnost a možnost kvantifikace, avšak tato metoda má nízkou senzitivitu. Pomocí
H-NMR spectroskopie byla vyšetřena plazma 73 RS pacientů a 88 zdravých kontrol (Cocco et
al., 2016). Bylo zjištěno snížení glukozy, 5-OH-tryptofanu a tryptofanu a naopak zvýšení 3OH-butyratu,
acetoacetátu, acetonu, alaninu a cholinu u nemocných s RS ve srovnání se
27
zdravými jedinci. Jedná se o metabolický řetězec glukózy a tryptofanu. Tryptofan hraje
důležitou roli v metabolismu neurotransmiterů a serotoninu, které se účastní imunitních dějů a
má zejména neuroprotektivní a neurotoxické vlastnosti (Lim et al., 2010). Reinke et al. také
prokázal u RS pacientů zvýšení cholinu v mozkomíšním moku, který je spojován s
demyelinizací (Reinke et al., 2014). V některých dalších studiích bylo u pacientů s RS a NMO
též nalezeno zvýšení acetátu, který je tvořen metabolismem astrocytů (Moussallieh et al.,
2014). Mohlo by se jednat o slibné biomarkery, které by mohly být využity v diagnostice i
léčbě pacientů s RS.
Další faktory
Byla vyslovena řada dalších teorií o souvislosti RS s přítomností chemikálií či vlivu
hygienických podmínek. Je dlouhodobě známá např. asociace s vyšší sociálně-ekonomickou
úrovní, sanací zdraví, chladným a vlhkým počasím a urbanizací. Žádná z těchto teorií však
nebyla potvrzena.
28
4.2 Genetické faktory
První genetické výzkumy vycházely z epidemiologických poznatků o familiárním
výskytu RS (Tab. 3). Studie dvojčat a sourozenců umožňují jedinečný výzkum komplexního
působení genetických a environmentálních faktorů na riziko rozvoje a průběhu RS. Většina
výsledků studií u dvojčat se shoduje; jednovaječná dvojčata mají až 30 % pravděpodobnost
onemocnění, dvouvaječná 5 % (Cree B, 2008) (Tab. 4). V kanadské CCPGSMS studii, do
které bylo zahrnuto 370 párů dvojčat, bylo prokázáno 25.3 % riziko u jednovaječných a 5.4 %
u dvouvaječných dvojčat. U jednovaječných dvojčat ženského pohlaví byla prokázána vyšší
34 % shoda, u dvouvaječných pak 3.8 % (Willer et al., 2003). Kolísá však v jednotlivých
zemích, rozdíly jsou dány také prevalencí nemoci v určité geografické oblasti. Např. na
Sardinii, kde je prevalence onemocnění vysoká (147/100 tis. obyvatel), činí shoda 22.2 %.
Naproti tomu v kontinentální Itálii, kde je prevalence nízká (61/100 tis obyvatel), pouze
14.5 % (Ristori et al., 2006).
Srovnávací studie jednovaječných, dvouvaječných dvojčat a sourozenců umožňují
hodnocení podílu genetického vlivu, gestačních podmínek a environmentálních faktorů na
počátek a průběh onemocnění. Monozygotní dvojčata mají nejvyšší riziko, dvouvaječná
dvojčata mají vyšší riziko než sourozenci, neboť se uplatňují společné gestační a zevní vlivy.
Přínosné jsou také studie nevlastních sourozenců, kteří sdílejí pouze 25 % společných genů
buď matčina nebo otcova genotypu (Ebers et al., 2004).
Nejedná se o klasickou monogenní, ale multifaktoriální dědičnost. Na spuštění
autoimunitního procesu se pravděpodobně podílí velké množství tzv. malých genů,
pravděpodobně okolo 80, které podmiňují vysokou interindividuální variabilitu choroby
(Ebers G, 1995, Dyment et al., 2004).
Primární roli v patogenezi RS hraje pravděpodobně geneticky determinovaná imunitní
odpověď. Proto se nejvíce studií se zaměřilo na asociaci této choroby s geny pro lidské
leukocytární antigeny (HLA).
29
Tab. 3 Zvýšení rizika onemocnění RS u příbuzných z důvodu sdílení společných genů
Příbuzenský vztah Riziko onemocnění RS
Výchozí pravděpodobnost výskytu v populaci 1/1000
Bratranec/sestřenice s RS 7/1000
Nevlastní sourozenec z otcovy strany 13/1000
Nevlastní sourozenec z matčiny strany 24/1000
Vlastní sourozenec 31/1000
Dvouvaječná dvojčata 55/1000
HLA-identický sourozenec 80/1000
Jednovaječná dvojčata 270/1000
Zdroj: Ebers G, MS Forum 2007; Modern Management Workshop, Wiesbaden
Tab. 4 Pravděpodobnost onemocnění u jednovaječných a dvouvaječných dvojčat
Země Pravděpodobnost onemocnění RS
Kanada, Dánsko, Finsko, VB, USA MZ = 25–30 % DZ = 3–5 %
Francie MZ = 5.9 % DZ = 3 %
Itálie MZ = 14.5 % DZ = 4 %
Zdroj: Willer CJ et al. PNAS 2003; 100: 12877-82; Ristori G et al. Ann Neurol 2006; 59: 27-34.
30
4.2.1 Hlavní histokompatibilní komplex (MHC)
RS je T-buněčné, autoimunitní, demyelinizační onemocnění. Cílovým antigenem je
myelin CNS, který je napadán autoagresivními T-buňkami a je ničen. Rozpoznání antigenu
hraje klíčovou roli pro navození autoimunitního procesu a interakce mezi T-buňkami
a antigen prezentujícími buňkami (APCs) je jedním z prvních kroků v patogenním procesu.
APCs zpracovávají cizí antigeny vazbou s vlastním antigenem-molekulou major
histocompatibility komplexu (MHC), známou jako lidský leukocytární antigen (HLA)
a prezentují je T-buněčným receptorům. Exprese HLA molekul na APCs tedy umožňuje
interakci lidského imunitního systému s antigeny ze zevního prostředí. Prezentace různých
HLA molekul na povrchu APCs může ovlivnit individuální odpověď na cizí a vlastní antigeny
a tímto způsobem může být modifikována vnímavost k RS. Základní složkou této specifické,
získané imunitní odpovědi jsou T-buňky exprimující TCRs na svých membránách a APCs.
T-lymfocyty rozpoznají antigen po navázání na molekuly HLA I. nebo HLA II. třídy, které
mají rozdílné funkce. Geny HLA I. a II. třídy jsou umístěny na krátkém raménku
6. chromozómu (Obr. 7). Kódují buněčné povrchové proteiny, které hrají zásadní roli
v iniciaci imunitní odpovědi a zejména v prezentaci antigenů CD4+ a CD8+ T-lymfocytům.
Obr. 7 Geny HLA I., II. a III. třídy jsou umístěny na krátkém raménku 6. chromozómu.
Zdroj: Gene map of the human leucocyte antigen (HLA) region. Expert Reviews in Molecular Medicine 2003
Cambridge University Press, 2003
31
Geny HLA I. třídy-(HLA-A, HLA-B, HLA-C) kódují antigeny, které jsou integrální
součástí plasmatické membrány všech jaderných buněk a prezentují peptidové antigeny
cytotoxickým CD8+ buňkám. Nejsou exprimovány na erytrocytech, v buňkách CNS nejsou
exprimovány vůbec nebo jen v nepatrné míře. Antigeny I. třídy se skládají ze dvou
polypeptidových jednotek, variabilního těžkého řetězce kódovaného v MHC
a nepolymorfního polypeptidu, β 2- mikroglobulinu (Obr. 8). Tento polypeptid je kódován
genem lokalizovaným mimo MHC, na 15. chromozomu. HLA-I prezentuje vnitřní antigeny,
které se nacházejí přímo v buňkách. Může se jednat např. o proteiny kódované virovými geny
nebo proteiny kódované mutovanými geny v nádorově změněných buňkách.
Obr. 8 HLA molekuly I. třídy se skládají ze dvou polypeptidových jednotek, variabilního
těžkého řetězce kódovaného v MHC a nepolymorfního polypeptidu, β 2 - mikroglobulinu.
Zdroj: Ester Šmídová. Systém HLA a prezentace antigenu Ústav imunologie UK 2. LF a FN Motol.
Obr. 9 HLA molekuly II. třídy se skládají ze dvou transmembránových glykoproteinů,
nazývaných α a β řetězec, oba dva řetězce jsou polymorfní.
Zdroj: Ester Šmídová. Systém HLA a prezentace antigenu Ústav imunologie UK 2. LF a FN Motol.
32
Geny HLA II. třídy (HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR) kódují heterodimérové receptory
exprimované na buněčném povrchu B-lymfocytů, makrofágů, aktivovaných T-lymfocytů
a dendritických buňkách. HLA molekuly II. třídy se skládají ze dvou transmembránových
glykoproteinů, nazývaných α a β řetězec, oba dva řetězce jsou polymorfní (Obr. 9). Prezentují
fragmenty antigenů získané z mimobuněčných zdrojů CD4+ lymfocytům (Obr. 10). Antigeny
pocházející z vnějšího prostředí se do organismu dostávají přes gastrointestinální trakt,
respirační trakt, kůži nebo arteficiálně např. injekčně. Mezi HLA III. třídy patří složky
komplementu, TNF, heat shock proteinů (HSP) a další.
Obr. 10 HLA (MHC) molekuly I. třídy prezentují intracelulární antigeny CD8+ lymfocytům,
HLA (MHC) molekuly II. třídy prezentují antigeny získané z mimobuněčných zdrojů CD4+
lymfocytům. Zdroj: Nature Reviews Immunology. ISSN: 1474-1733 EISSN: 1474-1741
Heavy chain-těžký řetězec; Antigenic peptide-antigenní peptid; Virus-virus; Tumour antigen-nádorový antigen;
Exogenous antigen-exogenní antigen.
33
Pro výslednou imunitní reakci je podstatné, že T-lymfocyty „vidí“ cizí antigeny pouze
ve spojitosti s molekulami vlastního HLA systému. Normální imunitní systém brání
T-lymfocytům napadat vlastní antigeny, které nejsou obvykle T-buňkami rozpoznány.
K selekci nezralých T-lymfocytů dochází v thymu podle jejich schopnosti rozeznávat HLA
vlastního těla. Nereagující, nebo příliš agresivní buňky jsou asi z 95 % zničeny, ostatní
vstupují do krve a sekundárních lymfatických orgánů (Šterzl I, 2005).
B lymfocyty zpracovávají antigen exogenní cestou také ve spojení s HLA molekulami
II. třídy. CD4+ buňka následně sekretuje cytokiny, tím je B lymfocyt aktivován a produkuje
odpovídající protilátky (Obr. 11).
Obr. 11 B lymfocyty zpracovávají antigen exogenní cestou také ve spojení s HLA molekulami II.
třídy
Zdroj: (Jeanne Kelly, 1996)
Antigen-antigen; Antigen-specific B cell receptor-antigenně specifický receptor B-lymfocytů; B-cell-Blymfocyty;
Class II MHC encoded protein-povrchový protein kódovaný geny HLA II třídy; Antigen being
processed-zpracování antigenu; Class II protein and processed antigen-povrchový protein HLA II třídy a
zpracovaný antigen; Mature helper T cell-zralý pomocný T-lymfocyt; Interleukins-interleukiny; Plasma cellplazmatická
buňka; Antibodies-protilátky.
34
MHC systém je složen ze skupin nejpolymorfnějších genů v genomu. Lokusy HLA-A,
HLA-B, HLA-C, HLA DP, HLA DQ a HLA-DR jsou extrémně variabilní a mohou mít až
desítky alelických variant, tzv. polymorfismů. Polymorfismy se liší v sekvencích jednotlivých
nukleotidů, může dojít např. k záměně pouze jednoho nukleotidu. Obrovský počet těchto
polymorfismů vede ke kódování velkého množství různých antigenních variant buněčných
povrchových proteinů, které se významnou měrou účastní imunologických reakcí. Z těchto
variant každý dědí v každém typu 2 alely, což dohromady tvoří tisíce možných kombinací.
Diverzita je patrná na příkladu studie HLA typizace 1000 dárců krve, provedené v USA.
Typizace byla provedena pouze pro HLA A a B. U více než poloviny vyšetřených byl nalezen
unikátní HLA haplotyp; 111 dárců mělo haplotyp, který sdíleli pouze s 1 osobou v celé
skupině. Nejčastější haplotyp (HLA-A1, HLA-A3, HLA-B7, and HLA-B8) byl v celé skupině
nalezen u 11 dárců. Lokusy A, B, C, D, DR, DP, DQ jsou tedy přítomny v populaci v různých
alelách. Přítomnost jednotlivých alel a lokusů může vést k přiměřené, slabé, nebo naopak
nadměrné imunitní reakci na určitý antigen (Shoenfeld et al., 2007).
V populaci je tedy zachováno velké množství HLA alel (www.allelefrequencies.
net/test/deafault1.asp, Robinson et al., 2003), přičemž mezi různými populacemi existují
značné rozdíly ve frekvenci jednotlivých HLA variant. Zůstává zachován velký počet alel
nízké frekvence, které jsou pro své hostitele přínosné zejména z evolučního hlediska. HLA
alely jsou na určitém chromozomu ve velmi těsné vazbě a jsou přenášeny společně jako tzv.
haplotypy (Robinson et al., 2003). Běžné viry a jiné patogeny jsou typicky prezentovány
imunitnímu systému frekventními HLA alelami, které jsou přenášeny na další generace. Za
určitých okolností se však mohou viry adaptovat na zevní prostředí a může dojít k selektivní
změně jejich struktury. Tyto modifikované virové antigeny nejsou prezentovány imunitnímu
systému cestou běžných HLA molekul, avšak méně frekventní alely mohou mít tuto
schopnost zachovanou. Jedinci, kteří mají méně frekventní alely, mohou být zvýhodněni
v možném přežití v průběhu epidemií. Tento mechanismus byl potvrzen ve studii potomků
367 Holanďanů, kteří emigrovali v roce 1845 do Surinamu v Jižní Americe. V průběhu dvou
týdnů po příjezdu zemřelo 180 lidí na břišní tyfus a o dva roky později zemřelo dalších 37 lidí
na žlutou zimnici. Většina přeživších obyvatel zůstala v Surinamu. V roce 1978 byla
provedena srovnávací studie frekvence určitých genetických polymorfismů mezi touto
skupinou a holandskými kontrolami. Byla nalezen vyšší výskyt málo frekventní alely HLA
Bw38 v populaci přeživší epidemii ve srovnání s kontrolami.
Na tomto příkladu emigrantů do Surinamu bylo demonstrováno, že běžná HLA alela
vyskytující se u Holanďanů nedostatečně zabránila smrtelné infekci tyfu nebo žluté zimnice.
35
Málo frekventní alela HLA u přeživších, která je schopna prezentovat antigeny těchto
patogenů a ochránit svoje nositele proti výše uvedeným onemocněním, pak byla přenesena na
další generace díky selekčnímu tlaku (de Vries et al., 1979).
Byla nalezena asociace alel HLA II třídy s některými autoimunitními chorobami
(Miyadera et al., 2015; Tomer Y, 2010; van Heemst et al., 2015) Předpokládá se, že dochází
k odchylce imunitní reakce následkem polymorfismu imunokompetentních genů,
vazebnou nerovnováhou mezi určitými HLA alelami a mutacemi či rozdílů v kapacitě
těchto polymorfních proteinů interagovat s antigenem a TCR v iniciaci imunitní
odpovědi. Řada autoimunitních onemocnění, např. RS, diabetes mellitus I. typu či
revmatoidní arthritis, je asociována s expresí určitých alel HLA II. třídy a haplotypů.
Žádná z těchto chorob však nevykazuje 100 % asociaci s určitým haplotypem, navíc
mnoho jedinců s haplotyty asociovanými s nemocí nikdy neonemocní (Nussbaum et al.,
2001).
4.2.2 Asociace HLA s roztroušenou sklerózou
Etiopatogeneze RS není dosud zcela uspokojivě objasněna, předpokládá se vliv
genetických a environmentálních faktorů (Ebers G, 1995). V současné době je plausibilní
teorie genetického nastavení organismu a onemocnění je spuštěno vlivem určitých vnějších
faktorů (Ebers G, 2007), nelze opomenout také vlivy epigenetické a stochastické (Sadovnic et
al., 2012).
Mezi vysoce polymorfními HLA alelami je zřejmá vazba, tzv. linkage disequilibrium.
Vzhledem k silné vazbě v HLA oblasti je velmi obtížné identifikovat specifickou rizikovou
alelu odpovědnou pro RS. Současné studie prokazují, že haplotyp HLA DR2 asociovaný se
zvýšeným rizikem rozvoje RS má vyšší vazbu ve srovnání s jinými bělošskými HLA
haplotypy v oblasti DR. Linkage disekvilibrium bylo pravděpodobně zachováno jako
výsledek pozitivní selekce (Gregersen et al., 2006).
V rozsáhlých, tzv. genome-wide asociačních studiích (GWAS), provedených
v evropské populaci byla prokázána asociace RS s DR2 haplotypem (Ligers et al., 2001),
který se skládá z HLA-DRA1*0101- DRB5*0101- DRB1*1501- DQA1*0102- DQB1*0602,
zejména s alelou HLA-DRB1*1501 (Lincoln et al., 2005; Prat et al., 2005; Sadovnic 2012;
Schmidt et al., 2007; Jersild et al., 1972) (Obr.12). Nosiči tohoto haplotypu mají trojnásobně
zvýšené riziko rozvoje onemocnění, u homozygotů dokonce šestinásobné.
36
Obr. 12 Asociace RS s DR2 haplotypem, zejména s alelou HLA-DRB1*1501
Zdroj: The International MS Journal, ISSN 1352-8963, Volume 9, Number 3, 2002
Metaanalýzou asociačních studií (GWAS) v souboru 9 772 nemocných a 17 376
kontrolních jedinců v evropské populaci, ve které bylo vyšetřeno 465 434 polymorfizmů, byla
potvrzena asociace RS s alelou HLA-DRB1*1501 se shodnou frekvencí v různých populacích
(p=1x10–320
, OR=3.1) (Sawcer et al., 2011). Například Masterman popsal ve švédské populaci
její přítomnost v 61 % u RS ve srovnání s 31 % v kontrolním souboru (p = 0.0001, OR = 3.5).
Shodné nálezy byly popsány také ve studiích u jiných etnických skupin, např. v Japonsku
nebo v populaci středního východu (Schmidt et al., 2007). Současně byl prokázán protektivní
efekt alely HLA-A*02 ve třídě HLA I. Bylo zjištěno také 29 dalších suspektních genetických
polymorfismů.
Analýzou HLA-DRBl*15 negativních rodin byla zjištěna alela HLA-A*0301 v oblasti
HLA I třídy asociovaná s rizikem RS. Bylo prokázáno, že zvyšuje riziko RS nezávisle na
HLA DRB1*1501, DQB1*06 haplotypu ve švédské populaci (Fogdell-Hahn et al., 2000).
37
V modelu EAE byla zjištěna interakce mezi alelami HLA-DRBl*1501 a DRB5*0101
u humanizované myši. Jeví se, že alela DR2b incidenci EAE zvyšuje, zatímco alela DR2a její
incidenci snižuje, opožďuje nástup a redukuje tíži onemocnění. Koexprese těchto molekul
vede k méně těžkému průběhu EAE, což by mohlo být podmíněno linkage disekvilibriem
mezi těmito dvěma alelami HLA II. třídy. Ačkoli by se mohlo jevit, že pro jedince není
výhodné zachování autodestruktivní molekuly DR2b, tyto na druhé straně plní velmi
důležitou ochrannou funkci proti infekčním patogenům. Koexprese DR2a a DR2b molekul je
pravděpodobně přítomna také u lidí a tyto genetické interakce by mohly ovlivnit riziko
rozvoje RS. Výsledky však musí být interpretovány velmi opatrně, neboť pokusy na myších
nereprezentují skutečné patofyziologické děje v lidském organismu (Gregersen et al., 2006).
Alely DRB1*1501, DRB5*0101 a DQB1*0602 přispívají k rozvoji RS zvýšením
prezentace peptidů myelinu T-lymfocytům. Bylo prokázáno, že TCR pacientů s RS rozpozná
rezidua 85–99 myelinového bazického proteinu kódovaného DRB1*1501 a peptidu viru EBV
kódovaného DRB5*0101, což podporuje teorii molekulárních mimiker (Lang et al., 2002).
Asociace mezi RS a určitými HLA alelami není mezi populacemi shodná.
U neevropské populace byla nalezena asociace s odlišnými alelami HLA-DRB1, například
ve studii na Sardinii byla zjištěna asociace s alelami HLA-DRB1*1501, DRB1* 0301
a DRB1*0405 (Marrosu et al., 1997).
Bylo rovněž nalezeno několik kandidátních genetických polymorfismů v oblasti HLA
II-rs3135388, rs2395182, rs2239802, rs2227139, rs2213584 (Sombekke et al., 2009).
Genetický polymorfismus rs3135388 je markerem alely HLA-DRB1*1501, senzitivita činí
96.4 %, specifita 99 % 2 (de Bakker et. al., 2006).
Zásadní roli v iniciaci imunitní odpovědi mají lidské leukocytární antigeny (HLA).
Jejich význam byl prokázán (Akkad et al., 2015; Lincoln et al., 2005; Prat et al., 2005;
Sadovnic 2012; Sawcer et al., 2011; Schmidt et al., 2007), avšak není ještě dostatečně
objasněn mechanismus vzájemných interakcí mezi geny HLA a environmentálními faktory,
zejména EBV virozou, herpetickými viry, retroviry či vitaminem D, které mohou navodit
zvýšenou expresi HLA (Burrell et al., 2011; Cree BA, 2014; Handunnetthi et al., 2010; Xiao
et al., 2015(De Jager et al., 2008; Sadovnic et al., 2012). HLA geny ovlivňují prezentaci
antigenů zmíněných virů a jeví se, že vzájemná interakce může ovlivnit vnímavost jedince
k RS. Zvýšená virová zátěž nebo změna prezentace EBV, které zkříženě reagují s buněčnými
antigeny, mohou spustit patogenní proces prostřednictvím molekulárních mimiker (Niller et
al., 2011; Sundström et al., 2009).
38
Geny mimo oblast HLA se také podílí na rozvoji a progresi onemocnění. Mezi
kandidátní geny řadíme geny kódující cytokiny a chemokiny a jejich receptory; kostimulační
molekuly-CD37, CD40, CD58, CD80, CD86, CLECL1 a signální molekuly-CBLB, GPR65,
MALT1, TYK2.
V současné době jsou známy výsledky několika mezinárodních asociačních studií.
Vyšetřením celého genomu u 931 rodin byla prokázána asociace s polymorfizmy genů α
řetězece receptoru pro IL-2 (IL2RA) a α řetězce receptoru pro IL-7 (IL7RA); IL-2R alfa
a IL-7R alfa; kódujících povrchové znaky CD25 a CD127 (Hafler et al., 2007), cytokiny a
jejich receptory, které mohou ovlivnit zánětlivý proces v RS plakách. Ovlivňují regulaci
a přežívání T-lymfocytů a významnou měrou se podílí v patogenezi onemocnění (Gregory et
al., 2007).
Mezi další rizikové geny řadíme gen CCR5 pro chemokinový receptor, který je
lokalizovaný na chromosomu 3p21-24. Jeho mutace 32CCR5, která je přítomna asi u 7 %
bělochů, může zpomalit progresi a tíži onemocnění. Gen pro APOE4 je umístěn na
chromosomu 3p21-24. Někeré mutace mohou navodit agresivnější destrukci tkáně a rychlou
progresi postižení. Gen pro osteoponitn, který je umístěn na chromosomu 4q21-q25, má
funkci chemotaktickou a protizánětlivou. Některé jeho varianty jsou spojeny s vyšším rizikem
přechodu do sekundární progrese. Také variabilita genu pro IFNγ, lokalizovaného na
chromosomu 12q14, je asociována se zvýeným rizikem rozvoje RS u mužů (Oksenberg et al.,
2005).
4.2.3 Molekulární mimikry u roztroušené sklerózy
Většina lidských proteinů je prezentována vyzrávajícím T-buňkám v thymu. Proteiny,
které prezentovány nejsou, např. myelinový oligodendrocytární glykoprotein (MOG), se
mohou stát autoreaktivními. T-buňky mohou také neadekvátně reagovat s vlastními antigeny,
které jsou velmi podobné cizím antigenům-známé jako zkřížená reaktivita. Autoreaktivní
T-buňky nejsou v thymu eliminovány a mohou být dlouhou dobu tolerovány jako buňky
prezentující vlastní antigen. Pokud jsou tyto T-buňky aktivované v průběhu infekce nějakým
patogenem, který nese antigen podobný antigenu vlastnímu, autoreaktivní T-buňky mohou
začít reagovat také s buňkami prezentujícími vlastní antigen. Teorie molekulárních mimikrů
byla potvrzena v lidských i zvířecích modelech RS u několika kandidátních molekul - např.
viru EBV či HHV 6 (Tejada-Simon et al., 2003).
39
4.2.4 Terapie založená na ovlivnění HLA
Potenciálním cílem budoucí terapie RS je ovlivnění receptorů HLA II třídy v antigen
prezentujících buňkách (APCs). Terapie protilátkami blokujícími HLA receptory a TCR
ligandy může zabránit prezentaci antigenu. V klinické praxi se již osvědčila léčba např.
glatiramer acetátem, který se váže na HLA molekulu kompetičně s myelinovými antigeny pro
prezentaci T-buňkám. Léčba vede k navození tolerance k auto-antigenní iniciaci specifické
autoreaktivní T-buněčné delece.
4.2.5 Souhrn
HLA je komplex molekul, které hrají důležitou roli v prezentaci antigenu. Exprese
HLA molekul na APCs umožňuje interakci mezi lidským imunitním systémem a zevním
prostředím. Alely HLA II. třídy na chromozomu 6 mají velmi vysoký stupeň polymorfismu,
umožňující vytvářet obrovské množství jedinečných HLA receptorů pro prezentaci
specifických antigenů. Diversita alel je pravděpodobně pomíněna selekcí navozenou hlavně
patogeny. Tento selekční tlak se také uplatnil v zachování určitých haplotypů, kterými jsou
určité HLA alely většinou děděné společně – linkage disekvilibrium. Důsledkem může být
rozvoj autoimunity. Jeví se, že environmentální faktory, zejména infekce, selektují haplotypy,
které vedou k rozvoji autoimunitních onemocnění. Interakce mezi T-buňkami a APCs je
zásadní v patogeneze RS. Tyto znalosti by mohly být využity pro novou strategii v prevenci
a léčbě RS. Porozumění tomuto procesu je v současné době limitované širší znalostí
komplexních imunologických interakcí, které se podílí na spuštění autoimunitního procesu
a destrukci myelinu. Mohlo by také napomoci nalézt další cílové molekuly pro terapii RS
v budoucnosti.
4.2.6 Funkční studie a epigenetické faktory u roztroušené sklerózy
Funkční genetické studie navazují na výsledky rozsáhlých genomových asociačních
studií a zabývají se funkcí DNA, RNA transkripty, proteinovými produkty a jejich
vzájemnými interakcemi. Hlavními epigenetickými mechanismy jsou acetylace a metylace
DNA, metylace histonů a mikroRNA. Transkripce je podporována acetylací histonů, jejich
deacetylace naopak transkripci tlumí (Griffiths et al., 2000), významnými regulátory
40
transkripce jsou take transkripční faktory. Důležitou roli hrají epigenetické vlivy (Bos et al.,
2016).
Epigenetické mechanismy vedou k regulaci exprese genů beze změny sekvence příslušné
DNA. Tyto změny mohou být dědičné (Bos et al., 2016). Mezi nejčastěji popisované
abnormity v epigenetických faktorech u autoimunitních onemocněních jsou změny metylace
DNA nebo modifikace histonů, které vedou k časoprostorovýcm změnám regulace genů
(Dang et al., 2001). Metylace DNA hraje roli v replikaci, rekombinaci a opravě DNA i
supresi transponovatelných elementů či retrovirové DNA (Hashimoto et al., 2010). Informací,
týkajících se epigenetických modifikací u RS zatím není mnoho (Kaliszewska et al., 2013).
Graves et al. nalezl signifikantní změny DNA metylace v HLA oblasti u CD4+T lymfocytů
(Graves et al., 2013), Bos et al. prokázal nízký stupeň hypermetylace v CD8+
T lymfocytech
(Bos et al., 2015). V dosud provedených studiích byl však vyšetřen pouze malý počet
pacientů s RS. Měly by být provedeny další, rozsáhlejší studie ve větším souboru nemocných
k objasnění významu úlohy metylace u komplexních onemocnění včetně RS.
Jsou studovány také další epigenetické mechanismy, např. vliv mikroRNA. Jejich funkce
spočívá v regulaci genové exprese. Molekuly miRNA jsou komplementární k části jedné nebo
několika konkrétních mRNA a inhibují translaci nebo navozují degradaci dané mRNA. Při
srovnání exprese 365 miRNA v T a B lymfocytech mezi pacienty s RR RS a zdravými
kontrolami byla zjištěna zvýšená exprese miR-17-5p v CD4+ lymfocytech u RS pacientů.
MiR-17-5p se podílí na progresi autoimunitního procesu ovlivněním vývoje T buněk
(Lindberg et al., 2010). V longitudinální studii RS pacientů léčených interferonem beta
Hecker et al. prokázal v periferních mononukleárech snížení exprese u 29 z 65-ti
hodnocených miRNA. Ovlivnění exprese miRNAs by mohlo být využito jako biomarkeru
sledování účinnosti terapie interferony u pacientů s RS (Hecker et al., 2013).
Další výzkumné práce se zabývají studiem genové exprese s využitím DNA či RNA
microarray technologie. Slibnou metodou je RNA či DNA sekvenace. Lossius et al. vyšetřil T
cell receptor β CD8+T lymfocytů z mozkomíšního moku a krve RS pacientů metodou RNA
sekvenace. Pomocí této metody byl schopen vytvořit mapu expanse klonů a určit
komparment, kde klony expandují (Lossius et al., 2014). Předpokládá se, že využití DNA a
RNA sekvenace by mohlo být v budoucnosti přínosné ve studiu patogeneze RS.
V posttranslační modifikaci bílkovin hraje důležitou roli N-glykosylace (Obr.13). Jedná se
o enzymatický proces, který probíhá v Golgiho aparátu. Narušení N-glykosylace vede ke
zvýšení rizika demyelinizace navozením dysfunkce nejen T-lymfocytů a antigen
prezentujících buněk, ale také oligodendrocytů a neuronů (Mkhikian et al., 2011). Narušení
41
tohoto procesu v animálním modelu vedlo k hyperaktivaci T-buněk, aktivaci cytotoxických Tlymfocytů
se ztrátou tolerance vůči vlastním antigenům s následným vznikem spontánní
zánětlivé demyelinizace (Grigorian et al., 2012). Do regulace N-glykosylace je zapojeno asi
30 genů a jejich variant včetně IL7RA, IL2RA, MGAT1 a CTLA-4, které jsou asociovány se
zvýšeným rizikem RS. U nosičů haplotypu (rs7726005, rs2070924 a rs2070925) MGAT1
dochází až k 20% redukci N-glykosylace (Mkhikian et al., 2011). Důležitou roli hraje
interakce těchto genů se zevními faktory, zejména vitaminem D. Bylo zjištěno, že deficit
vitaminu D v součinnosti s genetickými variantami IL-7RA, IL-2RA, MGAT1 a CTLA-4
může vést k významné dysregulaci procesu N-glykosylace v Golgiho aparátě (Mkhikian et al.,
2011).
Obr. 13 Model environmentální a genetické dysregulace N-glykosylace u roztroušené sklerózy.
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/ Copyright © 2011, Nature Publishing Group, a division
of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved.
Genetic variants-genetická variabilita; Enviromnet and metabolism-zevní prostředí a metabolismus; Decreased
MS risk-snížení rizika RS; MS risk increased-zvýšení rizika RS; Decreased-snížení; Increased-zvýšení.
42
4.3 Závěr
Etiologie RS je multifaktoriální, zahrnující komplexní interakce mezi geny,
epigenetickými a environmentálními faktory. Je velmi pravděpodobné, že riziko spuštění
onemocnění je ovlivněno současným působením dvou nebo více zevních faktorů a jejich
vzájemnou interakcí.
Data získaná studiem této nemoci v Evropě, USA i Austrálii potvrzují, že prevalence
nemoci vzrůstá se zvyšující se zeměpisnou šířkou na severní i jižní polokouli. V současné
době je plausibilní hypotéza, že u geneticky predisponovaných jedinců je nemoc spuštěna
vlivem environmentálních a epigenetických faktorů. Mezi nejvýznamnější zevní rizikové
vlivy řadíme zejména nedostatečnou koncentraci vitaminu D v séru navozenou sníženou
expozicí slunečnímu záření; dále herpetické, zejména EBV infekce a kouření.
Úloha vitaminu D je komplexní, neboť Vitamin D3 je významný imunomodulátor.
Prostřednictvm VDR navozuje silné antiproliferativní, prodiferenciační a imunomodulační
účinky (Munger et al., 2016; Simon et al., 2012). Stimuluje produkci protizánětlivých, tlumí
produkci prozánětlivých cytokinů a zvyšuje aktivitu a počet T-regulačních lymfocytů,
odpovídajících za navození periferní imunologické tolerance (Cantorna et al., 2015; Joseph et
al., 2012; Smolders et al., 2016). Podílí se také na regulaci makrofágů, dendritických buněk či
B lymfocytů (Lin et al., 2016). Funkční studie prokázaly, že prostřednictvím VDRE moduluje
genovou expresi, čímž může být též vysvětlen vliv kalcitrolu na riziko rozvoje RS
(Ramogapalan et al., 2009). Dosud není zcela objasněno, jakým způsobem může EBV navodit
rozvoj RS, neboť onemocnění se vyvine pouze u malého procenta infikovaných lidí. Možným
mechanismem by mohla být zkřížená reaktivita mezi antigenem EBV a PLP či latentní
perzistentní infekce, která stimuluje imunitní odpověď. Byl také prokázán vztah mezi EBV a
vitaminem D. Holmøy dokladoval, že buňky napadené EBV exprimují VDR, prostřednictvím
kterého může být navozena autoimunita. Touto hypotézou by mohlo být vysvětleno, proč má
izolovaný nedostatek vitaminu D či prodělaná viróza EBV pouze malý vliv na rozvoj RS
(Holmøy T, 2008).
Současné znalosti o podílu jednotlivých faktorů však nejsou dostatečné. Jsou nutné
další studie k získání informací potřebných k objasnění příčinného faktoru, který se na
zvýšení rizika RS uplatňuje nejvýznamněji.
43
5 Patofyziologie roztroušené sklerózy
RS je komplexní onemocnění, v jehož patofyziologii se podílí několik procesů, které
však nejsou univerzálně zastoupeny u jednotlivých pacientů, proto je klinický obraz
a prognóza onemocnění rozdílná (Hartung et al., 2004). Zánětlivé postižení CNS je
považováno za klíčové pro aktivitu onemocnění a formaci akutních lézí. V těchto aktivních
lézích nacházíme aktivované T-lymfocyty, především cytotoxické, aktivovanou mikroglii,
makrofágy a plazmatické buňky.
Nositelem imunologické specifity jsou lymfocyty, které jsou schopné svými antigenspecifickými
receptory rozpoznat příslušný antigen a zahájit specifickou imunitní reakci.
Pokud T-lymfocyt antigen rozpozná, dojde k jeho aktivaci a další diferenciaci s následnou
klonální proliferací.
Podle povrchového znaku se T-lymfocyty dělí na CD4+ a CD8+T lymfocyty. Oba
tyto typy se mohou po proběhnutí primární imunitní odpovědi dlouhodobě uchovávat
v organismu jako paměťové T-lymfocyty, které zajišťují imunologickou paměť pro
specifické patogeny (Hořejší V, 2009). Dále rozlišujeme T-regulační lymfocyty,
NK-T-lymfocyty a gd T-lymfocyty (http://www.tcells.org/scientific/gdtcells).
Lymfocyty nesoucí povrchový znak CD4+ rozdělujeme podle spektra cytokinů, které
produkují, na subpopulaci Th-1, Th-2 a Th-17. Th2 buňky produkují protizánětlivé cytokiny
(IL-4, IL-10, IL-13, TGFβ, IL-5, IL-35) a tlumí zánětlivou reakci, naopak Th-1 cytokiny
(IL-2, IL-12, IFNγ, TNFα) a Th17 (IL-17, IL-6, IL-21, IL-22, IL-23, TNFα) jsou prozánětlivé
a jsou považovány za rozhodující v iniciaci a udržování imunopatologické zánětlivé buněčné
reakce. Cytokin IL-12 je produkován makrofágy a dendritickými buňkami, které jsou
stimulované některými mikroorganismy. Naproti tomu cytokin IL-4 je produkován bazofily
a mastocyty. Pokud je proces zahájen na úrovni makrofágů, které produkují IL-12, dojde
ke stimulaci Th-1 imunitní odpovědi. Začne-li proces probíhat na úrovni bazofilů nebo
mastocytů, které produkují hlavně IL-4, dojde ke stimulaci a další produkci TH2 cytokinů.
Aktivace CD4+ lymfocytů vede také k rozvoji T-regulačních buněk produkujících
imunosupresivní cytokiny, které silně potlačují autoreaktivní imunitní odpověď (Hořejší V,
2009). CD8+ T lymfocyty rozpoznávají antigeny prezentované molekulami HLA I. třídy.
Aktivované CD8+ lymfocyty vyzrávají v cytotoxické T buňky, které jsou schopné ničit buňky
infikované viry nebo jinými intracelulárními mikroby a dysfunkční nebo zničené buňky.
44
T-lymfocyty svou aktivací zahájí spolupráci také s B-lymfocyty, které se transformují
v plazmatické buňky, jež se také významně podílí na destrukci myelinu.
K aktivaci a klonální proliferaci autoagresivních CD4+ T-lymfocytů a cytotoxických
CD8+ T-lymfocytů dochází na periferii. Jedná se o autoimunitní odpověď přímo proti CNS
antigenům, zejména MBP, myelinovému asociovanému glykoproteinu (MAG), MOG, PLP
a sekundárním autoantigenům, u kterých nacházíme podobnou sekvenci aminokyselin jako
u některých virů, např. herpetických (Obr. 14).
Obr. 14 Molekulární mimikry u RS
Zdroj: Multiple Sclerosis: Epidemiology, Genetics and Environmental Factors: www.msforum.net.
Tyto T a B-lymfocyty migrují přes HEB do CNS, kde dochází k jejich další klonální
proliferaci, atrahují makrofágy, dochází k aktivaci mikroglie, B-lymfocytů, produkci
protilátek, zánětlivých mediátorů, chemokinů a cytokinů (Martin et al., 2000) (Obr. 15, 16).
V ložisku zánětu dochází k rozpadu myelinu a postižení axonů. Demyelinizované vlákno
ztrácí schopnost vedení elektrického vzruchu. Dochází však také k primární axonální
degeneraci nezávisle na stupni zánětlivého postižení, jejíž etiopatogeneza není dosud
uspokojivě objasněna. (Brück, 2005; Brück, 2007).
Migrace autoagresivních zánětlivých buněk do CNS přes HEB, která není za
normálních okolností propustná pro lymfocyty a další buňky imunitního systému, má zásadní
význam pro formování zánětlivých RS lézí (Hartung et al., 2004). Důležitou roli v tomto
procesu mají adhezivní molekuly, chemokiny a matrix metalloproteinázy (MMPs) (Bar-Or et.
al., 2003).
45
Obr. 15 Aktivní demyelinizační RS plaka s makrofágy obsahující degradační
produkty myelinového oligodendrocytárního glykoproteinu ve své cytoplasmě.
Zdroj: Dr.Wolfgang Brück, Germany
Obr. 16 Aktivní demyelinizační RS plaka s makrofágy obsahující degradační
produkty myelinového bazického proteinu ve své cytoplasmě.
Zdroj: Dr.Wolfgang Brück, Germany
46
6 Matrix metalloproteinázy
6.1 Definice
MMPs jsou enzymy, které jsou schopné degradovat většinu proteinových složek
základní mezibuněčné hmoty-extracelulární matrix (ECM) (Chandler et al., 1995, Bar-Or et.
al., 2003). Je známo nejméně 23 MMPs; všechny mají katalytické jádro, které obsahuje na
aktivním místě molekulu zinku (Brinckerhoff and Matrisian, 2002).
Uplatňují se v remodelaci tkání, účastní se celé řady proteolytických procesů za
normálních i patologických stavů. Slouží jako efektor buněčné migrace, cytotoxicity
a spolupodílí se téměř na všech procesech ontogeneze (Bar-Or et al., 2003; Brinckerhoff and
Matrisian, 2002).
V dospělosti je exprese MMPs většinou nízká a jen lokálně zvýšená, např. při tkáňové
regeneraci a remodelaci. U různých patologických stavů, např. u zánětlivých procesů, lupusu
erythematodes, revmatoidní artritidy, kardiovaskulárních, plicních onemocnění, kožních,
systémové sklerózy pak dochází jejich zvýšené produkci (Ram et al., 2006). U nádorových
procesů hraje významnou roli porušení bazální membrány a intersticiální ECM, vedoucí
k růstu tumorů a metastázám (Egeblad and Werb, 2002).
6.2 Rozdělení MMPs
MMPs dělíme podle struktury a substrátové specifity do pěti základních skupin
(Tab. 5). Poprvé byla popsána intersticiální kolagenaza (MMP-1) v roce 1962, která se podílí
na resorpci kolagenu. MMPs štěpí většinu komponent ECM (fibronektin, myelinový protein,
vitronektin, laminin, tenascin, agrekan a jiné) a také kolagen typu I, II, III, IV, V, VI, VII,
VIII, IX, X, XIV. Kromě vazivové tkáně a složek ECM selektivně štěpí také inhibitory
proteináz, např. α1-inhibitor proteináz, α2-makroglobulin a antitrombin III a růstové faktory,
např. IL-1alfa a TNF-alfa. Jednotlivé MMPs jsou vůči těmto substrátům různě aktivní
(Emdbiosciences.com).
Aktivita MMPs je regulována na několika úrovních a kontrolována endogenními
inhibitory-tkáňovými inhibitory metalloproteináz (TIMPs). Jsou známy čtyři různé tkáňové
inhibitory-TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 a TIMP-4. Tyto proteiny se váží nekovalentně
k aktivovaným MMPs a blokují jejich aktivitu (Birkedal-Hansen et al., 1993).
47
Tab. 5 Rozdělení MMPs podle struktury a substrátové specifity do skupin
Kolagenázy MMP-1, MMP-8, MMP-13 a MMP-18, štěpí intersticiálnífibrilární
kolagen a kolagen typu I, II, III, VI, X.
Gelatinázy gelatináza A (MMP-2) a gelatináza B (MMP-9). Štěpí
bazální nefibrilární membránu, kolagen typu IV, laminin a
fibronectin, které jsou hlavními složkami bazální
membrány mozkových cév.
Stromelysin MMP-3, MMP-10 a MMP-11 štěpí celou řadu
makromolekul, např. fibronectin, laminin, kolagen typu IV,
V, alfa-1 inhibitor proteázy.
Membránový typ MMPs MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24 a MMP-25.
Obsahují transmembránovou a furinovou vazebnou
doménu a aktivují MMP-2.
Matrilysin MMP-7 a MMP-26. Je složen pouze z propeptidové oblasti
a katalytické domény, degraduje většinu složek ECM. Štěpí
fibronectin, laminin, vitronectin, kolagen typu IV,
fibrinogen a aktivuje MMP-9.
6.2.1 Matrix metalloproteináza-9 a matrix metalloproteináza-2
Řadíme je mezi gelatinázy, neboť štěpí gelatin a kolagen typu IV. Je exprimována
různými typy buněk-lymfocyty, monocyty, makrofágy, polymorfonukleárními leukocyty,
endoteliálními buňkami, keratinocyty, mnoha maligními a transformovanými buňkami (Salo
et al., 1991, Birkedal-Hansen et al., 1993). Její exprese a aktivita je regulována na různých
úrovních: genové transkripce, translace, syntéze, sekrece, aktivace, inhibice a glykosylace
(Ram et al., 2006). Je stimulována působením cytokinů, chemokinů a růstovými faktory (Salo
et al, 1991). MMP-9 je secernována jako proenzym, který je následně aktivován proteázami,
aktivovanými neutrofily a MMP-2. Její aktivita je inhibována nejen specifickým tkáňovým
inhibitorem TIMP-1, ale též nespecifickými inhibitory, například alfa-2 makroglobulinem
(Ram et al., 2006).
Degraduje kolagen typu IV, který je hlavní součástí bazální membrány (Seltzer et al.,
1989). Tím je umožněn průnik T-lymfocytů a dalších imunitních buněk do poškozených nebo
48
okolních tkání. Je pravděpodobné, že v důsledku štěpení může dojít ke vzniku neo-epitopů,
které navozují další imunitní odpověď a progresi onemocnění (Ram et al., 2006).
MMP-9 ovlivňuje řadu patologických procesů u autoimunitních onemocnění - např.
roztroušené sklerózy, systémového lupusu, revmatoidní artritidy, Sjőgrenov syndromu,
systémové skleróze, polymyositidě a arterioskleróze.
Byla nalezena ve fibroblastech kůže, keratinocytech, chondrocytech, endoteliálních
buňkách, monocytech, lymfocytech, osteoblastech a v mnoha dalších normálních
i transformovaných buňkách (Seltzer et al., 1981; Salo et al., 1991). Obě gelatinázy mají
podobné vlastnosti, zejména vysokou afinitu ke gelatinu a účastní se také biologické
degradace bazálních membrán (Seltzer et al., 1989). Exprese MMP-2 je často spojena
s růstem invazivních a metastazujících tumorů (Liotta et al., 1979). Gelatinázy se liší vazbou
proenzymů na tkáňové inhibitory. Proenzym MMP-9 se váže na TIMP-1, zatímco proenzym
MMP-2 na tkáňový inhibitor metalloproteinázy-2 (TIMP-2) (Goldberg et al., 1989).
6.3 Struktura genů pro MMPs
Gen pro MMP-9 o velikosti (26-27 kbp) je lokalizován na dlouhém raménku
20. chromozomu (20q11.2-13.1). Obsahuje tři exony s 13 kódujícími oblastmi, jejichž
transkripcí vzniká 92kDa protein MMP-9, označovaný jako gelatináza B (Huhtala et al.,
1990 a; Huhtala et al., 1991). Transkripce genu pro MMP-9 je regulována růstovými
faktory a cytokiny.
Gen pro o MMP-2 je lokalizován na dlouhém raménku 16. chromozomu (16q13) a čítá
17 kb s 12- ti introny a 13 kódujícími oblastmi, jejichž transkripcí vzniká 72kDa protein
MMP-2, označovaný jako gelatináza A (Huhtala et al., 1990 b). Transkripce genu pro
MMP-2. Transkripcí genů pro MMPs vzniká messenger-ribonukleová kyselina (mRNA),
která je v buněčném prostředí relativně stabilní, poločas rozpadu se pohybuje v rozmezí 12 až
150 hodin (Brinckerhoff et al., 1986).
Gen pro TIMP-1 se nachází na chromozomu X11p11.23- p11.4. Jeho exprese je
stimulována celou řadou mediátorů, např. TNF-α, interleukinem-1 (IL-1), estery formolu,
retinoidy a glukokortikoidy (Clark et al., 1987). Gen pro TIMP-2 je lokalizovaný na
17q23-q25 chromozomu (Huebner et al., 1986), jeho transkripce je snížena působením TGF
(Stetler-Stevenson et al., 1990). Struktura genů pro MMPs je zobrazena na Obr. 17.
49
Obr. 17 Struktura exonu lidské 92K GL (MMP-9), 72K GL (MMP-2), FIB-CL (fibroblast-type
kolagenázy) a rat SL-1 (stromelysinu-1)
Zdroj: Převzato od Huhtala P, Tuuttila A, Chow LT, Lohi J, Keski-Oja J, Tryggvason K: J Biol Chem 1991;
266:16485-90.
Human-Lidský; Rat-Krysa
6.4 MMPs u roztroušené sklerózy
Nízká nebo nedetekovatelná hladina MMPs je přítomna v CNS i za normálních
okolností, ke zvýšení její hladiny dochází při různém postižení CNS (Bar-Or et al., 2003).
U RS se podílí na rozrušení HEB a tím umožňují migraci aktivovaných T-lymfocytů,
zánětlivých buněk, plazmatických proteinů, autoprotilátek a komplementu do CNS a infiltraci
lézí (Martin et al., 2000). V CNS ničí MBP (Proost et al., 1993; Chandler et al., 1995;
Leppert et al., 1998; Ram et al., 2006). Bylo prokázáno, že MMP-9, MMP-2, SL-1,
intersticiální kolagenáza a matrilysin štěpí MBP in vitro (Proost et al., 1993; Chandler et al.,
1995). Navíc uvnitř CNS tumor necrosis factor alfa konvertující enzym (TACE), membránově
vázaná disintegrin metalloproteináza (ADAM-17) je schopna transformovat membránově
vázaný prekursor TNF-alfa do jeho vyzrálé, biologicky aktivní formy (Black et al., 1997;
Moss et al., 1997). Tento zánětlivý cytokin je toxický pro oligodendrocyty (Hartung 1996;
Soliven and Szuchet, 1995; Yuschenko et al., 2003; Ram et al., 2006).
Dosud není jasné, které MMPs hrají hlavní roli v imunopatogeneze RS (Bar-Or et. al.,
2003). V mozkové tkáni, mozkomíšním moku a séru nemocných s RS bylo popsáno zvýšení
MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9 a MMP-12 (Anthony et al., 1997; Vos et al.,
2003; Kurzepa et al., 2005). MMPs jsou produkovány širokým spektrem buněk (Chandler et
al., 1995; Bar-Or et al., 2003). Klíčovou roli hrají pravděpodobně MMPs exprimované
v T-lymfocytech a monocytech. Bylo prokázáno, že T-lymfocyty a makrofágy produkují
gelatinázy, MMP-2 a MMP-9 (Welgus et al., 1990; Leppert et al., 1995). Bylo zjištěno, že
migrační kapacita Th buněk izolovaných z periferní krve je závislá na přítomnosti gelatináz.
50
Th1 buňky, které mají vyšší migrační schopnost než Th2 buňky, produkují větší množství
gelatinázy B (MMP-9) a gelatinázy A (MMP-2) (Abraham et al., 2005) než Th2 buňky.
Monocyty migrují rychleji přes HEB než T a B lymfocyty. V CNS se transformují na
makrofágy a mikroglie, které tvoří hlavní skupinu zánětlivých buněk v aktivních
demyelinizačních plakách a jejich počet převažuje až 10x nad lymfocyty (Bar-Or et al.,
2003). Byla nalezena zvýšená exprese MMP-2, MMP-14 a TIMP-2 monocyty u pacientů s RS
ve srovnání se zdravými jedinci (Bar-Or et. al., 2003). Astrocyty a mikroglie mohou být též
stimulovány k produkci gelatináz, stejně jako jiných MMPs, například stromelysinu (Leppert
et al., 1998).
Řada současných studií se zabývá vztahem mezi hladinami MMPs v séru
a mozkomíšním moku u RS a také průběhem a aktivitou onemocnění. Byla prokázána
zvýšená hladina MMP-9 v séru nemocných s RS ve srovnání se zdravými jedinci (Abraham et
al., 2005; Goodin et al., 2002; Lindberg et al., 2001; Leppert et al., 1998; Waubant et al.,
2003). Bylo zjištěno, že aktivita některých MMPs koreluje s průběhem onemocnění (Bar-Or
et al., 2003; Lindberg et al., 2001). U RR RS byla prokázána zvýšená hladina MMP-9
a MMP-9/TIMP-1 ratio v séru (Avolio et al., 2003). Bylo zjištěno, že hladina MMP-9 v séru
koreluje s počtem gadolinium-enhancement lézí (Lee et al., 1999; Goodin et al., 2002)
a předpokládá se, že je prediktivním ukazatelem aktivity nemoci (Waubant et al., 2003).
Zvýšená hladina MMP-9 v mozkomíšním moku byla nalezena u všech pacientů s RRRS, ale
pouze u 57 % pacientů s PPRS (Leppert et al., 1998).
Nálezy týkající se MMP-2 jako potenciálního biologického markeru aktivity a průběhu
onemocnění jsou rozporné. Byla nalezena zvýšená hladina MMP-2 v séru u PPRS a zvýšení
poměru MMP-2/TIMP-2 u SP RS a PP RS v souboru 42 nemocných (Avolio et al., 2003).
Galboiz však popsal zvýšenou expresi MMP-2 mRNA u RRRS v souboru 16 nemocných
ve srovnání s nálezem u 12 nemocných s SP RS (Galboiz et al., 2001). Studie, které by se
zabývaly vztahem mezi hladinami MMP-9, MMP-2 a jejich inhibitorů v séru, stupněm
postižení a tíží onemocnění, dosud nebyly provedeny.
Exprese a aktivita MMPs je regulována na různých úrovních (Yuschenko et al., 2003):
genové exprese, aktivace proenzymu, sekrece enzymu, je inhibována specificky tkáňovými
inhibitory a nespecificky alfa-2 makroglobulinem. Dochází ke zvýšené expresi genů
kódujících tyto proteiny. Mutace těchto genů pravděpodobně ovlivňuje stupeň exprese,
stabilitu mRNA a vlastnosti daných proteinů, což může ovlivnit etiopatogenezi procesu.
Mezi kandidátní geny, u kterých předpokládáme účast v patofyziologii RS, řadíme
geny pro MMP-9, MMP-2, TIMP-1 a TIMP-2. Dosud bylo provedeno pouze několik
51
asociačních studií, zabývajících se vztahem genetických polymorfismů lokalizovaných v genu
pro MMP-9 s RS (Fiotti et al., 2004; Nelissen et al., 2000; Nelissen et al., 2002; Živkovič et
al., 2007). Polymorfismy -1562 C/T a R279Q v genu pro MMP-9 mají v populaci frekvenci
vyšší než 5 % a bylo zjištěno, že polymorfismus -1562 C/T v promotorové oblasti genu
MMP-9 je asociován se zvýšenou expresí MMP-9 (Zhang et al., 1999). U MMP2 bylo
popsáno několik polymorfismů v promotorové oblasti genu (Vašků et al., 2004, Zhang et al.,
1999). Jedná se o polymorfismy MMP-2 (-168 G/T, -735 C/T, -1306 C/T, -1575 G/A).
Polymorfismus -1306 C/T je asociován se změnou promotorové aktivity, kterou silně snižuje
alela T následkem přerušení Sp1-vazebného místa (Zhou et al., 2004). Polymorfismy TIMP-2
(+853 G/A a -418 G/C) jsou kódovány genem lokalizovaným na chromozomu X 17q23-q25.
První se nachází na 3. exonu, druhý G/C nukleotid na pozici -418 promotorové oblasti. Byla
zjištěna asociace polymorfismu (+853 G/A) s těžkou chronickou obstrukční chorobou
bronchopulmonální a s výskytem aneurysmat břišní aorty (Hirano et al., 2001; Wang et al.,
1999). Asociační studie zabývající se vztahem genetických polymorfismů lokalizovaných
v genu pro MMP-2 a TIMP-2 s RS nebyly dosud provedeny.
7 Klinická manifestace roztroušené sklerózy
Onemocnění se nejčastěji klinicky manifestuje akutně vzniklými neurologickými
příznaky, které jsou podmíněny vzplanutím zánětu v CNS. Jde se o tzv. ataku, neboli relaps.
Ataka je definována vznikem nových nebo zhoršením stávajících symptomů, které trvají 24
hodin a více, bez současné koincidence s infekčním onemocněním či teploty. Po několika
týdnech následně dochází ke zlepšení klinického postižení. Může být úplné, většinou však
přetrvává určitý stupeň neurologického deficitu. Po proběhlé atace následuje různě dlouhé
období remise bez nových klinických příznaků, které může trvat i několik let (McDonald et
al., 2001). První ataku onemocnění je nazývána klinicky izolovaný syndrom (CIS). Při rozvoji
další ataky dojde ke konverzi do klinicky jisté RS (CDMS). Mc Donaldova kritéria definují
další podmínky, které umožňují stanovení diagnózy RS již po první atace klinických příznaků
v případě, že jsou splněna kritéria paraklinická (abnormity specifické pro RS na MR či
výsledky analýzy mozkomíšního moku). Onemocnění asi u 85 % nemocných probíhá jako
relaps-remitentní RS (RR RS) (Achiron A, 2004), která je charakterizována střídáním
klinických atak, po kterých následuje různě dlouhé období remise. V období remise
neurologický deficit nenarůstá. V ložisku zánětu však postupně během let dochází k
52
demyelinizaci a v různé míře i k postižení axonů. Ve chvíli, kdy dojde k vyčerpání rezervní
kapacity CNS, dochází k ireverzibilnímu neurologickému postižení. Onemocnění proto
u velké části RR RS pacientů (8 z 10-ti) přechází během 10–15 let do sekundárně chronickoprogresivní
formy (SP RS) s inkompletní úzdravou po každé atace a pozvolna narůstá tíže
klinického postižení a stupeň invalidity (Obr. 18).
Mezi velmi časté první příznaky onemocnění řadíme optickou neuritidu, motorické
parézy a senzitivní příznaky. Dochází také k postižení ostatních hlavových nervů, setkáváme
se s periferní parézou lícního nervu, internukleární oftalmoplegií či neuralgií trigeminu. Mezi
další frekventní symptomy, se kterými se u nemocných s RS setkáváme je postižení mozečku.
Pokud je plaka lokalizovaná v podkorové oblasti, může navodit také epileptický paroxysmus.
Velmi obtěžující jsou poruchy sfinkterových funkcí charakteru – imperativní mikce, retence
či inkontinence a jejich kombinacemi. Asi 60 % mužů trpí v průběhu RS erektilní dysfunkcí.
Dalším příznakem, který velmi limituje práceschopnost a později i schopnost sebeobsluhy
nemocných je patologická únava, která je přítomna asi u 85 % pacientů. K těmto projevům se
přidávají psychické problémy, zejména deprese, rozmrzelost, emoční labilita, méně často
euforie, poruchy paměti a soustředění (Hartung et al., 2004).
Asi u 10 % pacientů dochází od počátku choroby k pozvolnému, kumulativnímu
zhoršování klinického stavu bez přítomnosti atak. Jedná se o primárně progresivní RS (PP
RS) (Achiron A, 2004). Asi u 3 % pacientů může mít onemconění velmi agresivní průběh
s těžkými relapsy s nedostatečnou úpravou a rychlým rozvojem neurologického deficitu, jde
o relabující progresivní RS. Zřídka může nemoc probíhat benigně a nedochází k rozvoji atak
či nárůstu invalidity ani po mnoha letech. V současné době však bohužel neexistují žádné
biomarkery, které by umožnily tento průběh prospektivně stanovit.
Nejvíce používanou škálou objektivního hodnocení klinického stavu je Kurtzkeho
stupnice postižení (Expanded Disability Status Scale), známá též jako EDSS či Kurtzkeho
škála (Kurtzke JF, 1983). Kvantifikuje tíži postižení těchto funkčních systémů: zraku,
motoriky, kmenových, mozečkových, senzitivních funkcí, sfinkterů a zahrnuje také orientační
hodnocení kognitivního postižení a únavy.
53
Obr. 18 Klinický průběh roztroušené sklerózy
Zdroj: Curr Opion Neurol. 1999; 12:295.
Time-čas; Relapses-ataky; Cognitive dysfunction-kognitivní dysfunkce; Accumulated MRI lesion Burdenkumulace
MR lézí; Acute (new and GD+) MRI activity-akutní (nová a GD+MRI aktivita); Level of Disabilitystupeň
postižení; Brain volume-mozkový objem; T1, BH lesion load- T1 objem lézí, BH (Black hole)-černá díra;
GD-gadolinium; MRI-zobrazení magnetickou rezonancí.
54
8 Diagnostická kritéria roztroušené sklerózy
Do roku 2001 byla používána v diagnostice RS Poserova a pozdější Schumacherova
kritéria. Po zavedení magnetické rezonance (MR) do klinické praxe byla definována kritéria
McDonaldova (McDonald et al., 2001). Byla vytvořena v roce 2001 na základě doporučení
mezinárodního konsenzu ve spolupráci s americkou National Multiple Sclerosis Society
(NMSS). Tato kritéria ulehčují diagnostiku využitím pokroku v technikách MR (Obr. 17).
McDonaldova kritéria byla revidována v roce 2005, 2010 (Polman et al., 2005; Polman et al.,
2011). Poslední revize byla provedena v roce 2017 (Thompson et al., 2018) (Tab. 6). Pomocí
MR je možné hodnotit diseminaci onemocnění v prostoru a čase. Longitudinální sledování
MR nálezů umožňuje průkaz nových, subklinických lézí i při absenci klinické ataky a tím
naplnění diagnostických kritérií diseminace v prostoru či čase (Tab. 7). Význam MR
vyšetření ale nelze nadhodnotit, diagnostika onemocnění musí být komplexní a založena
zejména na hodnocení klinického stavu, historie onemocnění, zobrazovacím vyšetření,
vyšetření mozkomíšního moku, evokovaných potenciálů a dalších. Pozitivní nález
demyelinizačních změn na MR může být totiž v některých případech prokázán i bez
přítomnosti klinických známek choroby, tj. přítomnosti relapsů nebo progresivního
neurologického postižení. Další pomocná vyšetření, např. Již zmíněné evokované potenciály
nebo vyšetření likvoru poskytují podrobnější informace o probíhajícím zánětlivém procesu
v CNS. Stávající kritéria bohužel neumožňují stanovit diagnózu v případě, že se jedná
o pravděpodobné onemocnění. Longitudinální studie, které by sledovaly vývoj nemoci
u tohoto typu pacientů nebyly dosud provedeny.
55
Tab. 6 Diagnostická kritéria roztroušené sklerózy: revidovaná McDonaldova
diagnostická kritéria z roku 2017.
Klinická kritéria (ataky) Objektivní (léze) Další údaje potřebné ke
stanovení DG
2 nebo více Objektivní klinický průkaz ≥ 2
lézí
Žádné. Klinická symptomatika
stačí; další doklady jsou žádoucí,
musí být v souladu s RS
2 nebo více Objektivní klinický průkaz 1 léze
s jasným anamnestickým
průkazem předchozí ataky
v rozdílné anatomické lokalizaci
Žádné. Klinická symptomatika
stačí; další doklady jsou žádoucí,
musí být v souladu s RS
2 nebo více Objektivní klinický průkaz 1 léze Diseminace v prostoru (další
klinická ataka v jiné lokalizaci
CNS nebo aktivita na MR)
1 Objektivní klinický průkaz ≥ 2
lézí
Diseminace v čase (další klinická
ataka nebo aktivita na MR nebo
přítomnost specifických OP pásů
v mozkomíšním moku)
1 Objektivní klinický průkaz 1 léze Diseminace v prostoru (další
klinická ataka v jiné lokalizaci
CNS nebo aktivita na MR) a
diseminace v čase (další klinická
ataka nebo aktivita na MR nebo
přítomnost specifických OP pásů
v mozkomíšním moku)
0 (progrese od počátku) Rok progrese nemoci nezávisle
na klinické atace (retrospektivně
nebo prospektivně)
A nejméně dvě následující
kritéria.
-Jedna nebo více T2hyperintenzních
lézí
charakteristických pro
roztroušenou sklerózu v jedné
nebo více oblastí mozku:
periventrikulárně, kortikálně nebo
juxtakortikálně, nebo
infratentoriálně
-Dvě nebo více hyperintenzních
lézí v míše
-Přítomnost oligoklonálních pásů
v mozkomíšním moku
56
Tab. 7 Revidovaná McDonaldova diagnostická kritéria (2017)
MR kritéria diseminace v prostoru a čase
Průkaz diseminace lézí v prostoru (DIS) ≥ 1 T2 hyperintenzní léze charakteristické pro
roztroušenou sklerózu nejméně ve dvou ze čtyř
oblastí CNS; periventrikulární, kortikální či
juxtakortikální, infratenoriální nebo míšní.
Průkaz diseminace lézí v čase (DIT) Současná přítomnost lézí sytících se gadoliniem a
nesytících se lézí v jakoukoli dobu nebo nová T2hyperintenzní
či léze sytící se gadoliniem na
následné MR ve srovnání s předchozím vyšetřením
nezávisle na načasování prvního skenu.
Na rozdíl od McDonaldových kritérii z roku 2010 nejsou rozlišovány symptomatické a
asymptomatické MR léze.
a) b)
Obr. 19 Pacientka s pokročilým demyelinizačním postižením s typickým obrazem
mnohočetných periventrikulárních ložisek. a) T2 obraz, b) Flair-Dawsonovy prsty.
Zdroj: Snímky magnetické rezonance poskytl MUDr. Miloš Keřkovský, Ph.D., Radiologická klinika FN Brno.
57
Výzkumné práce
1 Cíle práce
1.1 Genetická studie
1. Analýza genetických polymorfismů v kandidátních genech, stanovení frekvence alel
a genotypové distribuce ve studovaném souboru.
a) Polymorfismu rs3135388 v genu pro HLA-DRB1*1501
b) Polymorfismů (-1562C/T, R+279Q) lokalizovaných v kandidátním genu pro
MMP-9
c) Polymorfismů (-1306C/T, -1575G/A, -168G/T, -735C/T) lokalizovaných v
kandidátním genu pro MMP-2
d) Polymorfismu +853G/A v genu pro TIMP-2
e) Polymorfismu rs6897932 v genu pro IL7RA
f) Polymorfismů rs4516035, rs2228570, rs731236, rs7975232, rs1544410
v genu pro VDR
g) Polymorfismů (-6) A/G a M235T v genu pro ATG a ACE I/D
2. Určit asociační vztah genetických polymorfismů lokalizovaných v kandidátních genech
s vnímavostí k RS.
3. Nalézt možné rozdíly mezi pohlavími ve vnímavosti k RS.
4. Zjistit, zda tyto kandidátní genetické polymorfismy ovlivňují tíži a průběh onemocnění
a stupeň postižení.
5. Zjistit potenciální interakci mezi genetickými polymorfismy rs4516035 a rs3135388
1.2 Studie hladin enzymů
Stanovení hladin enzymů MMP-9, MMP-2 a jejich tkáňových inhibitorů-TIMP-1
a TIMP-2 v séru a zhodnotit jejich vztah ke klinickému průběhu, stupni postižení a tíži
onemocnění.
58
1.3 HYPOTÉZA
V současnosti nejsou k dispozici dostatečně spolehlivé biomarkery, které by
umožňovaly zjistit vnímavost daného jedince k rozvoji RS, diagnostické a prediktivní
markery další progrese onemocnění ani individuální odpovídavosti na terapii. Nejsou také
dostatečně objasněny faktory, které podmiňují zvýšenou vnímavost žen k onemocnění.
Zjištění rizikových genetických polymorfismů může poskytnout důležité informace o
patogeneze onemocnění a nalézt jednotlivce se zvýšeným rizikem. Slibnými kandidáty jsou
geny a jejich varianty, tzv. polymorfismy, které se významně podílí v imunopatogenezi
onemocnění a podstatně přispívají k interindividuálním rozdílům. Jedná se zejména o
variabilitu genů, které kódují proteiny autoimunitního zánětlivého procesu; enzymů, které se
podílí na zvýšení propustnosti HEB pro zánětlivé buňky a variabilitu genu pro vitamin D. V
naší práci jsme vyšetřili genetické polymorfismy těchto kandidátních genů: HLA-RB1*1501,
VDR, IL7RA, MMP-9, MMP-2, TIMP-2 a ATG.
Zásadní roli v iniciaci imunitní odpovědi má HLA (Akkad et al., 2015; Lincoln et al.,
2005; Prat et al., 2005; Sadovnic 2012; Sawcer et al., 2011; Schmidt et al., 2007). Zaměřili
jsme se na vyšetření variability funkčního genetického polymorfismu rs3135388, který
vysoce koreluje s alelou HLA DRB1*1501 (korelační koeficient r (2) >0.94) (Goris et al.,
2008). Tato alela se spolu s alelami DRB5*0101 a DQB1*0602 významně podílí na zvýšení
predispozice rozvoje nemoci zvýšením prezentace peptidů myelinu T-lymfocytům a antigenů
některých herpetických virů, zejména EBV (Alcina et al., 2012; Smith et al., 1998). Důležitou
roli hraje take vzájemná interakce alely HLA DRB1*1501 s vitaminem D.
Vitamin D je velmi důležitým environmentálním faktorem, který prostřednictvím
VDR navozuje silné antiproliferativní, prodiferenciační a imunomodulační účinky (Munger et
al., 2006; Munger et al., 2014; Simon et al., 2012). Je exprimovaný T- buňkami a APCs a je
tak zapojený do regulace imunitního systému (Cantorna et al., 2015; Correale et al., 2009;
Joseph et al., 2012; Mahon et al., 2003; Royal et al., 2009; Smolders et al. 2009). VDR po
své aktivaci slouží take jako transkripční faktor regulující expresi více než devíti set 1.25
(OH)2 D3 responzivních genů (Kongsbak et al., 2013; Wang et al., 2005) včetně HLADRB1*15
(Agliardi et al., 2011, Ramagopalan et al., 2009). Zaměřili jsme se proto na
vyšetření funkčního promotorového genetického polymorfismu rs4516035 v genu pro VDR,
který nebyl dosud v souvislosti s RS studován. Snažili jsme se zjistit, jestli existuje vzájemná
vazba mezi alelami rs3135388 a rs4516035 ve vztahu k RS.
59
Dalším důležitým patofyziologickým procesem, který podmiňuje rozvoj a progresi
onemocnění je porušení HEB, umožňující přestup zánětlivých buněk do CNS. Zde se
významně uplatňují MMPs (Bar-Or et al., 2003; Larochelle et al., 2011; Mirshafiey et al.,
2014). Jedná se zejména o MMP-9 a MMP-2, jejichž exprese byla prokázána v Tlymfocytech,
B-lymfocytech a monocytech, které jsou hlavní populací zánětlivých buněk v
aktivních demyelinizačních plakách, v chronických lézích pak převažuje aktivovaná
mikroglie a B- lymfocytární subpiální folikulární infiltrace, která podmiňuje chronický zánět
a progresi onemocnění (Aung et al., 2015; Bar-Or et. al., 2003; Kurzepa et al., 2005;
Könnecke et al., 2013; Magliozzi et al.). Jejich exprese v CNS, hladina v séru a mozkomíšním
moku kolísá v závislosti na aktivitě, průběhu onemocnění a je ovlivněna léčbou (Goodin et
al., 2002; Mirshafiey et al., 2014; Shimizu et al., 2014; Waubant et al., 2003). Vyšetřili jsme
proto jednak hladiny MMPs v séru a genetické polymorfismy -1562 C/T, R+279Q
lokalizované v kandidátním genu pro MMP-9; jako první polymorfismy -1306C/T, -1575G/A,
-168G/T, -735C/T lokalizované v kandidátním genu pro MMP-2; a jako jediní také
polymorfismus +853G/A v genu pro TIMP-2.
Důležitou roli v procesu regulace propustnosti cévní a HEB, aktivace infiltrujících
imunokompetentních buněk, exprese prozánětlivých a prooxidačnich genů, zesílení
fagocytarní aktivity u makrofágů hraje také angioenzinogen (ATG) a angiotensin konvertující
enzym (ACE) (Hammack et. al., 2004; Stoop et al., 2009; Wosik et al., 2007). Proto jsme se
zabývali genetickým aspektem dané problematiky a vyšetřili jsme jako první dva funkční
polymorfismy v genu pro ATG; (-6) A/G v promotorové oblasti genu a M235T v exonu a
ACE I/D. ATG může ovlivnit onemocnění pravděpodobně aktivací zánětlivého procesu
(Platten et al., 2009).
Na progresi vlastního zánětlivého procesu se významnou měrou podílí prozánětlivé
cytokiny, mezi které patří IL-7 (Šterzl et al., 2005; Hořejší et al., 2009). Vyšetřili jsme
funkční genetický polymorfismus rs6897932 v genu IL7RA, který kóduje povrchový znak
CD127 receptoru IL-7 (Gregory et al., 2007). Ovlivňuje regulaci a vývoj lymfocytů,
podporuje proliferaci, diferenciaci a přežívání naivních T buněk, včetně regulačních a B
buněk. IL7RA je spolu s některými dalšími geny zapojen také do procesu enzymatického
procesu N-glykosylace, jehož narušení vede k aktivaci cytotoxických T-lymfocytů se ztrátou
tolerance pro vlastní antigeny. Významnou měrou se tak podílí v patogenezi onemocnění a
progresi zánětlivého procesu v RS plakách (Gregory et al., 2007; Mkjikian et al., 2011; Jäger
et al., 2013).
60
Předpokládáme, že bychom mohli nalézt asociační vztah výše uvedených
kandidátních genetických polymorfismů s RS a prokázat možné rozdíly mezi pohlavími ve
vnímavosti k rozvoji nemoci, neboť RS jako všechna ostatní autoimunitní onemocnění se
častěji vyskytuje u žen. Věříme, že se nám podaří nalézt parametry umožňující posoudit nejen
míru individuálního rizika vnímavosti k RS, ale také posoudit podíl genetické predispozice na
rozvoj a průběh tohoto onemocnění v české homogenní populaci. Očekáváme, že se nám
podaří nalézt vztah hladin MMP-9, MMP-2 a jejich inhibitorů v séru ke klinickému průběhu,
tíži onemocnění a stupni postižení.
Získané nálezy by mohly napomoci lepšímu porozumění úlohy HLA,
metalloproteináz, IL-7, vitaminu D a ATG v patofyziologii choroby. Zjištění rizikových alel
pro dané onemocnění může napomoci ve vývoji specifické terapie a přispět ke zjištění
individuální odpovědi pacientů na léčbu.
61
2. Materiál a metodika
2.1 Genetická studie
2.1.1 Soubor
Jedná se o studie typu case-control a genotypově fenotypové studie. Bylo do ní
zařazeno celkem 306 nemocných s RS, diagnostikovanou dle Mc Donaldových kriterií
(McDonald et al., 2001), kontrolní soubor byl tvořen 135 zdravými jedinci. Nemocní byli
rozděleni podle pohlaví a podle formy onemocnění do skupin na RR RS, SP RS a PP RS.
Klinický stav byl hodnocen pomocí Expanded Disability Status Scale (EDSS) (Kurtzke
1983). Stupeň postižení byl spočítán podle Multiple Sclerosis Severity Score (MSSS)
(Roxburgh et al., 2005).
Všichni pacienti byli vyšetřeni ve specializovaném centru pro RS stejným lékařem
(YB). Studie byla schválena etickou komisí FN Brno a všichni jedinci podepsali informovaný
souhlas před vstupem do studie.
2.1.2 Genetická analýza
Genotypizace byla provedena metodou polymerázové řetězové reakce (PCR)
a restrikční analýzou. DNA byla izolována z leukocytů periferní krve pomocí metody
s využitím proteinázy K. Izolace DNA spočívala v lýze buněk v roztoku, který obsahuje 10
mM tris- HCl (pH=8.5), 0,1% SDS, 0.1 mg/ml proteinázy K. Proteináza K byla odstraněna
extrakcí fenolem a po etanolové precipitaci a vysušení byl vzorek DNA rozpuštěn v TE pufru
(10 mM Tris-Cl pH=8.1 mM EDTA pH=8). Detekce polymorfismů byla provedena pomocí
PCR se specifickými primery a následné restrikční analýzy specifickými endonukleázami.
Popis metodiky je uveden v Tab. 8 a 9.
62
Tab. 8 Sekvence primerů, teplota pro připojení primerů
Polymorfismus Sekvence primerů
(sense/antisense)
PCR (teplota °C, čas)
HLA- DRBl*1501
rs3135388
5´ GTA GAG ATC TCC CAA CAA ATCGA-
5´ GAG TCG GTC CTG GGG AAT A-
95 /5´
95/50´´- 59/30´´-72/45´´ (30x)
72/10´
10/10´
MMP-9
-1562 C/T
5´ ATGCTCATGCCCGTAATCCT 3´
5´ TGGGAAAAACCTGCTAACAACT´3´
95/3´
94/30“- 65/20“- 72/40“(34x)
72/7´
10/10´
MMP-9
R+279Q
5´ CTCGCCCCAGGACTCTACAC 3´
5´ GTGCAGGCGGAGTAGGATT 3´
95/3´
94/20“-59,5/10“-72/10“(35x)
72/7´
10/10´
MMP-2
-1575 G/A
5´ ACTGACTCTGGAAAGTCAGAGCA 3´
5´ GGCACAGGGTGAGGGGATGG 3´
95/3´
94/50“-60/40“-72/50“(30x)
72/7´
10/10´
MMP-2
-1306 C/T
5´ CTTCCTAGGCTGGTCCTTACTGA 3´
5´ CTGAGACCTGAAGAGCTAAAGAGCT 3´
95/4´
95/45“- 48,6/35“- 72/45“(35x)
72/5´
10/10´
MMP-2
-735 C/T
5´-ATAGGGTAAACCTCCCCACATT-3´
5´- GTAAAATGAGGCTGAGACCTG-3´
95/5´
95/45“-59,2/45“-72/45“(35x)
72/7´
10/10´
MMP-2
-168 G/T
5´-CTGACCATTCCTTCCCGTTC-3´
5´-CGCCTGAGGAAGTCTGGAT-3´
95/5´
95/50“- 51/45“- 72/50“(35x)
72/7“
10/10´
TIMP-2
+853 G/A
5´-GCCCAGGGTGTTCTGGATGG-3´
5´- CTCCGGCTGATGGCCCCACT- 3´
96/ 3´
95/40“- 63,5 / 30“-72/40“(30x)
72/ 7‘
10/ 10‘
IL7RA
rs6897932
F 5´-GGG AGA TGG ATC CTA TCT TAC TGAR
5´ -TGT GGA AAT TCG CTG AGG AT-
95 /5´
95/45´´ 54,3oC /30´´ 72oC /35´´
[30x]
72 /10´
10 /10´
ATG
M235T
5´CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC -3´
5´CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT-3´
94/3´
94/30“-69/1´ (34×)
94/30“-69/7´
10/10‘
ATG
A (–6) G
5´AATAAGGCATCGTGACCC-3´
5´ACCTTCTGCTGTAGTACC-3´
95 /5´
95/30“-56/15“-72/15“ (30×)
72/3´
10/10‘
63
Tab. 9 Sekvence primerů, teplota pro připojení primerů
Polymorfismus Sekvence primerů
(sense/antisense)
PCR (teplota °C, čas)
FokI
rs2228570
5´AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT-3´
5´ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3´
95 /10´
95 /20´´- 69/30´´1o /1 -
72/30´´(14x)
95/30´´ -50 / 30´´ 72 / 30´´(20 x)
72/ 5´
10/10´
TaqI
rs731236
5´CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3´
5´GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC-3´
95 /10´
95 /20´´- 69/30´´1o /1 -
72/30´´(14x)
95/30´´ -50 / 30´´ 72 / 30´´(20 x)
72/ 5´
10/10´
ApaI
rs7975232
5´CAGAGCATGGACAGGGAGCAA3´
5´GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC3´
95 /10´
95 /20´´- 69/30´´1o /1 -
72/30´´(14x)
95/30´´ -50 / 30´´ 72 / 30´´(20 x)
72/ 5´
10/10´
BsmI
rs1544410
5´CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA3´
5´AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG3´
95 /10´
95 /20´´- 69/30´´1o /1 -
72/30´´(14x)
95/30´´ -50 / 30´´ 72 / 30´´(20 x)
72/ 5´
10/10´
EcoRV
rs4516035 C/T
5´CCTCCTCTGTAAGAGGCGAATAGCGAT- 3´
5´GGACAGGTGAAAAAGATGGGGTTC -3´
95 /10´
95 /20´´- 69/30´´1o /1 -
72/30´´(14x)
95/30´´ -50 / 30´´ 72 / 30´´(20 x)
72/ 5´
10/10´
64
Tab. 10 Restrikční enzymy, podmínky a délka PCR produktů pro analýzu genetických
polymorfismů v genech pro HLA- DRBl*1501, MMP-9, MMP-2, IL7RA, ATG a VDR
Polymorfismus Restrikční enzym Podmínky
Délka fragmentu (bp)
HLA- DRBl*1501
rs3135388
Cla I
5´AT↓CGAT
30oC 4h: PCR produkt 15,0μl,
H2O 2,6u, pufr M 2ul,
ClaI (10U/μl ) 0,4 μl
CC 206 / 206bp
TT 186, 20 / 186, 20bp
CT 206 / 186, 20bp
MMP-9
-1562C/T
Pae I
GCATG↓C
37°C 4h: PCR produkt 15ul,
H2O 2,7ul, pufr B+BSA 2ul, Pae I
3U
CC 329/329
TT 144,185/ 144,185
CT 329/ 144,185
MMP-9
R+279Q
Sma I
CCC↓GGG
30°C 4h: PCR produkt 15ul,
H2O 2,7ul, pufr Y+/Tango 2ul,
Sma I 3U
GG 22, 73 /22, 73
AA 95/ 95
GA 22, 73/ 95
MMP-2 -1306C/T XspI
C↓TAG
37°C 4h: PCR produkt 10ul,
H2O 3,2ul, pufr K 15ul, XspI 3U
CC 188, 5/188, 5
TT 162, 26,5/162, 26, 5
CT 188, 5/162, 26, 5
MMP-2 -1575G/A Tsp45I
↓GTG/CAC
65°C 4h: PCR produkt 15ul,
H2O 2,7ul, pufr NEB 1 2ul,
Tsp45I 1,2U
GG 113, 156/ 113, 156
AA 269/269
GA 113, 156/269
MMP-2
-735C/ T
HinfI G↓ANTC 37°C 4h: PCR produkt 15ul,
H2O 2,5ul, pufr R 2ul, HinfI 5U
CC 300/300
TT 45,255/45,255
CT 300/45, 255
MMP-2
-168G/ T
BseD I C↓CNNGG 55°C 4h: PCR produkt 15ul,
H2O 2,7ul, pufr Y/Tango 2ul,
BseD I 3U
GG 26,194,205/
26,194, 205
TT 26, 399/26,399
GT 26, 194, 205/26, 399
TIMP-2
+853G/A
Bsr I 65oC 4h: PCR produkt 15ul H2O,
2,5ul, pufr R 2ul, Bsr I 2,5U
GG 221/221
AA 61,160/ 61,160
GA 221/ 61,160
IL7RA
rs6897932
Mbo I 37oC4h: PCR
produkt 15,0μl H2O, 2,7ul, pufr
R 2,0 ul, MboI 10U
CC 115, 134 / 115,134
TT 24, 110, 115, / 24, 110,
115
CT 115, 134, / 24, 110, 115
ATG
M235T
Asp I 37 °C po 4 hod: produkt 15 μl,
H2O 2,5 μl, pufr B 2 μl, Asp 5 U
MM 165/165
TT 141, 24/141, 24
MT 141, 24/165
ATG
A (–6) G
BstNI 60 °C po 4 hod: produkt 15 μl,
H2O 2,5 μl, pufr NEB2 + BSA 2
μl, BstNI 5 U
AA 45, 20/45, 20
GG 65/65
AG 45, 20/65
EcoRV
rs4516035 C/T
EcoRV 37 °C po 4 hod: produkt 15 μl,
H2O 2,7 μl, pufr NEB2 + BSA 2
μl, EcoRV 0.3
CC 179/179
TT 152, 27/152, 27
C/T 179/152, 27
FokI
rs2228570
FokI 37 °C po 4 hod: produkt 15 μl,
H2O 2,7 μl, pufr NEB4 2 μl, FokI
0.3 μl,
GG 267/267
AA 193, 74/193, 74
G/A 267/193, 74
TaqI
rs731236
TaqI 65 °C po 4 hod: produkt 15 μl,
H2O 2,7 μl, pufr NEB4+BSA 2 μl,
TaqI 0.3 μl,
AA 496, 249/496, 249
GG 295, 249, 201/ 295, 249,
201
A/G 496 ,249/295, 249, 201
ApaI
rs7975232
ApaI 37 °C po 4 hod: produkt 15 μl,
H2O 2,7 μl, pufrB 2 μl, ApaI 0.3
μl,
AA 745/745
CC 532, 213/532, 213
A/C 745/532, 213
BsmI
rs1544410
BsmI 37 °C po 4 hod: produkt 15 μl,
H2O 2,7 μl, pufrR 2 μl,
Mva1269I 0.3 μl,
TT 813/813
CC 670, 143/670, 143
C/T 670, 143/813
65
2.2 Studie hladin enzymů
2.2.1 Soubor
Do studie byli zařazeno 87 nemocných s RS, diagnostikovanou dle Mc Donaldových kriterií,
kontrolní skupinu tvořilo 50 zdravých jedinců. Nemocní byli rozděleni podle průběhu nemoci
do skupin s RR RS, SP RS a PP RS formou onemocnění. Klinický stav byl hodnocen pomocí
EDSS, stupeň postižení byl spočítán podle MSSS. V době krevního odběru byli všichni
pacienti a kontrolní jedinci bez známek infekčního onemocnění a nemocní byli v klinicky
stabilizovaném stavu. Všichni pacienti byli vyšetřeni ve specializovaném centru pro RS
stejným lékařem (YB) Všichni jedinci podepsali informovaný souhlas před vstupem do
studie.
.
2.2.2 Stanovení hladin enzymů
Stanovení a kvantifikace hladin enzymů MMP-2, MMP-9, TIMP-2 a TIMP-1 bylo
provedeno metodou ELISA (enzyme-linked immunoassay). Byly použity tyto kity: MMP-9,
Human, Activity Assay RPN26; MMP-2, Human, Biotrak ELISA System RPN2617; TIMP-1,
Human, Biotrak ELISA System RPN2611 a TIMP-2, Human, Biotrak ELISA RPN2618,
podle instrukcí výrobce Amersham Biosciences UK (Buckinghamshire, UK). Jedná se
o jednoduché, specifické kvantitativní stanovení lidské MMP-2, MMP-9, TIMP-1 a TIMP-2
ze séra. Pacientům bylo odebráno 10 ml srážlivé krve, následně byla krev zcentrifugována
a sérum bylo zamraženo při teplotě -80 st C. Před vlastním stanovením bylo sérum ředěno.
Vzorky byly inkubovány v jamkách obsahujících anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-TIMP-2
a anti-TIMP-1 protilátky. MMP-2, MMP-9, TIMP-2 a TIMP-1 byla vázána v jamce na
peroxidázově značenou protilátku, inkubována 2 hodiny při teplotě 20–27 o
C a poté promyta.
Reakce byla ukončena přidáním kyselého roztoku, po obarvení byla měřena 450 nm spektro-
fotometrií.
66
3. Komentovaný soubor vlastních prací
Benešová Y, Vašků A, Štourač P, Hladíková M, Fiala A, Bednařík J.
Association of HLA-DRB1*1501 tagging rs3135388 gene polymorphism with multiple
sclerosis. J Neuroimmunol 2013; 255(1-2): 92-96. IF: 2.786
Resumé
Významnou roli v etiopatogenezi RS hraje genetická predispozice. Byla prokázána
asociace RS s DR2 haplotypem, zejména s alelou HLA-DRB1*1501. Alely DRB1*1501,
DRB5*0101 a DQB1*0602 se významně podílí na zvýšení predispozice rozvoje RS zvýšením
prezentace peptidů myelinu T-lymfocytům a antigenů některých herpetických virů, zejména
EBV. Vzájemná interakce může spustit patogenní proces prostřednictvím molekulárních
mimiker. Důležitou roli hraje take vzájemná interakce s VDR, neboť v proximální
promotorové oblasti alely HLA DRB1*1501 je lokalizován responzivní element pro vitamin
D. Bylo prokázáno, že genetický polymorfismus rs3135388 je markerem alely HLA
DRB1*1501 (r2
= 0.97). Cílem naší práce bylo vyšetřit tento genetický polymorfismus
a prokázat souvislost s vnímavostí k RS, zjistit případné rozdíly mezi pohlavími a ovlivnění
tíže onemocnění a stupně postižení v české populaci. Do studie bylo zařazeno 306
pacientů s RS, kontrolní soubor byl tvořen 132 zdravými jedinci. Byla zkoumána
distribuce genotypů a alel polymorfismu rs3135388.
Byl zjištěn signifikantní rozdíl v genové distribuci (Pg=3.06×10-9
) a alelové
frekvenci Pa=6.08×10−10
) mezi nemocnými RS a zdravými jedinci. Byla prokázána
statisticky významně vyšší vnímavost k RS u homozygotů AA a heterozygotů GA (OR=4.27,
95% CI: 2.64-6.92). Po rozdělení souboru podle pohlaví byl prokázán signifikantní rozdíl
pouze mezi nemocnými a zdravými ženami v genové distribuci (Pg=1.3×10−8
) a alelové
frekvenci (Pa=2.82×10−9
); (OR=5.11, 95 % CI: 2.86-9.15). U mužů signifikantní rozdíl
nalezen nebyl. Z našich výsledků tedy vyplývá, že distribuce polymorfismu rs3135388 může
determinovat genetickou vnímavost k rozvoji RS v české populaci, zejména u žen.
67
68
69
70
71
72
Benešová Y, Vašků A, Štourač P, Hladíková M, Beránek M, Kadaňka Z, Novotná H,
Bednařík J.
Matrix metalloproteinase-9 and matrix metalloproteinase-2 gene polymorphisms in multiple
sclerosis. J Neuroimmunol 2008; 205 (1-2): 105-109. IF: 3.158
Resumé
Matrix metalloproteinázy hrají důležitou roli imunopatogenezi RS. Významně se
podílí na progresi zánětlivého procesu, porušení hemato-encefalické bariéry, formování
zánětlivých RS lézí a demyelinizaci. Cílem této studie bylo určit asociační vztah
genetických polymorfismů (-1562 C/T, R+279Q) lokalizovaných v genu pro matrix
metalloproteinázu-9 (MMP-9) a polymorfismů (-1306 C/T, -1575 G/A) v genu pro
matrix metalloproteinázu-2 (MMP-2) s rizikem rozvoje RS; nalézt možné rozdíly mezi
pohlavími a zjistit, zda ovlivňují tíži onemocnění a stupeň postižení. Do studie bylo
zařazeno 244 pacientů s RS, diagnostikovanou dle Mc Donaldových kriterií, kontrolní
soubor byl tvořen 132 zdravými jedinci. Genotypizace byla provedena metodou
polymerázové řetězové reakce a restrikční analýzou. Klinický stav byl hodnocen pomocí
Expanded Disability Status Scale, stupeň postižení byl spočítán podle Multiple Sclerosis
Severity Score. Byl zjištěn signifikantní rozdíl alelové frekvence (Pa=0.01, Pacorr=0.05)
mezi skupinou pacientů s RS a zdravými jedinci v distribuci -1562 C/T polymorfismu
v genu pro MMP-9. Alela T se vyskytovala méně frekventně u pacientů s RS (OR-0.58, 95
% CI: 0.38-0.89). Signifikantní rozdíl byl také prokázán mezi nemocnými a zdravými
ženami (Pa=0.01, Pacorr=0.05), (OR-0.53, 95 % CI: 0.32-0.86). Naše výsledky prokazují
také frekventnější zastoupení homozygotů GG a heterozygotů GA v MMP-2 -1575G/A
genetickém polymorfismu ve skupině RS pacientů. Tato data nasvědčují tomu, že
nosičství alely -1575G by mohlo vést ke zvýšení produkce MMP-2 a tím ovlivnění
etiopatogenetického procesu. V distribuci ostatních polymorfismů nebyl nalezen
signifikantní rozdíl mezi RS skupinou a kontrolami.
Hlavním přínosem práce je průkaz signifikantní asociace polymorfismu (-1562
C/T) v genu pro MMP-9 s vyšším rizikem rozvoje RS, zejména u žen. Nebyla nalezena
asociace vyšetřených genetických polymorfismů s tíží onemocnění ani stupněm
postižení. Genetické varianty MMP-9 a MMP-2 se mohou podílet na zvýšené vnímavosti
k RS v české populaci, což potvrzuje význam MMPs v imunopatogenezi RS a jejich možné
využití jako biomarkeru v klinické praxi.
73
74
75
76
77
78
Benešová Y, Vašků A, Štourač P, Hladíková M, Okáčová I, Bednařík J.
Asociace polymorfizmů v genu pro matrix metalloproteinázu-2 a tkáňový inhibitor
metalloproteinázy-2 s roztroušenou sklerózou. Cesk Slov Neurol N 2012; 75/3: 314-19. IF:
0.279
Resumé
Významnou úlohu v imunopatogenezi roztroušené sklerózu hraje porucha hematoencefalické
bariéry (HEB). Matrix metalloproteinazy (MMPs) se významně podílí na jejím
rozrušení a tím umožňují migraci aktivovaných T-lymfocytů, zánětlivých buněk,
plazmatických proteinů, autoprotilátek a komplementu do CNS a infiltraci lézí. Navíc v CNS
štěpí myelinový bazický protein a aktivují prekursor TNF-alfa do jeho vyzrálé, biologicky
aktivní formy, který je toxický pro oligodendrocyty. Klíčovou roli hraje pravděpodobně
metalloproteinaza-9 (MMP-9), metalloproteinaza-2 (MMP-2) a jejich inhibitory. Jsou
exprimovane T lymfocyty a monocyty, ktere jsou převažujici populaci zanětlivych buněk
v aktivnich demyelinizačnich plakach. V naší předchozi studii jsme prokazali hranični
asociaci polymorfizmu MMP-2-1575 G/A s RS. Jiné studie zabyvajici se vztahem
genetickych polymorfizmů lokalizovanych v genech pro MMP-2 a tkaňovy inhibitor
metalloproteinazy-2 (TIMP-2) s RS dosud nebyly provedeny. Cílem studie bylo prozkoumat,
zda jsou polymorfismy v genu pro MMP-2 a TIMP-2 spojeny s RS nebo jejím průběhem; zda
se vyskytují častěji u žen či u mužů, nebo ovlivňuji tiži onemocněni a stupeň postižení.
Vyšetřili jsme celkem 375 jedinců; 240 nemocných s klinicky definovanou RS a 135
zdravých jedinců v kontrolním souboru. Klinické postižení bylo stanoveno vyšetřovací škálou
EDSS, stupeň postiženi byl kvantifikovan pomoci MSSS. Byly genotypizovány
polymorfismy (-168G/T, -735 C/T) v genu pro MMP-2 a polymorfizmus +853 G/A v genu
pro TIMP-2. U sledovaných polymorfismů nebyla nalezena asociace mezi skupinou
nemocných a zdravých jedinců. Po rozdělení souboru na skupiny podle průběhu onemocnění
bylo v distribuci TIMP-2 +853G/A genetickeho polymorfizmu prokázáno četnější zastoupení
homozygotů GG a heterozygotů GA ve skupině pacientů s RR RS ve srovnání s kontrolním
souborem (Pg = 0.04), (OR 1.46; 95 % CI: 0.91–2.36). Nebyl zjištěn rozdil mezi pohlavimi
ani asociace s tiži onemocněni. Z výsledků naší studie vyplývá, že vyšetřene polymorfizmy
nejsou rizikovym faktorem vnimavosti k RS v české populaci. Avšak po rozdělení na skupiny
podle průběhu onemocnění bylo zjištěno, že polymorfismus TIMP-2 +853G/A by mohl hrát
určitou úlohu u RR RS. Podílí se na ovlivnění struktury mRNA či snížení aktivity TIMP-2.
Vzhledem k tomu, že tento enzym specificky inhibuje MMP-2, dochází při jeho snížené
79
aktivitě ke zvýšené produkci MMP-2, což může vést k aktivaci zánětlivého procesu a progresi
onemocnění.
80
81
82
83
84
85
Benešová Y, Vašků A, Novotná H, Litzman J, Štourač P, Beránek M, Kadaňka Z,
Bednařík J.
Matrix metalloproteinase-9 and matrix metalloproteinase-2 as biomarkers of various courses
in multiple sclerosis. Mult. Scler 2009; 15(3): 316-322. IF: 3.279
Resumé
Matrix metalloproteinázy (MMPs) hrají důležitou roli imunopatogenezi roztroušené
sklerózy (RS). Významně se podílí na progresi zánětlivého procesu, porušení hematoencefalické
bariéry (HEB), formování zánětlivých RS lézí a demyelinizaci. Cílem této studie
bylo stanovit hladiny MMP-9, MMP-2 a jejich tkáňových inhibitorů v séru a zhodnotit jejich
vztah ke klinickému průběhu, stupni postižení a tíži onemocnění. Do studie bylo zařazeno 87
pacientů s RS, diagnostikovanou dle Mc Donaldových kriterií, kontrolní soubor byl tvořen 50
zdravými jedinci. Stanovení a kvantifikace hladin enzymů bylo provedeno metodou enzymelinked
immunoassay (ELISA). Klinický stav byl hodnocen pomocí Expanded Disability
Status Scale (EDSS), stupeň postižení byl spočítán podle Multiple Sclerosis Severity Score
(MSSS). Bylo prokázáno statisticky signifikantní zvýšení hladin MMP-9 v séru a MMP-
9/TIMP-1 u RS skupiny (P<0.001), zejména u relabující formy onemocnění (P<0.001) při
srovnání s kontrolním souborem. Dále bylo prokázáno signifikantní zvýšení hladin MMP-2
v séru a MMP-2/TIMP-2 u progresivní formy onemocnění (P<0.001) ve srovnání s relabující
formou. Toto zvýšení korelovalo s tíží onemocnění (P <0.001) a stupněm postižení (P<0.05).
Závěry: Bylo prokázáno statisticky signifikantní zvýšení MMP-9, MMP-9/TIMP-1
u RS, zejména relabující formy onemocnění. Odráží stupeň zánětlivého postižení a porušení
HEB. 2. Bylo prokázáno signifikantní zvýšení MMP-2, MMP-2/TIMP-2 u progresivní formy
onemocnění. Je známkou větší destrukce nervové tkáně v chronických lézích. Byla take
nalezena korelace MMP-2, MMP2/TIMP2 s tíží onemocnění a stupněm postižení. Hlavním
přínosem práce je zjištění, že MMPs jsou slibným biologickým markerem, jejich význam
v patofyziologii RS a využití v klinické praxi však ještě musí být ověřeno v dalších studiích.
86
87
88
89
90
91
92
93
Křenek P, Benešová Y, Bienertová-Vašků J, Vašků A.
The Impact of Five VDR Polymorphisms on Multiple Sclerosis Risk and Progression: a CaseControl
and Genotype-Phenotype Study. J Mol Neurosci. 2018 Mar 28. doi: 10.1007/s12031-
018-1034-1. [Epub ahead of print]. IF 2.229
Resumé
Riziko rozvoje roztroušené sklerózy (RS) je podmíněno kombinací faktorů genetických a
environmentálních. U geneticky predisponovaného jedince je onemocnění pravděpodobně
spuštěno vlivem zevních faktorů, mezi které řadíme nedostatečnou koncentraci vitaminu D
v séru, herpetické infekce a kouření. Vitamin D3 prostřednictvm receptoru pro vitamin D
(VDR) navozuje silné antiproliferativní, prodiferenciační a imunomodulační účinky. VDR po
své aktivaci slouží jako transkripční faktor regulující expresi vice než devítiset 1.25 (OH) 2
D3 responzivních genů, zároveň je také přítomen na buněčných membránách. Významnou roli
hraje též interakce vitaminu D3 s alelou HLA-DRB1*15, neboť v proximální promotorové
oblasti této alely je lokalizován responzivní element pro vitamin D. Cílem práce byla analýza
pěti polymorfizmů v genu pro VDR (EcoRV, FokI, ApaI, TaqI, and BsmI) a vyhodnocení
jejich vlivu na vnímavost k rozvoji RS, tíži postižení, průběh onemocnění a rozdíly mezi
pohlavími. Do studie bylo zařazeno celkem 296 RS pacientů, splňujících Mc Donaldova
kritéria a 135 zdravých nepříbuzných jedinců. Klinický stav byl hodnocen stupnicí EDSS.
Genotypizace byla provedena metodou PCR a restrikční analýzou. Nebyla nalezena asociace
vyšetřených polymorfismů s vnímavostí k RS v celé skupině. Po rozdělení souboru podle
pohlaví byl zjištěn signifikantní rozdíl ve frekvenci alel a/nebo genotypové distribuci u
polymorfismů TaqI, BsmI a ApaI mezi skupinou zdravých a nemocných mužů (Taq, pg =
0,02, pa = 0,02; BsmI, pg = 0,02, pa = 0,04; ApaI, pg = 0,008, pa = 0,005). U žen byl prokázán
významný rozdíl ve frekvenci alel a genotypů Apal u skupiny zdravých žen oproti kontrolám
(pg = 0,01, pa = 0,05). Dále jsme se zaměřili na funkční genetický polymorfismus EcoRV
(rs4516035), který nebyl dosud v souvislosti s RS studován. Jako první jsme prokázali
signifikantně frekventnější výskyt alely C u nemocných mužů ve srovnání s kontrolami (OR
1.8; 95% CI: 1.08- 2.24), pa = 0,02; podílí se tedy na zvýšené vnímavosti k rozvoji RS u
mužů. U žen je genotyp CT asociován s přibližně pětinásobné vyšší pravděpodobností rozvoje
prognosticky nepříznivé primárně progresivní roztroušené sklerózy (CT vs. CC + TT pcorr =
0,01, senzitivita 0,833, specificita 0,525, síla testu 0,823). Studie in vitro prokazují, že u
nosičů alely C dochází ke snížené expresi VDR, což může následně nepříznivě ovlivnit
imunomodulační účinky vitaminu D3 a vést ke klinické manifestaci onemocnění. Závěry:
Naše výsledky prokazují, že variabilita vyšetřených polymorfismů v genu pro VDR je
rizikovým faktorem vnímavosti a progrese RS v české populaci. Bylo zjištěno, že u mužů by
se mohla podílet na riziku rozvoje choroby, u žen ovlivňuje tíži a průběh onemocnění. Úloha
těchto genetických polymorfismů v patogenezi RS musí být ověřena v dalších studiích.
94
95
96
97
98
99
100
101
102
Hladíková M, Vašků A, Štourač P, Benešová Y, Bednařík J.
Two frequent polymorphisms of angiotensinogen and their association with multiple sclerosis
progression rate. J Neurol Sci. 2011; 303 (1-2): 31-34. IF 2.167
Resumé
Renin-angiotenzinový systém je zkoumán zejména ve spojitosti s regulací krevního
tlaku a iontového hospodářství, ale byl zjištěn také jeho podíl v zánětlivem procesu na
různých systémových úrovních v celém organizmu. Angiotenzinogen (ATG) spolu s jedním
ze svých produktů, angiotenzinem II je definován jako prozánětlivý mediátor. Hrají roli
v procesu regulace propustnosti cévni a hematoencefalické bariéry, aktivaci infiltrujících
imunokompetentních buněk, expresi prozánětlivých a prooxidačnich genů či zesílení
fagocytarní aktivity u makrofágů. ATG může být v CNS lokálně exprimován buňkami glie,
neurony a makrofágy. Studovali jsme dva funkčni polymorfizmy v genu pro ATG; (-6) A/G v
promotorové oblasti genu a M235T v exonu a ACE I/D. Cílem studie bylo zjistit, zda existuje
asociace mezi zkoumanými polymorfizmy a vnímavostí k roztroušené skleróze, s tíží
klinického postižení a/nebo formě tohoto onemocnění. Genotypizace byla provedena
v souboru 195 pacientů s diagnózou roztroušené sklerózy a 126 zdravých kontrol. Tíže
postižení byla kvantifikována pomocí MSSS. Neprokázali jsme statisticky signifikantní rozdíl
v genotypové či alelické distribuci pro zkoumané polymorfizmy mezi skupinou nemocných
a kontrolními osobami ani mezi skupinami pacientů s rozdílnými formami onemocnění.
Nalezli jsme signifikantní korelaci mezi genetickým polymorfismem M235T a tíží postižení.
Homozygoti MM měli nejlehčí (3.8), heterozygoti MT vyšší (5.2) a homozygoti TT nejtěží
(5.4) stupeň postižení vyjádený pomocí MSSS (p=0.02). V polymorfismu (-6) A/G v genu pro
ATG byla zjištěna pouze hraniční asociace (p=0.06), homozygoti GG měli nižší hodnoty
MSSS než heterozygoti a homozygoti AA. Závěr: Naše studie neprokázala, že by (-6) A/G
a M235T ATG polymorfizmy měly vliv na vnímavost k roztroušené skleróze, ani že by
asociovaly s různými formami tohoto onemocnění. Zjistili jsme však, že polymorfismus
M235T může ovlivnit tíži postižení pravděpodobně aktivací zánětlivého procesu.
103
104
105
106
107
Benešová Y, Vašků A, Štourač P, Hladiková M, Okáčová I, Bednařík J.
Association of IL7RA rs6897932 gene polymorphism with multiple sclerosis.
European Journal of Neurology 2014; 21: (Suppl. 1), 686. IF: 4.055
Resumé
Roztroušená skleróza je multifaktoriální onemocnění, v jehož etiopatogenezi se
významně podílí genetické faktory. Na spuštění autoimunitního procesu se pravděpodobně
podílí velké množství tzv. malých genů a jejich kombinace, které podmiňují velkou
interindividuální variabilitu choroby. Primární roli hraje pravděpodobně geneticky
determinovaná imunitní odpověď. V rozsáhlých, tzv. genome-wide asociačních studiích
(GWAS), provedených v evropské populaci bylo prokázáno, že MHC na chromozomu 6p21
reprezentuje nejvýznamnější lokus vnímavosti k RS. Geny mimo oblast HLA se také podílí na
rozvoji a progresi onemocnění. Mezi kandidátní geny řadíme geny kódující cytokiny,
chemokiny, kostimulační či signální molekuly. Avšak každý z nich přispívá pouze mírně
k celkové genetické predispozici choroby. Gen pro IL7RA kóduje povrchový znak CD 127
receptoru IL-7. Významnou měrou se podílí v patogenezi onemocnění a progresi zánětlivého
procesu v RS plakách. ILR7RA ovlivňuje regulaci a vývoj lymfocytů, podporuje proliferaci,
diferenciaci a přežívání T a B buněk. Genetický polymorfismus rs6897932 lokalizovaný
v exonu IL7RA genu je funkční variantou tohoto genu (p=2.94x10-7). V souboru 305
pacientů s roztroušenou sklerózou definovanou dle Mc Donaldových kritérií a 136 zdravých
jedinců byla provedena genotypizace rs6897932 C/T genetického polymorphism v genu pro
IL7RA. Byl studován jeho vliv na vnímavost k rozvoji roztroušené sklerózy, tíži postižení
a rozdíly mezi pohlavími v české populaci. Nebyla prokázána asociace mezi skupinou
nemocných a zdravých jedinců ve vyšetřeném polymorfismu. Pouze homozygoti CC
a heterozygoti CT se vyskytovali častěji ve skupině RS pacientů (p=0.02) ve srovnání
s kontrolami. Po rozdělení souboru podle pohlaví byl zjištěn signifikantní rozdíl
ve frekvenci alel (Pa=0.04) mezi skupinou zdravých a nemocných mužů. Výsledky této studie
prokázaly, že polymorfismus rs6897932 C/T není rizikovým faktorem vnimavosti k RS
v české populaci. Distribuce polymorfismu rs6897932 C/T by se však mohla podílet na
genetické vnímavosti k rozvoji RS u mužů v české populaci.
108
109
4. Závěry
4.1 Genetické studie
a) Byla nalezena signifikantní asociace polymorfismu rs3135388 v genu pro
HLA-DRB1*1501 se zvýšeným rizikem rozvoje RS v celé skupině a u žen.
b) Byla nalezena signifikantní asociace polymorfismu -1562 C/T v genu pro MMP-9 s
vyšším rizikem rozvoje RS v celé skupině a u žen.
c) Byla nalezena asociace polymorfismu-1575G/A v genu pro MMP-2
s vyšším rizikem rozvoje RS.
d) Byla nalezena asociace v distribuci TIMP-2 +853G/A genetickeho polymorfizmu
s vyšším rizikem rozvoje RR RS.
e) Byla nalezena asociace polymorfismu rs6897932 v genu pro IL7RA
s vyšším rizikem rozvoje RS u mužů.
f) Byla nalezena asociace polymorfismů rs4516035, rs731236, rs7975232, rs1544410 v genu
pro receptor vitaminu D s vyšším rizikem rozvoje RS u mužů.
g) Byla nalezena asociace polymorfismu rs7975232 v genu pro receptor vitaminu D s vyšším
rizikem rozvoje RS u žen.
h) Byla nalezena asociace polymorfismu rs4516035 v genu pro receptor vitaminu D s vyšším
rizikem rozvoje primární progresivní RS u žen.
i) Naše studie prokázala, že polymorfismus M235T v genu pro ATG může ovlivnit tíži
postižení.
j) Nebyla nalezena korelace vyšetřených polymorfismů v genu pro MMP-9
a v genu pro MMP-2 s hladinami enzymů v séru.
k) Nebyla nalezena vzájemná interakce mezi genetickými polymorfismy rs3135388 a
rs4516035
4.2 Studie hladin metalloproteináz a jejich inhibitorů
a) Bylo prokázáno statisticky signifikantní zvýšení MMP-9, MMP-9/TIMP-1
u RS, zejména relabující formy onemocnění. Odráží stupeň zánětlivého postižení a
porušení HEB.
b) Bylo prokázáno statisticky signifikantní zvýšení MMP-2, MMP-2/TIMP-2
u progresivní formy onemocnění. Je známkou větší destrukce nervové tkáně
v chronických lézích.
c) Byla nalezena korelace MMP-2, MMP2/TIMP2 s tíží onemocnění a stupněm postižení.
110
5 Diskuse
Naše výsledky prokazují, že distribuce vyšetřeného genetického polymorfismu
(rs3135388) v genu pro HLA-DRB1*1501 je významným rizikovým faktorem vnímavosti k
rozvoji RS (Pg=3.06×10-9
) v české populaci. Nosiči alely A se vyskytovlali frekventněji ve
skupině nemocných s RS (OR= 3.69) ve srovnání s kontrolním souborem. Naše studie
potvrdila předchozí závěry srbské studie, ve které bylo zjištěno, že nosiči alely A rs3135388
genetického polymorfizmu se častěji vyskytují ve skupině RS pacientů (OR = 4.37) (Živkovič
et al., 2009). Také Matiello v americké populaci, nalezl v case-kontrolní studii asociaci alely
A rs3135388 genetického polymorfizmu s RS (OR=3.93) (Matiello et al., 2010). Obdobně ve
studii GWAS byla také nalezena genetická asociace mezi alelou A a vnímavostí k RS
(OR=1.99) (Hafler et al., 2007).
Nejednoznačné nálezy ve vztahu k haplotypu DR15 však byly získány po
rozdělení podle pohlaví. Některé studie neprokázaly rozdíly (Ballerini et al., 2004; Fernández
et al., 2004), jiné potvrdily vazbu na ženské pohlaví (Hensiek et al., 2002; Luomala et al.,
2001; Weatherby et al., 2001) a v jedné studii byla naopak popsána mírně vyšší prevalence u
mužů (McDonnell et al.,1999). Ve studovaném genetickém polymorfismu rs3135388 jsme
jako jediní prokázali signifikantní rozdíl mezi nemocnými a zdravými ženami (Pg=1.3×10−8
).
Frekvence alely A u nemocných žen činila 30.9% ve srovnání s 8% u kontrol; OR pro GA
heterozygoty a AA homozygoty činilo 5.92. Prokázali jsme, že přítomnost alely A
polymorfismu rs3135388 je asociována s vyšší vnímavostí k RS u žen v české populaci.
Asociace nemoci s alelou A podporuje hypotézu, že zvýšená vnímavost k RS je
podmíněna aktivací autoagresivních imunitních buněk, které zvyšují zánětlivou aktivitu
choroby. Bylo prokázáno, že rs3135388 polymorfismus je funkční a alela A koreluje se
zvýšenou expresí DRB1, DRB5 a DQB1 genů v bělošské populaci a to 15.7-; 5.2-; resp. 8,3krát
u homozygotních nosičů AA rs3135388 genetického polymorfizmu ve srovnání s
homozygoty GG (Alcina et al., 2012). Zvýšená exprese molekul II třídy, schopných navázat
se na peptidové antigeny myelinu vede k následné stimulaci autoagresivních T-lymfocytů a
aktivaci onemocnění (Gourraud et al., 2012).
Později provedené studie v různých populacích také potvrdily asociaci rs3135388
genetického polymorfismu s vnímavostí k RS. Asociaci s RS prokázal v USA Hebring et al.
ve výzkumném projektu “Personalized Medicine Research Project” na klinice v Marshfieldu
(Hebring et al., 2013), další fenotypová studie provedená v USA, do které bylo zařazeno 6005
111
jedinců, prokázala také asociaci mezi RS a rs3135388 genetickým polymorfismem (OR= 2.56
P= 1.4 × 10−7
) (Carroll et al., 2014). Ve španělské studii byla doložena asociace v souboru
300 nemocných (García-Martín et al., 2013), obdobně též ve slovenské populaci (Ďurmanová
et al., 2015) a v ruské studii pak byla zjištěna asociace s benigním průběhem onemocnění
(Korobko et al., 2013). V Německu Akkad et al. v rozsáhlé asociační studii v souboru 1033
nemocných a 633 zdravých kontrol, ve které bylo testováno 58 kandidátních genetických
polymorfismů, prokázal asociaci s 21 genetickými polymorfismy. Nejvíce signifikantní
asociace byla opět zjištěna pro genetický polymorfismus rs3135388 (OR= of 2.41 P= 2.4 ×
10−22
) (Akkad et al., 2015, Akkad et al., 2016).
Vyšetření tohoto genetického polymorfismu by mohlo být potenciálně využito
jako biomarkeru v klinické praxi vzhledem k jeho vysokému stupni korelace s alelou HLA
DRB1*1501 a rizikem rozvoje onemocnění a navíc nízkými náklady spojenými s jeho
stanovením.
V prezentované asociační studii byl dále testován vztah genetických polymorfismů
lokalizovaných v kandidátních genech pro MMP-9, MMP-2 a TIMP-2 s rizikem rozvoje RS.
Prokázali jsme signifikantní snížení frekvence T alely polymorfismu -1562 C/T v genu pro
MMP-9 ve skupině RS pacientů; po rozdělení skupiny nemocných podle pohlaví jsme též
nalezli signifikantní rozdíl mezi nemocnými a zdravými ženami. Bylo prokázáno, že nosiči -
1562 T alely jsou méně frekventní u nemocných žen. V srbské studii byla zjištěna také
tendence ke snížené frekvenci nosičů alely T v polymorfismu -1562 C/T genu pro MMP-9
(Živkovič et al., 2007) u pacientů s RS. Výsledky několika dalších asociačních studií,
zabývajících se vztahem genetických polymorfismů lokalizovaných v genu pro MMP-9 s
rizikem rozvoje RS (Fiotti et al., 2004; Nelissen et al., 2000; Nelissen et al., 2002) jsou však
rozdílné. Ve švédské case-control studii a ve studii na Sardinii nebyla asociace mezi
genetickým polymorfismem -1562 C/T gelatinázy B a rizikem rozvoje RS potvrzena
(Nelissen et al., 2000). Bylo však zjištěno, že polymorfismus mikrosatelitu promotorové
oblasti genu pro MMP-9 hraje roli ve vnímavosti k RS v italské populaci (Fiotti et al., 2004).
Pozdější studie, které byly provedeny v Itálii, Polsku i Španělsku však naše nálezy potvrzují,
navíc byla prokázána asociace s tíží postižení a klinickým průběhem choroby (La Russa et al.,
2010; Fernandes et al., 2009; Mirowska-Guzel et. al., 2009).
Jako první jsme se zabývali asociačním vztahem genetického polymorfizmu MMP-2
-1575G/A s rizikem rozvoje RS. Vycházeli jsme z poznatků, že alela -1575G je funkční a
zvyšuje MMP-2 promotorovou aktivitu (Xu et al., 2007). Řada studií potvrzuje asociaci
MMP-2 genetických polymorfismů s rizikem rozvoje nebo tíží jiných, zejména nádorových a
112
autoimunitních onemocnění. Byla popsána např. asociace -1575 G/G genotypu se
signifikantně zvýšeným rizikem invazivního kolorektálního karcinomu (Xu et al., 2007). Naše
výsledky prokázaly frekventnější zastoupení homozygotů GG a heterozygotů GA v MMP-2 -
1575G/A genetickém polymorfismu ve skupině RS pacientů. Druhá studie, která byla
následně provedena, prokázala asociaci MMP-2 -1575G/A s dřívějším počátkem RS
(Gašparovič et al., 2015). Nosičství alel -1575 G by mohlo vést ke zvýšení produkce MMP-2
a ovlivnění etiopatogenetického procesu.
Dosud nebyla provedena žádná studie, zabývající se genetickými polymorfismy
TIMP-2 ve vztahu k RS. V našem souboru jsme po jeho rozdělení na skupiny podle průběhu
onemocnění prokázali hraniční asociaci TIMP-2 +853G/A genetického polymorfizmu
s vyšším rizikem rozvoje RR RS. Homozygoti GG a heterozygoti GA se vyskytovali
frekventněji ve skupině RR RS pacientů ve srovnání s kontrolním souborem. Alela +853G/A
se pravděpodobně podílí na ovlivnění aktivity TIMP-2. Ačkoli substitucí +853
G/A nukleotidu nedochází ke změně aminové kyseliny, je pravděpodobné snížení aktivity
TIMP-2 sekundárním ovlivněním struktury mRNA, které vede k inhibici míry translace
a/nebo snížení stability mRNA (Hirano et al., 2001). Byla zjištěna také zvýšená frekvence
alely G u pacientů s aneuryzmaty břišní aorty (Wang et al., 1999) či těžkou chronickou
obstrukční chorobou bronchopulmonální (Hirano et al., 2001) ve srovnání s kontrolami.
TIMP-2 inhibuje specificky MMP-2, která se významně podílí na porušení HEB, remodelaci
extracelulární matrix, poškození neuronů, axonů a reparaci tkání (Newman et al., 2001). Při
nedostatečné inhibici dochází ke zvýšené aktivitě MMP-2, což může vést k progresi
onemocnění.
Naše nálezy neprokazují asociaci vyšetřených genotypů MMP-2 a TIMP-2 s tíží
onemocnění nebo stupněm postižení vyjádřené EDSS a MSSS skóre. Jedná se však o první
asociační studii uvedeného polymorfismu v genu pro TIMP-2, v genu pro MMP-2 byla
provedena pouze jedna klinická asociační studie u nemocných s RS. Vzhledem k významu
MMP-2 a TIMP-2 v patofyziologii RS je potřeba provést další nezávislé studie ve větším
souboru pacientů a ověřit získané výsledky.
Dále jsme studovali genetický polymorfismus rs6897932, který je lokalizován
v exonu 6 v genu pro IL7RA. IL7RA hraje důležitou roli ve vývoji lymfocytů, podporuje
proliferaci, diferenciaci, maturaci, přežívání a homeostázu T a B-lymfocytů (Gregory et al.,
2007). Na rozdíl od některých předchozích prací jsme v naší studii nepotvrdili signifikantní
asociaci tohoto genetického polymorfismu s chorobou, nenalezli jsme ani asociaci s průběhem
onemocnění (Gregory et al., 2007; Hafler et al., 2007; Weber al. al., 2008). Ve slovenské
113
studii, která byla provedena později, byla asociace s progresivním průběhem nemoci zjištěna
(Čierny et al., 2015), v další studii pak asociace s PP RS (Teusch et al., 2003). V našem
souboru byla nalezena hraniční asociace polymorfismu rs6897932 v genu pro IL7RA s vyšším
rizikem rozvoje RS u mužů. Alela C se vyskytovala frekventněji ve skupině nemocných mužů
ve srovnání se zdravými kontrolami (p=0.04). Bylo prokázáno, že polymorfismus rs6897932
je funkční variantou tohoto genu (p=2.94x10-7) (Gregory et al., 2007). Nosičství alely C
může ovlivnit chorobu aktivací exprese exonu 6 a zvýšením solubilního IL7RA proteinu (sIL-
7RA). Jäger et al. v německé populaci prokázal, že hladiny sIL-7RA a mRNA kolísají u čtyř
obecných IL7RA haplotypů (rs1494555, rs6897932, rs987107 a rs987106). Bylo zjištěno, že
hladina sIL-7RA je u protektivního haplotypu až třikrát nižší ve srovnání s ostatními.
Genetické varianty IL7RA vedou tedy k haplotypově specifické odpovídavosti na různé
imunologické stimuly, které ovlivní vnímavost k RS (Jäger et al., 2013); také variabilita genů
funkčně spjatých s IL7RA, např. TYK2 může také ovlivnit RS proces (Zuvich et al., 2010).
Alela C rs6897932 polymorfismu se může uplatnit až u 30 % případů RS (Gregory et al.,
2007).
Dále jsme se zaměřili na úlohu vitaminu D v imunopatogenezi RS. Vyšetřili jsme
polymorfismy rs4516035, rs2228570, rs731236, rs7975232, rs1544410 v genu pro VDR a
hodnotli jsme vliv na vnímavost k rozvoji RS, tíži postižení, průběh onemocnění a rozdíly
mezi pohlavími v české populaci. V souvislosti s rizikem rozvoje RS byly dosud studovány
zejména polymorfizmy TaqI, BsmI, FokI a ApaI vitaminu D. Výsledky jednotlivých studií
jsou však kontroverzní. Některé asociaci s RS prokazují (Agliardi et al., 2011; Ben-Selma et
al., 2015; Narooie-Nejad et al., 2015), jiné nikoli (García-Martín E et al., 2013; Huang et al.,
2012; Tizaoui et al., 2015). V naší studii jsme po rozdělení souboru podle pohlaví prokázali
asociaci s RS u polymorfismů EcoRV, TaqI, BsmI, and ApaI mezi skupinou zdravých a
nemocných mužů (EcoRV, pa = 0,02; Taq, pg = 0,02, pa = 0,02; BsmI, pg = 0,02, pa = 0,04;
ApaI, pg = 0,008, pa = 0,005). U žen byl prokázán významný rozdíl ve frekvenci alel a
genotypů Apal u skupiny zdravých žen oproti kontrolám (pg = 0,01, pa = 0,05). V žádné studii
však dosud nebyla zkoumána asociace polymorfizmu rs4516035 v genu pro VDR s RS, na
který jsme se v naší práci zaměřili. Tento polymorfizmus se nachází v promotoru na pozici
1A-1012 v blízkosti polymorfizmu rs7139166, se kterým je v těsné vazbě- LD (D’ = 0.968;
R2
= 0.942) (d'Alesio et al., 2005). V multicentrické studii, zahrnující téměř 3000 nemocných
a 2500 kontrol, ve které bylo vyšetřeno 38 polymorfizmů, byla prokázána asociace alely C
(G) rs4516035 (OR 1.25; 95%CI, 1.01-1.55) s rizikem rozvoje melanomu (Orlow et al.,
114
2012). Barrosos et al. dokumentoval asociaci s agresivnějším typem tumoru, lokalizovaným
na hlavě, krku a trupu ve španělské populace (Barrosos et al., 2008).
V naší práci jsme jako první prokázali signifikantně vyšší frekvenci alely C
genetického polymorfismu rs4516035 u nemocných mužů oproti kontrolám (OR 1.8; 95% CI:
1.08- 2.24), podílí se na zvýšené vnímavosti k rozvoji RS u mužů. U žen genotyp CT zvyšuje
riziko primární progresivní roztroušené sklerózy 5,5krát (CT vs. CC + TT pcorr = 0,01,
senzitivita 0,833, specificita 0,525, síla testu 0,823).
Studie in vitro prokazují, že polymorfizmy rs4516035 a rs7139166 jsou funkční a
záměna báze na pozici 1A-1012 či 1A-1521 vedla k výraznému ovlivnění exprese mRNA. U
nosiče haplotypu rs4516035-G (C)/rs7139166-C došlo téměř k dvojnásobnému snížení
promotorové aktivity VDR ve srovnání s haplotypem rs4516035-A (T)/rs7139166-G (Fang et
al., 2005). Snížení exprese VDR může tedy následně nepříznivě ovlivnit antiproliferativní,
prodiferenciační a imunomodulační účinky vitaminu D3 a vést ke klinické manifestaci
onemocnění. Úloha tohoto genetického polymorfismu v etiopatogenezi onemocnění musí být
ještě ověřena v dalších klinických studiích. Vzájemnou interakci mezi genetickými
polymorfismy rs4516035 a rs3135388 jsme v naší studii nenalezli.
V neposlední řadě jsme se také zabývali úlohou RAS u RS. Genetickým aspektem
dané problematiky se před námi zabývala pouze jedna studie. Autoři vycházeli z práce
Nakajima et al., ve které byly nalezeny zvýšené sérové hladiny angiotenzin-konvertujícího
enzymu (ACE) u RS pacientů, kdy aktivita ACE korelovala s celkovým objemem plak na MR
(Nakajima et al., 2002). Byl prokázán zvýšený výskyt alely D a genotypu DD pro ACE I/D
polymorfismu u mužských pacientů s RS, jež je spojen s vyššími hladinami ACE (Lovrecič et
al., 2006). Naše práce jako první zkoumala vztah mezi polymorfismy M235T a (-6) A/G
v genu pro ATG a vnímavostí k RS. Neprokázali jsme, že by zkoumané polymorfismy byly
asociovány s vnímavostí k RS. Nalezli jsme však signifikantní korelaci mezi genetickým
polymorfismem M235T a tíží postižení. Homozygoti MM měli nejlehčí (3.8), homozygoti TT
pak nejtěžší (5.4) stupeň postižení vyjádřený pomocí MSSS (p=0.02). Polymorfizmus M235T
může ovlivnit tíži postižení pravděpodobně aktivací zánětlivého procesu. V průběhu zánětu
dochází působením interleukinu-1 a TNF alfa, které jsou produkovány makrofágy, k aktivaci
transkripce ATG. Tyto cytokiny ovlivňují vazbu dvou skupin transkripčních faktorů, které se
vážou na jedno regulační místo ATG promotoru (Yanai et al., 1997). Aktivace RAS má za
následek pozitivní zpětnou vazbu a následnou stimulaci ATG syntézy (Brasier et al. 1996).
Nabízí se ještě další otázka, zda k aktivaci RAS nedochází pouze sekundárně za již
115
změněných podmínek chronického zánětu a zkoumané polymorfismy nejsou asociovány
s vnímavostí k dané chorobě, ale ovlivňují pouze míru postižení a průběh RS.
V srbské studii byla následně prokázána zvýšená frekvence genotypu AA v genu pro
angiotenzinový receptor AT2 u nemocných žen ve srovnání se zdravými ženami. Tento
genotyp může tedy být jedním z pohlavně vázaných predisponujících faktorů vnímavosti k RS
(Živkovič et al., 2016).
V druhé části práce jsme se věnovali problematice stanovení hladin MMPs.
Prokázali jsme změny profilu sérových hladin MMP-9, MMP-2 a jejich inhibitorů u
nemocných s RS. MMPs napomáhají nejen objasnit patogenezu onemocnění, jsou také
slibnými biomarkery k posouzení aktivity, průběhu onemocnění a umožňují monitoraci léčby.
V současné době jsou řazeny spolu s IL12, IL 23, TNF, IL 17, alelami HLA II třídy,
chemokiny, osteopontinem a dalšími mezi tzv. validované biomarkery (Comabella et al.,
2014). Prokázali jsme zvýšenou hladinu MMP-9 v séru a zvýšení poměru MMP-9/TIMP-1 ve
skupině pacientů s RS a u skupiny nemocných s RR RS a SP RS při srovnání s kontrolní
skupinou. Potvrdili jsme nálezy, že MMP-9 je zvýšeně exprimovaná u RS a RR RS (Abraham
et al., 2005; Avolio et al., 2003; Goodin et al., 2002; Lindberg et al., 2001; Waubant et al.,
2003). Naše výsledky korelují s předchozími nálezy, které prokazují asociaci mezi zvýšenou
hladinou MMP-9 mRNA v periferních mononukleárech, zvýšenou hladinou MMP-9 v séru,
mozkomíšním moku s klinickou a pomocí MR zjištěnou aktivitou nemoci (Lee et al., 1999;
Leppert et al., 1998; Liuzzi et al., 2002). Další nálezy prokazují také zvýšenou transkripci
MMP-7 a MMP-9 ve všech lézích s výjimkou chronických, inaktivních lézí (Lindberg et al.,
2001).
V naší práci jsme navíc mezi prvními prokázali zvýšenou hladinu MMP-2 v séru a
MMP-2/TIMP-2 ratio zejména ve skupině PPMS, což je v souladu s výsledky předchozí
studie (Avolio et al., 2003). Na základě nálezů řady experimentálních studií in vitro bylo
zjištěno, že MMP-2 mRNA je produkována celým spektrem buněk (Chander et al., 1995);
nejen T-lymfocyty (Abraham et al., 2005), monocyty, B-lymfocyty (Bar-Or et al., 2003), ale
též makrofágy (Maeda et Sobel, 1996), mikroglií, endoteliálními buňkami (Birkedal-Hansen
et al., 1993; Muir et al., 2002, Cunnea et al., 2010). Též ve studii in vitro, ve které byly
stimulovány astrocyty a neurony lipopolysacharidy, došlo ke značnému zvýšení exprese proMMP-9
a pro-MMP-2 v astrocytech a pouze k lehkému zvýšení v neuronech (Liu et al.,
2007). Při aktivaci astrocytů byla indukována exprese MMP-2 (Muir et al., 2002). Zvýšená
exprese MMP-2 se spolupodílí na zvýšené hladině MMP-2 v séru a pravděpodobně lépe
odráží stupeň destrukce nervové tkáně v chronických lézích, ve kterých hraje velmi důležitou
116
roli také B-lymfocytární subpiální infiltrace (Magliozzi et al.,2007). Zvýšení hladiny MMP-2
v séru bylo též asociováno s tíží onemocnění a se stupněm postižení, vyjádřené EDSS a
MSSS v našem souboru nemocných. Kumulativní ztráta šedé a bílé hmoty, zejména postižení
axonální je důležitým a pravděpodobně zásadním faktorem akumulace ireverzibilního
postižení a konverze do progresivního průběhu (Bruck et al., 2005).
Řada dalších studií, které byly následně provedeny, potvrzuje naše nálezy a některé
z nich naši práci citují. Prokazují význam MMPs, zejména MMP2/MMP9 v patofyziologii
onemocnění a narušení HEB (Acar et al., 2010; Mirshafiey et al., 2014; Shimizu et al., 2014;
Szklarczyk et al., 2014). Vzhledem k jejich potvrzenému významu v patofyziologii
onemocnění se v současnosti vyvíjí nové, specifické, cílené techniky stanovení MMPs
využívající např. spektroskopie (Biela et al., 2015).
Velmi významnou roli hraje také ovlivnění aktivity MMPs léčbou. Několik studií
potvrzuje, že léčba interferony vedla ke snížení hladiny MMP-9 mRNA v séru u RS pacientů
(Galboiz et al., 2001; Waubant et al., 2003; Yushchenko et al., 2003). Ve studii in vitro byla
navíc prokázána inhibice exprese MMP-2 a MMP-9 v astrocytech a MMP-9 v mikroglii
působením INF-beta (Liuzzi et al., 2004). V klinické studii s kombinovanou terapií INF beta-
1a a doxycyklinem, silným inhibitorem MMPs, byla prokázána korelace mezi sníženou
hladinou MMP-9 v séru a redukcí aktivity lézí sytících se gadoliniem u pacientů s RR RS
(Minagar et al., 2008). Také léčba imunoglobuliny vedla ke snížení produkce MMP-9
v periferních mononukleárech u pacientů s RS a EAE (Okada et al., 2015). V dalším
experimentálním modelu EAE byl prokázán také protizánětlivý efekt donezepilu, který
inhibuje aktivitu MMPs u EAE (Jiang et al., 2013) či dasatinibu, který ihhiboval aktivitu
MMP-2 (Azizi et al., 2015). Ve studii EAE byla také prokázána inhibice MMP-2
v mozkomíšním moku minocyclinem (Stoop et al., 2012). Propustnost HEB je také ovlivněna
dexamethasonem, který tlumí expresi MMP-9 v experimentálním myším modelu (Blecharz et
al., 2010).
Nejnovější klinické studie prokazují, že specifické endogenními i syntetickými
inhibitory MMPs by mohly být slibným lékem nejen v terapii RS, ale i ostatních
neurodegenerativních onemocnění (Barranger et al., 2014; Muroski et al., 2008; Minagar et
al., 2008; Shimizu et al., 2014). Z tohoto důvodu je stanovení hladin MMPs a jejich inhibitorů
v séru velmi přínosné pro monitoraci efektu léčby u jednotlivých pacientů (Hecker et al.,
2013), může selektovat nemocné, u kterých tento proces převažuje a přispět k rychlejšímu
klinickému testování nových léčiv.
117
6 Souhrn
RS je multifaktoriální, multigenní onemocnění se značnou interindividuální
variabilitou, ve které hraje významnou roli složka genetická. Metodou studia multigenních
onemocnění jsou asociační studie vybraných kandidátních genů z hlediska jejich
předpokládané účasti v patofyziologii daného onemocnění s nozologickými jednotkami. Naše
výsledky potvrzují, že zjištění rizikových genetických polymorfismů v regulačních oblastech
kandidátních genů může poskytnout důležité informace o patogeneze onemocnění. Zárodečné
mutace genů, exprimujících zánětlivé proteiny může ovlivnit míru jejich exprese, stabilitu
mRNA, vlastnosti daných proteinů a tím vlastní etiopatogenetický proces.
Práce významně přispívá k rozšíření současných znalostí a napomáhá objasnění
genetické predispozice k rozvoji nemoci v české populaci, umožňující prokázat nejen míru
individuálního rizika, ale také posoudit vliv na průběh nemoci a rozdíly mezi pohlavími.
Přispívá také k prohloubení vědomostí o imunopatologických mechanismech RS, které
podmiňují progresi choroby a ovlivňují individuální odpovídavost na terapii.
Nalezení rizikových alel a jejich kombinace a objasnění patofyziologických
mechanismů může napomoci k vývoji nové, ještě účinnější, specifické, individualizované
léčby, monitorovat její efekt a zlepšit prognózu tohoto invalidizujícího onemocnění.
ABSTRAKT
Úvod: Roztroušená skleróza mozkomíšní (RS) je multifaktoriální onemocnění s polygenní dědičností.
Vnímvost k rozvoji nemoci je podmíněna kombinací faktorů genetických, environmentálních a
epigenetických. U geneticky predisponovaného jedince je onemocnění pravděpodobně spuštěno
vlivem zevních faktorů, mezi které řadíme infekce, zejména herpetické, nedostatečnou koncentraci
vitaminu D v séru a kouření.
Slibnými kandidáty jsou geny a jejich varianty, tzv. polymorfismy, které ovlivňují komplexní
patogenetický proces. Jedná se o geny pro lidské leukocytární antigeny (HLA) II třídy, které hrají
klíčovou roli ve zpracování antigenů myelinu a jejich prezentaci T-lymfocytům. Variabilita genu
HLA-DRB1*1501 může ovlivnit tento proces a následně iniciovat spuštění autoimunitního
onemocnění. Dalším velmi významným časným faktorem, podmiňujícím rozvoj a progresi
onemocnění je porušení hemato-encefalické bariéry (HEB), umožňující přestup zánětlivých buněk do
CNS a navození zánětlivé reakce. Důležitou roli v tomto procesu hrají matrix metalloproteinázy
(MMPs), které se významně podílí na infiltraci imunitních buněk do parenchymu CNS, degradaci
myelinového bazického proteinu a přímé neurotoxicitě. Angiotensinogen (ATG) se také podílí na
porušení HEB, aktivaci infiltrujících imunokompetentních buněk, expresi prozánětlivých a
prooxidačních genů. Dále jsme se zaměřili na úlohu vitaminu D v imunopatogenezi RS. Vitamin D3
prostřednictvím receptoru pro vitamin D (VDR) navozuje silné antiproliferativní, prodiferenciační a
imunomodulační účinky. VDR po své aktivaci slouží jako transkripční faktor regulující expresi vice
než devítiset 1.25 (OH) 2 D3 responzivních genů, zároveň je také přítomen na buněčných
membránách. Významnou roli hraje též interakce vitaminu D3 s alelou HLA-DRB1*15, neboť
v proximální promotorové oblasti této alely je lokalizován responzivní element pro vitamin D.
V předloženém souboru vlastních prací byly analyzovány vybrané funkční kandidátní genetické
polymorfismy lokalizované v genech pro HLA-DRB1*1501, matrix metalloproteinázu-9 (MMP-9),
matrix metalloproteinázu-2 (MMP-2) a její tkáňový inhibitor (TIMP-2), receptor vitaminu D (VDR),
angiotensinogen (ATG) a α řetězce receptoru pro IL-7 (IL7RA). Byla stanovena frekvence alel a
genotypová distribuce ve studovaném souboru. Ve druhé části práce jsme se zabývali studiem hladin
matrix metalloproteináz v séru.
Cílem těchto studií bylo určit asociační vztah kandidátních genetických polymorfismů s vnímavostí
k RS; nalézt případné rozdíly mezi pohlavími a zjistit, zda ovlivňují průběh onemocnění v české
populaci. Stanovit hladiny MMP-9, MMP-2 a jejich tkáňových inhibitorů v séru a vyhodnotit jejich
vztah ke klinickému průběhu, stupni postižení a tíži onemocnění.
Materiál a metodika: Jedná se o studie typu case-control a genotypově fenotypové studie. Bylo do
nich zařazeno celkem 306 nemocných s RS, diagnostikovanou dle Mc Donaldových kriterií a 135
zdravých jedinců. Ve studiích byla analyzována data pacientů sledovaných a léčených na
Neurologické klinice FN Brno. Klinický stav byl hodnocen pomocí Expanded Disability Status Scale
(EDSS), stupeň postižení byl spočítán podle Multiple Sclerosis Severity Score (MSSS). Genotypizace
byla provedena metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) a restrikční analýzou. Stanovení a
kvantifikace hladin enzymů bylo provedeno metodou ELISA (enzyme-linked immunoassay).
Výsledky: V genu pro HLA-DRB1*1501 bylo prokázáno, že nosiči alely A vazebného genetického
polymorfismu rs3135388 se vyskytovlali frekventněji ve skupině nemocných s RS (OR= 3.69, 95%
CI: 2,39-5,7) ve srovnání s kontrolním souborem. Jako první jsme prokázali signifikantní rozdíl také
mezi nemocnými a zdravými ženami (Pg=1.3x10-8
). Frekvence alely A u nemocných žen činila 30.9%
ve srovnání s 8% u kontrol (Pa=2.82×10−9
) (OR=5.11, 95 % CI: 2.86-9.15). U mužů signifikantní
rozdíl nalezen nebyl.
V genu pro MMP-9 jsme prokázali signifikantní snížení frekvence T alely -1562 C/T polymorfismu ve
skupině RS pacientů ve srovnání s kontrolami (Pa=0.01, OR -0.58, 95% CI:0.38-0.89) a ve skupině
nemocných žen oproti zdravým ženám (Pa=0.01, OR-0.53, 95% CI:0.32-0.86). Bylo prokázáno, že
nosiči -1562 T alely jsou méně frekventní u nemocných žen. Polymorfismus -1562 C>T je funkční a je
asociován se zvýšenou produkcí MMP-9.
Dosud nebyla provedena žádná studie, zabývající se genetickými polymorfismy TIMP-2 ve vztahu k
RS. V našem souboru jsme po jeho rozdělení na skupiny podle průběhu onemocnění prokázali
asociaci TIMP-2 +853G/A genetického polymorfizmu s vyšším rizikem rozvoje relaps remitentní
(RR) RS (Pg = 0.04), (OR 1.46; 95 % CI: 0.91–2.36). Alela G se pravděpodobně podílí na snížení
aktivity TIMP-2 sekundárním ovlivněním struktury mRNA.
V genu pro ATG jsme v naší práci jako první zkoumali vztah mezi polymorfismy M235T a (-6) A/G a
RS. Neprokázali jsme, že by zkoumané polymorfismy byly asociovány se zvýšeným rizikem rozvoje
RS. Naše studie však prokázala, že variabilita M235T ATG může ovlivnit tíži postižení. Homozygoti
TT měli nejtěžší stupeň postižení vyjádřený pomocí MSSS (p=0.02). Polymorfizmus M235T může
ovlivnit tíži postižení pravděpodobně aktivací zánětlivého procesu.
V genu pro VDR byl u mužů zjištěn signifikantní rozdíl ve frekvenci alel a/nebo genotypové distribuci
u polymorfismů TaqI, BsmI a ApaI mezi skupinou zdravých a nemocných mužů (Taq, pg = 0,02, pa =
0,02; BsmI, pg = 0,02, pa = 0,04; ApaI, pg = 0,008, pa = 0,005). U žen byl prokázán významný rozdíl
ve frekvenci alel a genotypů Apal u skupiny zdravých žen oproti kontrolám (pg = 0,01, pa = 0,05).
Dále jsme se zaměřili na funkční genetický polymorfismus EcoRV (rs4516035) v genu pro VDR,
který nebyl dosud v souvislosti s RS studován. V naší práci jsme Jako první prokázali signifikantně
frekventnější výskyt alely C u nemocných mužů ve srovnání s kontrolami (OR 1.8; 95% CI: 1.08-
2.24), pa = 0,02; podílí se tedy na zvýšené vnímavosti k rozvoji RS u mužů. U žen je genotyp CT
asociován s přibližně pětinásobné vyšší pravděpodobností rozvoje prognosticky nepříznivé primárně
progresivní roztroušené sklerózy (CT vs. CC + TT pcorr = 0,01). Studie in vitro prokazují, že
polymorfizmus rs4516035 je funkční, alela C je asociována se snížením exprese VDR.
Prokázali jsme zvýšenou hladinu MMP-9 v séru a zvýšení poměru MMP-9/TIMP-1 ve skupině
pacientů s RS (P<0.001), u skupiny nemocných s RR RS (P<0.001) a sekundárně progresivní (SP) RS
(P<0.001) při srovnání s kontrolní skupinou Odráží stupeň zánětlivého postižení a porušení HEB. Dále
bylo prokázáno signifikantní zvýšení hladin MMP-2 v séru a MMP-2/TIMP-2 u progresivní formy
onemocnění (P<0.001) při srovnání s relabující formou a toto zvýšení korelovalo s tíží onemocnění
(P<0.001) a stupněm postižení (P<0.05). Odráží stupeň destrukce nervové tkáně v chronických lézích.
Závěry: Naše výsledky prokazují, že distribuce vazebného genetického polymorfismu (rs3135388)
v genu pro HLA-DRB1*1501 může determinovat genetickou vnímavost k rozvoji RS v české populaci
a u žen. Byla nalezena signifikantní asociace polymorfismu (-1562 C/T) v genu pro MMP-9 s vyšším
rizikem RS, zejména u žen a asociace TIMP-2 +853G/A polymorfizmu s vnímavostí k RR RS. Naše
studie prokázala, že variabilita M235T ATG může ovlivnit tíži postižení. Bylo zjištěno, že variabilita
vyšetřených polymorfismů v genu pro VDR by se mohla podílet na riziku rozvoje choroby u mužů, u
žen ovlivňuje tíži a průběh onemocnění.
MMPs napomáhají objasnit patogenezu onemocnění a jsou slibnými biomarkery, které poskytují
informace o klinické manifestaci, tíži a stupni postižení a umožňují monitoraci léčby. Jejich význam
v patofyziologii RS a využití v klinické praxi však ještě musí být ověřeno v dalších studiích.
Objasnění faktorů, které se podílí na zvýšené vnímavosti a progresi nemoci může významně napomoci
k vývoji nové, ještě účinnější, specifické farmakoterapie a podstatně zlepšit prognózu tohoto
závažného onemocnění.
Klíčová slova: genetické polymorfismy; lidské leukocytární antigeny (HLA); matrix
metalloproteinázy; roztroušená skleróza; receptor pro vitamin D
ABSTRACT
Background: Multiple sclerosis (MS) is a multifactorial disease characterized by polygenic
inheritance. Genetic, environmental and epigenetic factors contribute to susceptibility to the disease.
In a genetically predisposed individual, the disorder seems to be triggerd by environmental factors,
including infections, mainly herpetic, insufficient serum concentrations of vitamin D and smoking.
Promising candidates are genes and their variants- polymorphisms that affect the complex
aetipathogenetic process. These are genes for the human leukocyte antigen (HLA) class II region,
which play a key role in the recognition and presentation of myelin antigens to T- lymphocytes. The
variability of the HLA-DRB1*1501 gene may affect this process and subsequently trigger the
autoimmune MS disease. Additionally, the blood-brain barrier (BBB) disruption is an early and central
event in the immunopathogenesis of MS, allowing the transfer of inflammatory cells into the CNS,
and the onset of neuro-inflammatory reactions. Matrix metalloproteinases (MMPs) play an important
role in the breakdown of the BBB, invasion of immune cells into the CNS parenchyma, degradation of
the myelin basic protein, and direct neurotoxicity. Angiotensinogen (ATG) is also involved in the
process of BBB disruption, activation of infiltrating immunocompetent cells, expression of proinflammatory
and pro-oxidant genes.
Furthermore, we have focused on the role of vitamin D in the immunopathogenesis of MS.
Through the vitamin D receptor (VDR), vitamin D3 induces strong antiproliferative, prodifferentiation
and immunomodulatory effects. After activation, VDR serves as a transcription factor
regulating the expression of more than nine hundred 1.25 (OH) 2 D3 responsive genes and is also
present on cell membranes. In addition, the vitamin D-responsive element (VDRE) has been identified
in the promoter region of HLA-DRB1*1501, which is the strongest genetic predictor of MS risk.
Objective: In the presented set of our own studies were analyzed candidate gene single nucleotide
polymorphisms (SNPs) localized in the HLA-DRB1*1501, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9),
matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), tissue inhibitor of MMP-2 (TIMP-2), vitamin D receptor
(VDR), angiotensinogen (ATG) and interleukin 7 receptor-α (IL7RA) genes. Genotype distributions
and allele frequencies were determined in the studied groups. The second part of the thesis is focused
on the determination of MMPs and their tissue inhibitors serum levels.
The aim of the present studies was to examine the association of genotypes/alleles given by these
candidate SNPs with MS susceptibility; to find potential gender differences; and to investigate
whether these polymorphisms influence disability in the Czech population. To determine the serum
levels of MMP-9, MMP-2 and their tissue inhibitors and to investigate a possible relation to the
clinical course and severity of MS.
Material and methods: The studies were designed as a case-control and phenotype-genotype studies.
We enrolled 306 MS patients fulfilling McDonald´s criteria for MS, the control group consisted of 135
healthy individuals. All patients and controls were recruited from the Department of Neurology at the
University Hospital, Brno. Disability was evaluated according to the Expanded Disability Status Scale
(EDSS) and disease severity was calculated using the Multiple Sclerosis Severity Score (MSSS).
Polymerase chain reaction (PCR) methods and restriction analysis were used for genotyping in
candidate genes. The DNA genotyping was performed using polymerase chain reaction (PCR)
methods with restriction analyses. The serum levels of MMPs were measured by enzyme linked
immunoassay (ELISA).
Results: In the HLA-DRB1*1501 tagging rs3135388 SNP a significant difference in genotype
distribution (Pg=3.06x10-9
) and allele frequency (Pa=6.08x10-10
) (OR= 3.69, 95% CI: 2,39-5,7)
between MS patients and controls was demonstrated. Also, we were the first to prove a significant
difference between female MS patients and female controls in genotype distribution (Pg=1.3x10-8
) and
allele frequency (Pa=2.82x10-9
); (OR- 5.11, 95% CI: 2.86-9.15). Allele A frequency in female patients
with MS was 30.9% compared with 8% in female controls. No significant difference was found males.
A significant decrease of the -1562T allele carriers in MS patients compared to controls (Pa=0.01) in -
1562C/T MMP-9 gene polymorphism was found (Pa=0.01, OR-0.58, 95% CI:0.38-0.89). Significant
differences were also demonstrated between female patients and healthy females (Pa=0.01, OR-0.53,
95% CI:0.32-0.86). It has previously been described that the changes in the promoter region of the -
1562C/T MMP-9 gene polymorphism influence transcription; the -1562 C>T polymorphism has been
associated with increased MMP-9 expression.
To date, no genetic association study of TIMP-2 gene variability and MS has been carried out After
dividing our studied group according to the disease form we found significant association of +853 G/A
TIMP-2 SNP with relapsing remitting MS (RR) MS (Pg = 0.04), (OR 1.46; 95 % CI: 0.91–2.36).
Allele G is likely to contribute to downregulation of TIMP-2 activity by influence on the secondary
structure of the mRNA, which inhibits the rate of translation and/or decreases the mRNA stability.
We first studied M235T and (-6) A/G gene polymorphisms in relation to MS. We did not find
statistically significant association with increased susceptibility to MS. Our study demonstrated that
variability of M235T ATG polymorphism can influence disease severity. The homozygotes TT had
the highest (5.4) mean MSSS values (P=0.02). M235T polymorphism represents the functional
polymorphism where the T allele was connected with elevated expression of ATG and can influence
the disease severity by activation of inflammatory proces.
In VDR gene, allele and/or genotype distributions differed in TaqI, BsmI, and ApaI polymorphisms in
MS male as compared to controls (Taq, pg = 0.02, pa = 0.02; BsmI, pg = 0.02, pa = 0.04; ApaI, pg =
0.008, pa = 0.005). In MS female, differences in the frequency of alleles and genotypes were found to
be significant in ApaI (pg = 0.01, pa = 0.05). We have also focused on the functional genetic
polymorphism EcoRV (rs4516035) in the VDR gene, which has never been studied in connection with
MS. We first demonstrated a significantly higher frequention of allele C in MS male compared to
controls (OR 1.8; 95% CI: 1.08-2.24), pa = 0.02. Conclusive results were observed between MS
female; CT genotype was found to increase the risk of primary progressive MS 5.5 times (CT vs
CC+TT pcorr = 0.01). In vitro studies showed that the rs4516035 polymorphism is functional and the
allele G is associated with decreased promoter activity and expression of VDR. A significant elevation
in MMP-9 serum levels and in the MMP-9/TIMP-1 ratio was found in the whole MS group (P<0.001),
in the RR MS (P<0.001), and secondary progressive MS (SPMS) (P<0.001) groups when compared
with the controls. This reflects the degree of the inflammatory process and BBB disruption. A
significant elevation in MMP-2 serum levels and in the MMP-2/TIMP-2 ratio was observed in the
primary progressive (P<0.001) and the SPMS (P<0.002) groups when compared with the RRMS
group, and this increase was also associated with the disability (P<0.001) and severity (P<0.05) of the
disease. Increased expression of MMP-2 results in elevation of serum MMP-2 levels and may reflect a
higher degree of destruction of nervous tissue in chronic lesions.
Conclusion: Our results indicate that the distribution of the tag SNP for HLA-DRB1*1501,
rs3135388, is a risk factor for susceptibility to MS in the Czech population and also in the female
population. We demonstrated a significant association between the risk of MS, particularly in female,
and MMP-9-1562C/T gene polymorphism. In addition, our study indicated an association between
TIMP-2 +853G/A SNP and susceptibility to RR MS and proved that the variability of M235T ATG
polymorphism can influence disease severity. The distribution of explored VDR polymorphisms was
found to be a risk factor for susceptibility to MS in males and for progression of the disease in females
in the Czech population.
We confirmed that metalloproteinases are useful biological markers in MS, providing information
about the clinical type, disability, and severity of the disease. MMPs help to elucidate the pathogenesis
of the disease and could contribute to an improvement in diagnostic standards and therapeutic
interventions for this disease. Their impact on the understanding of the pathophysiology of MS and on
the practical management of MS patients, remains, however, to be established.
Clarification of the factors that contribute to increased susceptibility to MS and disease progression
may significantly facilitate the development of more effective, new and specific drug therapies, thus
improving prognosis for the large numbers of sufferers.
Key words: gene polymorphism; human leukocyte antigen (HLA); multiple sclerosis; matrix
metalloproteinases; vitamin D receptor
118
7 Seznam použitých zkratek
ADAM........................................................................... membránově vázaná metalloproteináza
APC ....................................................................................................antigen prezentující buňka
ATG....................................................................................................................angiotenzinogen
CI................................................................................................................ interval spolehlivosti
CIS................................................................................................... klinicky izolovaný syndrom
CCPGSM........Canadian Collaborative Project on Genetic Susceptibility to Multiple Sclerosis
CL...............................................................................................................................kolagenáza
CNS ......................................................................................................centrální nervový system
DIS.............................................................................................................diseminace v prostoru
DIT .................................................................................................................. diseminace v čase
DNA. ...............................................................................................deoxyribonukleová kyselina
EAE ..................................................................experimentální autoimunitní encefalomyelitida
EBV……………………… ................................................................... Epsteina Barrové viroza
ECM. ...........................................................................................................extracelulární matrix
EDSS. ......................................................................................Expanded Disability Status Scale
ELISA............................................................................................ enzyme-linked immunoassay
GWAS …………………………….. ...........................................genome-wide asociační studie
HEB. ..................................................................................................hemato-encefalická bariéra
HLA.................................................................................................lidské leukocytární antigeny
HCl. .......................................................................................................kyselina chlorovodíková
HHV 6………………………………… .............................................human herpesvirus type 6
HSP…………………………..........................................................................heat shock protein
IFN................................................................................................................................ interferon
IL……………………………………………………….. ...........................................interleukin
IL-1.......................................................................................................................... interleukin-1
IL-2…………………………………….................................................................. interleukin-2
IL-4…………………………….............................................................................. interleukin-4
IL-5……………………………….......................................................................... interleukin-5
IL-6.......................................................................................................................... interleukin-6
IL-7.......................................................................................................................... interleukin-7
IL-8.......................................................................................................................... interleukin-8
IL-10...................................................................................................................... interleukin-10
IL-12………………………………….................................................................. interleukin-12
119
IL-13………………………… ............................................................................. interleukin-13
IL-17………………………………...................................................................... interleukin-17
IL-18………………………………….................................................................. interleukin-18
IL-21………………………………….................................................................. interleukin-21
IL-22………………………………….................................................................. interleukin-22
IL-35………………………………….................................................................. interleukin-35
IL2RA…………………………………..........................................α řetězec receptoru pro IL-2
IL7RA……………………………………………………………. α řetězec receptoru pro IL-7
IU……………………………………....................................................... mezinárodní jednotka
MAG.......................................................................................myelinová asociační glykoprotein
MBP................................................................................................... myelinový bazický protein
MHC..........................................................................................hlavní histokompatibilní systém
MHS .......................................................................................major histocompatibility complex
MMPs ...................................................................................................matrix metalloproteinázy
MMP-1 ..................................................................................................intersticiální kolagenaza
MMP-2 ........................................................................matrix metalloproteináza-2, gelatináza A
MMP-7 .........................................................................................................................matrilysin
MMP-9 ........................................................................matrix metalloproteináza-9, gelatináza B
MOG ......................................................................myelinový oligodendrocytární glykoprotein
MR.............................................................................................................magnetická resonance
MRZ…………………………………… ....................M-morbilli, R-rubella, Z-varicella zoster
MSSS...................................................................................... Multiple Sclerosis Severity Score
MT-MMPs................................................................................. membránové metalloproteinázy
mRNA…………………………………..................................messenger ribonukleová kyselina
např……………………………………........................................................................například
NMSS………………………………….. ............................National Multiple Sclerosis Society
obr………………………………………........................................................................ obrázek
OR......................................................................................................................... relativní riziko
Pcorr ...........................................................................................................mnohočetné srovnání
PCR.............................................................................................. polymerázová řetězová reakce
PLP ................................................................................................................... proteolipoprotein
PP RS.....................................................................................................primárně progresivní RS
RNA...........................................................................................................ribonukleová kyselina
RR RS.................................................................................................... relabující-remitentní RS
RS ................................................................................................................roztroušená skleróza
120
RXR…………………………………..................................................... retinoidním X receptor
SD...............................................................................................................směrodatná odchylka
SL .............................................................................................................................. stromelysin
SP RS............................................................................... sekundárně chronicko-progresivní RS
tab………………………………………. ........................................................................ tabulka
TACE...................................................................tumor necrosis factor alfa konvertující enzym
T-reg lymfocyt………………………........................................................ T regulační lymfocyt
TGF.................................................................................................transformující růstový faktor
TIMP-1. ........................................................................... tkáňový inhibitor metalloproteinázy-1
TIMP-2 ............................................................................ tkáňový inhibitor metalloproteinázy-2
TIMP-3. .......................................................................... tkáňový inhibitor metalloproteinázy-3
TIMP-4. ........................................................................... tkáňový inhibitor metalloproteinázy-4
TNF......................................................................................................tumor nekrotizující factor
tzv…………………………………….. .........................................................................takzvaný
USA…………………………………… .................................................Spojené státy americké
UVB…………………………………......................................................... ultrafialové záření B
vitamin D3............................................................................................................cholekalciferol
VDR ………………………………….........................................................receptor vitaminu D
VDRE………………………………… ............................... responzivní element pro vitamin D
121
8 Seznam použité literatury
Ablashi DV, Eastman HB, Owen CB, Roman MM, Friedman J, Zabriskie JB, et al.
Frequent HHV-6 reactivation in multiple sclerosis (MS) and chronic fatigue syndrome (CFS)
patients. J Clin Virol 2000; 16:179-91.
Abraham M, Shapiro S, Karni A, Weiner HL, Miller A. Gelatinases (MMP-2 and
MMP-9) are preferentially expressed by Th1 vs. Th2 cells. J Neuroimmunol. 2005; 163:
157-64.
Acar BA, Özetkin ZN, Özetkin MF, Acar T. Serum MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2
levels in multiple sclerosis clinical subtypes and their diagnostic value in the progressive
disease course. Biomedical Research 2014; 25: 343-50.
Achiron A. Predicting the course of relapsing-remitting MS using longitudinal disability
curves. J Neurol 2004; 251: 65–8.
Agliardi C, Guerini FR, Saresella M, Caputo D, Leone MA, Zanzottera M et al. Vitamin
D receptor (VDR) gene SNPs influence VDR expression and modulate protection from
multiple sclerosis in HLA-DRB1*15-positive individuals. Brain Behav Immun. 2011; 25 (7):
1460-7.
Agliardi C, Guerini FR, Saresella M, Caputo D, Leone MA, Zanzottera M. et al. Vitamin
D receptor (VDR) gene SNPs influence VDR expression and modulate protection from
multiple sclerosis in HLA-DRB1*15-positive individuals. Brain Behav Immun. 2011 Oct; 25
(7): 1460-7.
Akkad DA, Lee DH, Bruch K, Haghikia A, Epplen JT, Hoffjan S, Linker RA. Multiple
sclerosis in families: risk factors beyond known genetic polymorphisms. Neurogenetics. 2016;
17: 131-5.
Akkad DA, Olischewsky A, Reiner F, Hellwig K, Esser S, Epplen JT et al. Combinations
of susceptibility genes are associated with higher risk for multiple sclerosis and imply disease
course specificity. PLoS One.2015; 10: e0127632.
Alcina A, Abad-Grau Mdel M, Fedetz M, Izquierdo G, Lucas M, Fernández O et al.
Multiple sclerosis risk variant HLA-DRB1*1501 associates with high expression of DRB1
gene in different human populations. PLoS One 2012; 7: e29819.
Al-Temaimi RA, Al-Enezi A, Al-Serri A, Al-Roughani R, Al-Mulla F. The Association of
Vitamin D Receptor Polymorphisms with Multiple Sclerosis in a Case-Control Study from
Kuwait. PLoS One. 2015; 10 (11): e0142265.
and-9 promoter polymorphisms with colorectal cancer in Chine. Mol Carcinog. 2007; 46:
924–29.
Anthony DC, Ferguson B, Matyzak MK, Miller KM, Esiri MM, Perry VH. Differential
matrix metalloproteinase expression in cases of multiple sclerosis and stroke. Neuropathol
Appl Neurobiol. 1997; 23: 406-15.
Ascherio A, Munch M. Epstein-Barr virus and multiple sclerosis. Epidemiol 2000; 11:220 -
24.
122
Ascherio A, Munger KL, Lennette ET, Spiegelman D, Hernán MA, Olek MJ, et al.
Epstein-Barr virus antibodies and risk of multiple sclerosis: a prospective study. JAMA 2001
26; 286: 3083-88.
Ascherio A, Munger KL, Simon KC. Vitamin D and multiple sclerosis. Lancet
Neurol 2010; 9: 599–612.
Ascherio A, Munger KL, Simon KC. Vitamin D and multiple sclerosis. Lancet
Neurol 2010; 9: 599–612.
Aung LL, Mouradian MM, Dhib-Jalbut S, Balashov KE. MMP-9 expression is increased
in B lymphocytes during multiple sclerosis exacerbation and is regulated by microRNA-320a.
J Neuroimmunol 2015; 278: 185-9.
Avolio C, Ruggieri M, Giuliani F, Liuzzi GM, Leante R, Riccio P et al. Serum MMP-2
and MMP-9 are elevated in different multiple sclerosis subtypes. J Neuroimmunol. 2003; 136:
46-53.
Azizi G, Goudarzvand M, Afraei S, Sedaghat R, Mirshafiey A. Therapeutic effects of
dasatinib in mouse model of multiple sclerosis. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2015; 37:
287-294.
Azizi G, Haidari MR, Khorramizadeh M, Naddafi F, Sadria R, Javanbakht MH et al.
Effects of Imatinib Mesylate in Mouse Models of Multiple Sclerosis and In vitro
Determinants. Iran J Allergy Asthma Immunol 2014; 13: 198-206.
Ballerini C, Guerini FR, Rombolà G, Rosati E, Massacesi L, Ferrante P, Caputo D,
Talamanca LF, Naldi P, Liguori M, Alizadeh M, Momigliano-Richiardi P, D'Alfonso S.
HLA-multiple sclerosis association in continental Italy and correlation with disease
prevalence in Europe. J. Neuroimmunol. 2004; 150: 178-85.
Baranger K, Rivera S, Liechti FD, Grandgirard D, Bigas J, Seco J et al. Endogenous and
synthetic MMP inhibitors in CNS physiopathology. Prog Brain Res. 2014; 214: 313-351.
Bar-Or A, Nuttall RK, Duddy M, Alter A, Kim HJ, Ifergan I et al. Analyses of all
matrix metalloproteinase members in leukocytes emphasize monocytes as a major
inflammatory mediators in multiple sclerosis. Brain 2003; 126: 2738-49.
Barrosos E, Fernandes LP, Milne RL, Pita G, Sendagorta E, Floristan U et al. Genetic
analysis of the vitamin D receptor gene in two epithelial cancers: melanoma and breast
cancer case-control studies. BMC Cancer 2008; 23: 8:385.
Bashinskaya VV, Kulakova OG, Boyko AN, Favorov AV, Favorova OO. A review of
genome-wide association studies for multiple sclerosis: classical and hypothesis-driven
approaches. Hum Genet. 2015;134(11-12):1143-62
Ben-Selma W, Ben-Fredj N, Chebel S, Frih-Ayed M, Aouni M, Boukadida J. Age- and
gender-specific effects on VDR gene polymorphisms and risk of the development of multiple
sclerosis in Tunisians: a preliminary study. Int J Immunogenet. 2015; 42 (3): 174-81.
Berrigan LI, Fisk JD, Patten SB, Tremlett H, Wolfson C, Warren S et al. Team in the
Epidemiology and Impact of Comorbidity on Multiple Sclerosis (ECoMS). Health-related
quality of life in multiple sclerosis: Direct and indirect effects of comorbidity.
123
Biela A, Watkinson M, Meier UC, Baker D, Giovannoni G, Becer CR et al. Disposable
MMP-9 sensor based on the degradation of peptide cross-linked hydrogel films using
electrochemical impedance spectroscopy. Biosens Bioelectron. 2015; 68: 660-667.
Birkedal-Hansen H, Moore WG, Bodden MK, Windsor LJ, Birkedal-Hansen B,
DeCarlo A et al. Matrix metalloproteinases: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 1993; 4:
197–250.
Black RA, Rauch CT, Kozlosky CJ, Peschon JJ, Slack JL, Wolfson MF. A
metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells. Nature
1997; 385: 729-33.
Blecharz KG, Haghikia A, Stasiolek M, Kruse N, Drenckhahn D, Gold R et al.
Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line
cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis. Mult Scler 2010; 16: 293-
302.
Bos SD, Berge T, Celius EG, Harbo HF. From genetic associations to functional studies in
multiple sclerosis. European Journal of Neurology. 2016; 5: 847–53.
Bos SD, Page CM, Andreassen BK, et al. Genome-wide DNA methylation profiles indicate
CD8+ T cell hypermethylation in multiple sclerosis. PLoS One 2015; 10: e0117403.
Brasier AR, Li J. Mechanisms for inducible control of angiotensinogen gene transcription.
Hypertension 1996; 27: 465-75.
Bray PF, Luka J, Bray PF, Culp KW, Schlight JP. Antibodies against Epstein-Barr
nuclear antigen (EBNA) in multiple sclerosis CSF, and two pentapeptide sequence identities
between EBNA and myelin basic protein. Neurology 1992; 42: 1798-804.
Brinckerhoff CE, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a
prince. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002; 3: 207–14.
Brinckerhoff CE, Plucinska IM, Sheldon LA, O'Connor GT. Half-life of synovial cell
collagenase mRNA is modulated by phorbol myristate acetate but not by all-trans-retinoic
acid or dexamethasone. Biochemistry 1986; 25: 6378–84.
Brütting C, Emmer A, Kornhuber M, Staege MS. A survey of endogenous retrovirus
(ERV) sequences in the vicinity of multiple sclerosis (MS)-associated single nucleotide
polymorphisms (SNPs). Mol Biol Rep. 2016 May 12. [Epub ahead of print]
Brück W. Inflammatory demyelination is not central to the pathogenesis of multiple
sclerosis. J Neurol. 2005; 252: 10–15.
Brück W. New insights into the pathology of multiple sclerosis: towards a unified
concept? J Neurol. 2007; 254: 3–9.
Brüls T, Weissenbach J. The human metagenome: our other genome? Hum Mol Genet.
2011; 20: R 142–8.
Burrell AM, Handel AE, Ramagopalan SV, Ebers GC, Morahan JM. Epigenetic
mechanisms in multiple sclerosis and the major histocompatibility complex (MHC). Discov
Med 2011; 11: 187–96.
Cabre P, Signate A, Olindo S, Merle H, Caparros-Lefebvre D, Béra O, et al. Role of
return migration in the emergence of multiple sclerosis in the French West Indies. Brain
2005; 128: 2899-910.
124
Cadden M, Arnett P. Factors Associated with Employment Status in Individuals with
Multiple Sclerosis. Int J MS Care 2015;17 (6):284–91.
Cannell JJ, Vieth R, Umhau JC et al. Epidemic influenza and vitamin D. Epidemiol Infect
2006; 134: 1129-40.
Cantorna MT, Hayes CE, DeLuca HF. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 reversibly blocks the
progression of relapsing encephalomyelitis, a model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci
USA 1996; 93: 7861-4.
Cantorna MT, Snyder L, Lin YD, Yang L. Vitamin D and 1,25(OH)2D regulation of T
cells. Nutrients. 2015; 7 (4): 3011-21.
Carroll RJ, Bastarache L, Denny JC. R PheWAS: data analysis and plotting tools for
phenome-wide association studies in the R environment. Bioinformatics. 2014; 30: 2375-6.
Cepok S, Zhou D, Srivastava R, Nessler S, Stei S, Büssow K, et al. Identification of
Epstein-Barr virus proteins as putative targets of the immune response in multiple sclerosis. J
Clin Invest 2005; 115: 1352-60.
Chandler S, Coates R, Gearing A, Lury J, Wells G, Bone E. Matrix metalloproteinases
degrade myelin basic protein. Neurosci Lett 1995; 201:223–26.
Christensen T. The role of EBV in MS pathogenesis. Int MS J 2006; 13:52-7.
Čierny D, Hányšová S, Michalik J, Kantorová E, Kurča E, Škereňová M et al. Genetic
variants in interleukin 7 receptor α chain (IL-7Ra) are associated with multiple sclerosis risk
and disability progression in Central European Slovak population. J Neuroimmunol. 2015;
282: 80-4.
Cocco E, Murgia F, Lorefice L, Barberini L, Poddighe S, Frau J et a. (H)-NMR analysis
provides a metabolomic profile of patients with multiple sclerosis. Neurol Neuroimmunol
Neuroinflamm. 2016; 3: e185.
Comabella M, Montalban X. Body fluid biomarkers in multiple sclerosis. Lancet Neurol.
2014; 13: 113-26.
Compston A and Confavreux C. In: McAlpine´s Multiple Sclerosis 4th edn (Compston A,
et al). London: Churchil Livinstone Elsevier 2006;71-111.
Cordell HJ, Clayton DG. Genetic association studies. Lancet 2005; 366: 1121–31.
Correale J, Gaitán MI. Multiple sclerosis and environmental factors: the role of vitamin D,
parasites, and Epstein-Barr virus infection. Acta Neurol Scand 2015; 132: 46–55.
Handunnetthi L, Ramagopalan SV, Ebers GC. Multiple sclerosis, vitamin D, and HLADRB1*15.
Neurology 2010; 74: 1905–10.
Correale J, Ysrraelit MC, Gaitán MI. Immunomodulatory effects of vitamin D in multiple
sclerosis. Brain 2009; 132: 1146-60.
Correale J, Ysrraelit MC, Gaitán MI. Immunomodulatory effects of vitamin D in multiple
sclerosis. Brain 2009; 132: 1146-60.
Cox MB, Ban M, Bowden NA, Baker A, Scott RJ, Lechner-Scott J. Potential association
of vitamin D receptor polymorphism Taq1 with multiple sclerosis. Mult. Scler. 2012 18, 16-
22.
Cree B. The genetics of MS susceptibility and disease course. The changing face of MS:
understanging populations, treating individuals. 23–24 February 2008, Abstract book: 8.
125
Cree BA. Multiple sclerosis genetics. Handb Clin Neurol 2014; 122: 193-209.
Cristiano E, Rojas J, Romano M, Frider N, Machnicki G, Giunta D et al. The
epidemiology of multiple sclerosis in Latin America and the Caribbean: a systematic review.
Mult Scler 2013; 19: 844–54.
Cunnea P, McMahon J, O'Connell E, Mashayekhi K, Fitzgerald U, McQuaid S. Gene
expression analysis of the microvascular compartment in multiple sclerosis using laser
microdissected blood vessels. Acta Neuropathol. 2010; 119: 601-15.
d'Alesio A, Garabedian M, Sabatier JP, Guaydier-Souquieres G, Marcelli C et. al. Two
single-nucleotide polymorphisms in the human vitamin D receptor promoter change proteinDNA
complex formation and are associated with height and vitamin D status in adolescent
girls. Hum Mol Genet. 2005; 14: 3539-48.
Dang MN, Buzzetti R, Pozzilli P. Epigenetics in autoimmune diseases with focus on type 1
diabetes. Diabetes Metab Res Rev 2013; 29: 8–18.
Davenport CB. In: Association for Research in Nervous and Mental Diseases (ARNMD),
New York Hoeber 1921;2:8-19.
de Bakker PI, McVean G, Sabeti PC, Miretti MM, Green T, Marchini J et al. A highresolution
HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended
human MHC. Nat Genet 2006; 38: 1166-72.
De Jager PL, Simon KC, Munger KL, Rioux JD, Hafler DA, Ascherio A. Integrating risk
factors: HLA-DRB1*1501 and Epstein-Barr virus in multiple sclerosis. Neurology 2008; 70:
1113-18.
de Vries RR, Meera Khan P, Bernini LF, van Loghem E, van Rood JJ. Genetic control of
survival in epidemics. J Immunogenet. 1979; 6: 271-87.
Dean G. Annual incidence, prevalence, and mortality of multiple sclerosis in white SouthAfrican-born
and in white immigrants to South Africa. Br Med J 1967; 2: 724-30.
Ďurmanová V, Shawkatová I, Javor J, Párnická Z, Čopíková-Cundráková D, Turčáni
P, et al. VLA4 Gene Polymorphism and Susceptibility to Multiple Sclerosis in Slovaks. Folia
Biol (Praha). 2015; 61: 8-13.
Dusso AS, Brown AJ, Slatopolsky E. Vitamin D. Am J Physiol renal Physiol 2005, 289 F8-
28.
Dyment DA, Ebers GC, Sadovnick AD. Genetics of multiple sclerosis. Lancet Neurol.
2004; 3: 104-10.
Ebers G. Environmental factors in multiple sclerosis. MS Forum 1998; Modern Management
Workshop, Montréal.
Ebers G. Genetic factors in multiple sclerosis. MS Forum 1995; Modern Management
Workshop, Boston.
Ebers G. Multiple sclerosis: Epidemiology, Genetics and Environmental factors. MS Forum
2007; Modern Management Workshop, Wiesbaden.
Ebers GC, Sadovnick AD, Dyment DA, Yee IM, Willer CJ, Risch N. Parent-of-origin
effect in multiple sclerosis: observations in half-siblings. Lancet. 2004; 363: 1773-4.
Egeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer
progression. Nat Rev Cancer. 2002; 2: 161–74.
126
expression of metalloproteinases in rat glial cell cultures: implications for multiple sclerosis
Fang Y, van Meurs JB, d'Alesio A, Jhamai M, Zhao H, Rivadeneira F et al. Promoter
and 3'-untranslated-region haplotypes in the vitamin d receptor gene predispose to
osteoporotic fracture: the Rotterdam study. Am J Hum Genet. 2005; 77: 807–823.
Fernandes KS, Brum DG, Sandrim VC, Guerreiro CT, Barreira AA, Tanus-Santos JE.
Matrix metalloproteinase-9 genotypes and haplotypes are associated with multiple sclerosis
and with the degree of disability of the disease. J Neuroimmunol. 2009; 214: 128-31.
Fernández O, Fernández V, Alonso A, Caballero A, Luque G, Bravo M et al.
DQB1*0602 allele shows a strong association with multiple sclerosis in patients in Malaga,
Spain. J. Neurol. 2004; 251: 440-44.
Fiotti N, Zivadinov R, Altamura N, Nasuelli D, Bratina A, Tommasi MA. MMP-9
microsatellite polymorphism and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 2004; 152:147-53.
Fogdell-Hahn A, Ligers A, Grønning M, Hillert J, Olerup O. Multiple sclerosis: a
modifying influence of HLA class I genes in an HLA class II associated autoimmune disease.
Tissue Antigens. 2000 Feb;55 (2):140-8.
Fonken LK, Weber MD, Daut RA, Kitt MM, Frank MG, Watkins LR et al. Stressinduced
neuroinflammatory priming is time of day dependent. Psychoneuroendocrinology.
2016; 66: 82–90.
Fukazawa T, Yabe I, Kikuchi S, Sasaki H, Hamada T, Miyasaka K et al. Association of
vitamin D receptor gene polymorphism with multiple sclerosis in Japanese. J Neurol Sci.
1999; 166 (1): 47-52.
Galboiz Y, Shapiro S, Lahat N, Rawashden R, Miller A. Matrix metalloproteinases and
their tissue inhibitors as markers of disease subtype and response to interferon-beta therapy
in relapsing and secondary progressive multiple sclerosis patients. Ann Neurol 2001; 50: 443-
51.
García-Martín E, Agúndez JA, Martínez C, Benito-León J, Millán-Pascual J, Calleja P.
et al. Vitamin D3 receptor (VDR) gene rs2228570 (Fok1) and rs731236 (Taq1) variants are
not associated with the risk for multiple sclerosis: results of a new study and a meta-analysis.
PLoS One. 2013;8 (6): e65487.
Garcion E, Wion-Barbot N, Montero Menei CN, Berger F, Wion D. New clues about
vitamin D function in the nervous system. Trends Endrcrinol Metab 2002; nnnnnnnnn13:100-
105.
Gašparović I, Čizmarević NS, Lovrečić L, Perković O, Lavtar P, Sepčić J et al. MMP-2 -
1575G/A polymorphism modifies the onset of optic neuritis as a first presenting symptom in
MS? J Neuroimmunol 2015; 286:13-15.
Giordano A, Ferrari G, Radice D, Randi G, Bisanti L, Solari A, POSMOS study. Healthrelated
quality of life and depressive symptoms in significant others of people with multiple
sclerosis: a community study. Eur J Neurol 2012; 19: 847–54.
Gold SM, Mohr DC, Huitinga I, Flachenecker P, Sternberg EM, Heesen C. The role of
stress-response systems for the pathogenesis and progression of MS. Trends Immunol 2005;
26: 644–52.
127
Goldberg GI, Manner BL, Grant GA, Eisen AZ, Wilhelm S, He C. Human
72-kilodalton type IV collagenase forms a complex with a tissue inhibitor of metalloproteases
designated TIMP-2. Proc Natl Acad Sci. USA 1989; 86: 8207–11.
Goodin DS, Frohman EM, Garmany GP, Halper J, Likosky WH, Lublin FD et al.
Disease modifying therapies in multiple sclerosis: Subcommittee of the American Academy of
Neurology and the MS Council for Clinical Practise Guidelines. Neurol 2002;58: 169-78.
Goodin DS, Frohman EM, Garmany GP, Halper J, Likosky WH, Lublin FD et al.
Disease modifying therapies in multiple sclerosis: Subcommittee of the American Academy of
Neurology and the MS Council for Clinical Practise Guidelines. Neurol 2002; 58: 169-78.
Goris A, Walton A, Ban M, Dubois B, Compston A, Sawcer S. A Taqman assay for highthroughput
genotyping of the multiple sclerosis-associated HLA-DRB1*1501 allele. Tissue
Antigens. 2008; 72: 401-3.
Gourraud PA, Harbo HF, Hauser SL, Baranzini SE. The genetics of multiple sclerosis: an
up-to-date review. Immunol Rev. 2012 Jul;248(1):87-103.
Graves M, Benton M, Lea R, et al. Methylation differences at the HLA-DRB1 locus in
CD4+ T-cells are associated with multiple sclerosis. Mult Scler 2013; 20: 1033–41.
Gregersen JW, Kranc KR, Ke X, Svendsen P, Madsen LS, Thomsen AR et al. Functional
epistasis on a common MHC haplotype associated with multiple sclerosis. Nature. 2006; 443:
574-7.
Gregory SG, Schmidt S, Seth P, Oksenberg JR, Hart J, Prokop A et al. Multiple
Sclerosis Genetics Group. Interleukin 7 receptor alpha chain (IL7R) shows allelic and
functional association with multiple sclerosis. Nat Genet. 2007; 39: 1083–91.
Griffiths AJ; Miller JH; Suzuki DT; Lewontin RC; Gelbart WM. An introduction to
genetic analysis. 7. vyd. NewYork: 2000.
Grigorian A, Mkhikian H, Li CF,Newton BL, Zhou RW, Demetriou M et al.
Pathogenesis of multiple sclerosis via environmental and genetic dysregulation of Nglycosylation.
Semin Immunopathol 2012; 34: 415-24.
Hadgkiss EJ, Jelinek GA, Weiland TJ, Pereira NG, Marck CH, van der Meer DM.
Methodology of an International Study of People with Multiple Sclerosis Recruited through
Web 2.0 Platforms: Demographics, Lifestyle, and Disease Characteristics. Neurol Res Int
2013; 2013: 580596.
Hammack BN, Fung KY, Hunsucker SW, Duncan MW, Burgoon MP, Owens GP et al.
Proteomic analysis of multiple sclerosis cerebrospinal fluid. Mult Scler 2004; 10 (3): 245–
260.
Hartung HP, Bar-Or A, Zoukos Y. What do we know about the mechanism of action of
disease-modifying treatments in MS? J Neurol 2004; 251: 12–19.
Hartung HP. Pathogenesis of multiple sclerosis: status of research. Wien Med Wochenschr.
1996; 146: 520-27.
Hashimoto H, Vertino PM, Cheng X. Molecular Coupling of DNA Methylation and Histone
Methylation. Epigenomics 2010 5: 657–69.
Havrdová E. Roztroušená skleróza. Triton, 2002.
128
Heaney RP, Davies KM, Chen TC, Holick MF, Barger-Lux MJ. Human serum 25hydroxycholecalciferol
response to extended oral dosing with cholecalciferol. Am J Clin
Nutr. 2003 Jan; 77: 204–10.
Hebbring SJ, Schrodi SJ, Ye Z, Zhou Z, Page D, Brilliant MH. A PheWAS approach in
studying HLA-DRB1*1501. Genes Immun. 2013; 14:187-91.
Hecker M, Hartmann C, Kandulski O, Paap BK, Koczan D, Thiesen HJ et al. Interferonbeta
therapy in multiple sclerosis: the short-term and long-term effects on the patients'
individual gene expression in peripheral blood. Mol Neurobiol. 2013; 48: 737-56.
Hecker M, Hartmann C, Kandulski O, Paap BK, Koczan D, Thiesen HJ et al. Interferonbeta
therapy in multiple sclerosis: the short-term and long-term effects on the patients'
individual gene expression in peripheral blood. Mol Neurobiol. 2013; 48(3): 737-756.
Hensiek AE, Sawcer SJ, Feakes R, Deans J, Mander A, Akesson E, et al. HLA-DR 15 is
associated with female sex and younger age at diagnosis in multiple sclerosis. J. Neurol.
Neurosurg. Psychiatry 2002; 72: 184-87.
Hirano K, Sakamoto T, Uchida Y, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases-2 gene
polymorphisms in chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J 2001; 18: 748-52.
Hirano K, Sakamoto T, Uchida Y, Morishima Y, Masuyama K, Ishii Y et al. Tissue
inhibitor of metalloproteinases-2 gene polymorphisms in chronic obstructive pulmonary
disease. Eur Respir J 2001; 18: 748–52.
Holick MF. Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases,
cancers, and cardiovascular disease. Am J Clin Nutr 2004;80(6 Suppl):1678S - 88S.
Holick MF. Vitamin D: importance in the prevention of cancers, type 1 diabetes, heart
disease, and osteoporosis. Am J Clin Nutr.200479: 362-71.
Holick MF. Vitamin D: importance in the prevention of cancers, type 1 diabetes, heart
disease, and osteoporosis. Am J Clin Nutr 2004; 79: 362-71.
Holmøy T. Vitamin D status modulates the immune response to Epstein Barr virus:
Synergistic effect of risk factors in multiple sclerosis. Med Hypotheses. 2008;70(1):66-9.
Hooper LV, Littman DR, Macpherson AJ. Interactions between the microbiota and the
immune system. Science 2012; 336: 1268–73.
Hořejší V, Bartůňková J. Základy imunologie: Triton, 2009; s. 146.
http://www.tcells.org/scientific/gdtcells/.
HR et al. Matrix metalloproteinase-9/gelatinase B is a putative therapeutic target of chronic
obstructive pulmonary disease and multiple sclerosis. Curr Pharm Biotechnol 2008; 9: 34–46.
http://www.emdbiosciences.com
Huang J, Xie ZF. Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and multiple sclerosis risk:
a meta-analysis of case-control studies. J Neurol Sci. 2012; 313 (1-2): 79-85.
Huebner K, Isobe M, Gasson JC, Golde DW, Croce CM. Localization of the gene
encoding human erythroid-potentiating activity to chromosome region Xp11.1-Xp11.4. Am J
Human Genet. 1986; 38: 819–26.
Huhtala P, Eddy RL, Fan ZS, Byers MG, Show TB, Tryggvason K. Completion of the
primary structure of the human type IV collagenase preproenzyme and assignment of the gene
(CLG4) to the q21 region of chromosome 16. Genomics 1990b; 6: 554–59.
129
Huhtala P, Tuuttila A, Chow LT, Lohi J, Keski-Oja J, Tryggvason K. Complete structure
of the human gene for 92-kDa type IV collagenase. Divergent regulation of expression for the
92-and 72-kilodalton enzyme genes in HT-1080 cells. J Biol Chem 1991; 266:16485–90.
International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, Hafler DA, Compston A, Sawcer
S, Lander ES, Daly MJ, De Jager PL, de Bakker PI, et al. Risk alleles for multiple
sclerosis identified by a genomewide study. N Engl J Med 2007; 357: 851–62.
International Multiple Sclerosis Genetics Consortium; Wellcome Trust Case Control
Consortium 2, Sawcer S, Hellenthal G, Pirinen M, Spencer CC, Patsopoulos NA,
Moutsianas L, et al. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms
in multiple sclerosis. Nature 2011; 476: 214-19.
Jablonski NG, Chaplin G. The evolution of human skin coloration. J Hum Evol 2000; 39:57-
106.
Jäger J, Schulze C, Rösner S, Martin R. IL7RA haplotype-associated alterations in cellular
immune function and gene expression patterns in multiple sclerosis. Genes Immun. 2013; 14:
453-61.
Jehan F, Voloc A, Esterle L, Warlant-Debray O, Nguyen TM, Garabedian M. Growth,
calcium status and vitamin D receptor (VDR) promoter genotype in European children with
normal or low calcium intake. J Steroid Biochem Mol Biol 2010; 121 (1-2):117-20.
Jersild C, Svejgaard A, Fog T. HLA antigens and multiple sclerosis. Lancet 1972; 1:1240 -
41.
Jiang Y, Zou Y, Chen S, Zhu C, Wu A, Liu Y et al. The anti-inflammatory effect of
donepezil on experimental autoimmune encephalomyelitis in C57 BL/6 mice.
Neuropharmacology. 2013; 73:415-24.
Joseph RW, Bayraktar UD, Kim TK, St John LS, Popat U, Khalili J et al. Vitamin D
receptor upregulation in alloreactive human T cells. Hum Immunol. 2012; 73 (7): 693-8.
Kaliszewska A, De Jager PL. Exploring the role of the epigenome in multiple sclerosis: a
window onto cell-specific transcriptional potential. J Neuroimmunol 2012; 248: 2–9.
Kantarci OH, Barcellos LF, Atkinson EJ, Ramsay PP, Lincoln R, Achenbach SJ, et al.
Men transmit MS more often to their children vs women: the Carter effect. Neurology 2006;
67: 305-10.
Kongsbak M, Levring TB, Geisler C, von Essen MR. The vitamin D receptor and T cell
function. Front Immunol. 2013; 4: 148.
Könnecke H, Bechmann I. The role of microglia and matrix metalloproteinases involvement
in neuroinflammation and gliomas. Clin Dev Immunol 2013; 2013: 914104.
Korobko DS, Malkova NA, Bulatova EV, Babenko LA, Sazonov DV, Sokolova EA et al.
The effect of genetic factors on the phenotypic expression of multiple sclerosis. Zh Nevrol
Psikhiatr Im S S Korsakova. 2013; 113: 10-6.
Kurtzke JF, Heltberg A. Multiple sclerosis in the Faroe islands. An epitomé. J Clin
Epidemiol 2001; 54: 1-22.
Kurtzke JF. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an Expanded Disability
Status Scale (EDSS). Neurology 1983; 33: 1444–52.
130
Kurzepa J, Bartosik-Psujek H, Suchozebrska-Jesionek D, Rejdak K, Stryjecka-Zimmer
M, Stelmasijak Z. Role of matrix metalloproteinases in the pathogenesis of multiple
sclerosis. Neurol Neurochir Pol. 2005; 39: 63-67.
La Russa A, Cittadella R, De Marco EV, Valentino P, Andreoli V, Trecroci F et al.
Single nucleotide polymorphism in the MMP-9 gene is associated with susceptibility to
develop multiple sclerosis in an Italian case-control study. J Neuroimmunol. 2010; 225: 175-
79.
Lalive PH, Burkhard PR, Chofflon M. TNF-alpha and psychologically stressful events in
healthy subjects: potential relevance for multiple sclerosis relapse. Behav Neurosci 2002;
116:1093–97.
Lang HL, Jacobsen H, Ikemizu S, Andersson C, Harlos K, Madsen L, et al. A functional
and structural basis for TCR cross-reactivity in multiple sclerosis. Nat Immunol 2002; 3:940-
43.
Langer-Gould A, Brara SM, Beaber BE, Zhang JL. Incidence of multiple sclerosis in
multiple racial and ethnic groups. Neurology 2013; 80:1734–9.
Langer-Gould A, Brara SM, Beaber BE, Zhang JL. The incidence of clinically isolated
syndrome in a multi-ethnic cohort. J Neurol 2014; 261: 1349–55.
Larochelle C, Alvarez JI, Prat A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier
in multiple sclerosis? FEBS Lett 2011; 585: 3770-80.
Latchman YE, Liang SC, Wu Y et al. PD-Ll deficient mice show that PD-Ll on T-cells,
antigen presenting cells and host tissues negatively regulates T-cells. Proc Natl Acad Sci
USA 2004; 101: 10691-99.
Lee MA, Smith S, Palace J, Narayanan S, Silver N, Minicucci L et al. Spatial mapping of
T2 and gadolinium-enhancing T1 lesion volumes in multiple sclerosis: evidence for distinct
mechanisms of lesion genesis? Brain 1999; 122: 1261-70.
Leppert D, Ford J, Stabler G, Grygar C, Lienert C, Huber S et al. Matrix
metalloproteinase-9 (gelatinase B) is selectively elevated in CSF during relapses and stable
phases of multiple sclerosis. Brain 1998; 121: 2327–34.
Leppert D, Waubant E, Galandy R, Bunnett NW, Hauser SL. 1995. T cell gelatinases
mediate basement membrane transmigration in vitro. J Immunol. 1995; 154: 4379-89.
Levin LI, Munger KL, O'Reilly EJ, Falk KI, Ascherio A. Primary infection with the
Epstein-Barr virus and risk of multiple sclerosis. Ann Neurol 2010; 67: 824-30.
Levin LI, Munger KL, Rubertone MV, Peck CA, Lennette ET, Spiegelman D, et al.
Multiple sclerosis and Epstein-Barr virus. JAMA 2003; 289: 1533-36.
Levin LI, Munger KL, Rubertone MV, Peck CA, Lennette ET, Spiegelman D, Ascherio
A. Temporal relationship between elevation of epstein-barr virus antibody titers and initial
onset of neurological symptoms in multiple sclerosis. JAMA 2005; 293: 2496-500.
Ligers A, Dyment DA, Willer CJ, Sadovnick AD, Ebers G, Risch N, Hillert J; Canadian
Collaborative Study Groups. Evidence of linkage with HLA-DR in DRB1*15-negative
families with multiple sclerosis. Am J Hum Genet. 2001; 69: 900-3.
Lim CK, Brew BJ, Sundaram G, Guillemin GJ. Understanding the roles of the kynurenine
pathway in multiple sclerosis progression. Int J Tryptophan Res 2010; 3:157–67.
131
Lin Z, Li W. The Roles of Vitamin D and Its Analogs in Inflammatory Diseases. Curr Top
Med Chem. 2016; 16 (11):1242-61.
Lincoln MR, Montpetit A, Cader MZ, Saarela J, Dyment DA, Tiislar M, et al. A
predominant role for the HLA class II region in the association of the MHC region with
multiple sclerosis. Nat Genet 2005; 37: 1108–12.
Lindberg RL, De Groot CJ, Montagne L, Freitag P, Valk P, Kappos L. The expression
profile of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMPs) in lesions and
normal appearing white matter of multiple sclerosis. Brain 2001; 124: 1743-53.
Lindberg RL, Hoffmann F, Mehling M, Kuhle J, Kappos L. Altered expression of miR-17-
5p in CD4+ lymphocytes of relapsing-remitting multiple sclerosis patients. Eur J Immunol.
2010; 40:888–98.
Hecker M, Thamilarasan M, Koczan D, Schröder I, Flechtner K, Freiesleben S, et al.
MicroRNA Expression Changes during Interferon-Beta Treatment in the Peripheral Blood of
Multiple Sclerosis Patients. Int J Mol Sci. 2013; 14: 16087–110.
Liotta LA, Abe S, Robey PG Martin G. Preferential digestion of basement membrane
collagen by an enzyme derived from a metastatic murine tumor. Proc Natl Acad Sci. USA
1979; 76: 2268–72.
Liu PT, Stenger S, Li H et al. Toll like receptor triggering of a vitamin D- mediated human
antimicrobial response. Science 2006; 311: 1170-73.
Liu W, Furuichi T, Miyake M, Rosenberg GA, Liu KJ. Differential expression of tissue
inhibitor of metalloproteinases-3 in cultured astrocytes and neurons regulates the activation
of matrix metalloproteinase-2. J Neurosci Res. 2007; 85: 829–36.
Liuzzi GM, Latronico T, Fasano A, Carlone G, Riccio P. Interferon-beta inhibits the
Liuzzi GM, Trojano M, Fanelli M, Avolio C, Fasano A, Livrea P et al. Intrathecal
synthesis of matrix metalloproteinase-9 in patients with multiple sclerosis: implication for
pathogenesis. Multiple sclerosis 2002; 8: 222–28.
Lobentanz IS, Asenbaum S, Vass K, Sauter C, Klösch G, Kollegger H, et al. Factors
influencing quality of life in multiple sclerosis patients: disability, depressive mood, fatigue
and sleep quality. Acta Neurol Scand 2004; 110: 6–13.
Lossius A, Johansen JN, Vartdal F, et al. High-throughput sequencing of TCR repertoires
in multiple sclerosis reveals intrathecal enrichment of EBV-reactive CD8 (+) T cells. Eur J
Immunol 2014; 44: 3439–52.
Lovrecič L, Ristič S, Starcevič-Cizmarevič N, Jazbec SS, Sepcič J, Kapovič M et al.
Angiotensin-converting enzyme I/D gene polymorphism and risk of multiple sclerosis. Acta
Neurol Scand. 2006; 114: 374-7.
Luomala M, Elovaara I, Ukkonen M, Koivula T, Lehtimäki T. The combination of HLADR1
and HLA-DR53 protects against MS. Neurology 2001; 56: 383-85.
Maeda A, Sobel RA. Matrix metalloproteinases in the normal human central nervous
system, microglial nodules, and multiple sclerosis lesions. J Neuropathol Exp Neurol. 1996;
55: 300–9.
132
Magliozzi R, Howell O, Vora A, Serafini B, Nicholas R, Puopolo M, et al. Meningeal Bcell
follicles in secondary progressive multiple sclerosis associate with early onset of disease
and severe cortical pathology. Brain 2007; 130: 1089-104.
Mahon BD, Gordon SA, Cruz J, Cosman F, Cantorna MT. Cytokine profile in patients
with multiple sclerosis following vitamin D supplementation. J Neuroimmunol 2003;134:
128–32.
Makhani N, Morrow SA, Fisk J, Evans C, Beland SG, Kulaga S, et al. MS incidence and
prevalence in Africa, Asia, Australia and New Zealand: A systematic review. Mult Scler Relat
Disord 2014; 3: 48–60.
Marrie RA. Environmental risk factors in multiple sclerosis aetiology. Lancet Neurol 2004;
3: 709–18.
Marrosu MG, Murru MR, Costa G, Cucca F, Sotgiu S, Rosati G. Multiple sclerosis in
Sardinia is associated and in linkage disequilibrium with HLA-DR3 and -DR4 alleles. Am J
Hum Genet. 1997; 61: 454-57.
Martin R, Bielekova B, Gran B, McFarland HF. Lessons from studies of antigen-specific T
cell responses in Multiple Sclerosis. J Neural Transm Suppl. 2000; 60: 361-73.
Masterman T, Ligers A, Olsson T, Andersson M, Olerup O, Hillert J. HLA-DR15 is
associated with lower age at onset in multiple sclerosis. Ann Neurol 2000; 48: 211–19.
Matejuk A, Dwyer J, Zamora A, Vandenbark AA, Offner H. Evaluation of the effects of
17 beta-estradiol (17beta-e2) on gene expression in experimental autoimmune
encephalomyelitis using DNA microarray. Endocrinology 2002; 143: 313-9.
Matiello M, Schaefer-Klein J, Brum DG, Atkinson EJ, Kantarci OH, Kantarci OH et al.
NMO genetics collaborators. HLA-DRB1*1501 tagging rs3135388 polymorphism is not
associated with neuromyelitis optica. Mult. Scler. 2010; 16: 981-84.
Matrix metalloproteases and their inhibitors are produced by overlapping populations of
activated astrocytes. Brain Res Mol Brain Res 2002; 100: 103–17.
McDonald WI, Compston A, Edan G, Goodkin D, Hartung HP, Lublin FD et al.
Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from International Panel
on the Diagnosis of Multiple Sclerosis. Ann. Neurol 2001; 50: 121–7.
McDonnell GV, Mawhinney H, Graham CA, Hawkins SA, Middleton D. A study of the
HLA-DR region in clinical subgroups of multiple sclerosis and its influence on prognosis. J.
Neurol. Sci. 1999; 165: 77-83.
Minagar A, Alexander JS, Schwendimann RN, Kelley RE, Gonzalez-Toledo E, Jimenez
JJ et al. Combination therapy with interferon beta-1a and doxycycline in multiple sclerosis:
an open-label trial. Arch Neurol 2008; 65:199–204.
Mirowska-Guzel D, Gromadzka G, Czlonkowski A, Czlonkowska A. Association of
MMP1, MMP3, MMP9, and MMP12 polymorphisms with risk and clinical course of multiple
sclerosis in a Polish population. J Neuroimmunol. 2009; 214: 113-7.
Mirshafiey A, Asghari B, Ghalamfarsa G, Jadidi-Niaragh F, Azizi G. The significance of
matrix metalloproteinases in the immunopathogenesis and treatment of multiple sclerosis.
Sultan Qaboos Univ Med J 2014;14 (1): e13-25.
133
Miyadera H, Tokunaga K. Associations of human leukocyte antigens with autoimmune
diseases: challenges in identifying the mechanism. J Hum Genet. 2015; 60 (11): 697-702.
Mkhikian H, Grigorian A, Li CF, Chen HL, Newton B, Zhou RW et al. Genetics and the
environment converge to dysregulate N-glycosylation in multiple sclerosis. Nat Commun
2011; 2: 334.
Moss ML, Jin SL, Milla ME, Bickett DM, Burkhart W, Cartner H. Cloning
of a disintegrin metalloproteinase that processes precursor tumor-necrosis factor-alpha.
Nature 1997; 385: 733-36.
Moussallieh FM, Elbayed K, Chanson JB, et al. Serum analysis by 1H nuclear magnetic
resonance spectroscopy: a new tool for distinguishing neuromyelitis optica from multiple
sclerosis. Mult Scler 2014; 20:558–65.
Muir EM, Adcock KH, Morgenstern DA, Clayton R, von Stillfried N, Rhodes K et al.
Munger K, Köchert K, Simon KC, Kappos K, Polman Ch, Freedman MS et al.
Molecular mechanism underlying the impact of vitamin D on disease activity of MS Ann Clin
Transl Neurol. 2014; 1 (8): 605-17.
Munger KL, Levin LI, Hollis BW, Howard NS, Ascherio A. Serum 25-hydroxyvitamin D
levels and risk of multiple sclerosis. Jama 2006; 296: 2832–8.
Muroski ME, Roycik MD, Newcomer RG, Van den Steen PE, Opdenakker G, Monroe
Nakagawa K. Effect of vitamin D on the nervous system and the sceletal muscle. Clin
Calcium 2006,16:1182-87.
Nakajima T, Jorde LB, Ishigami T, Umemura S, Emi M, Lalouel JM et al. Nucleotide
diversity and haplotype structure of the human angiotensinogen gene in two populations. Am
J Hum Genet. 2002; 70: 108-23.
Narooie-Nejad M, Moossavi M, Torkamanzehi A, Moghtaderi A, Salimi S. Vitamin D
Receptor Gene Polymorphism and the Risk of Multiple Sclerosis in South Eastern of Iran. J
Mol Neurosci. 2015; 56 (3):572-6.
Narooie-Nejad M, Moossavi M, Torkamanzehi A, Moghtaderi A. Positive association of
vitamin D receptor gene variations with multiple sclerosis in South East Iranian population.
Biomed Res Int. 2015; 2015: 427519.
Nelissen I, Dubois B, Goris A, Donese I, Carton H, Opdenakker G. Gelatinase BPECAM-1
and MCP-3 gene polymorphisms in Belgian multiple sclerosis. J Neurol Sci. 2002;
200: 43-48.
Nelissen I, Vandenbroeck K, Fiten P, Hillert J, Olsson T, Marrosu MG. Polymorphism
analysis suggests that the gelatinase B gene is not susceptibility factor for multiple sclerosis. J
Neuroimmunol. 2000; 105, 58-63.
Neurology 2016; 9.pii: 10.1212/WNL.0000000000002564.
Newman TA, Woolley ST, Hughes PM, Sibson NR, Anthony DC, Perry VH. T-cell and
macrophage mediated axon damage in the absence of a CNS-specific immune response:
involvement of metalloproteinases. Brain 2001; 124: 2203–14.
Nexø BA, Villesen P, Nissen KK, Lindegaard HM, Rossing P, Petersen T, et al. Are
human endogenous retroviruses triggers of autoimmune diseases? Unveiling associations of
three diseases and viral loci. Immunol Res 2016;64: 55-63.
134
Nicot A. Gender and sex hormones in multiple sclerosis pathology and therapy. Front Biosci
2009; 14: 4477-515.
Nielsen TR, Pedersen M, Rostgaard K, Frisch M, Hjalgrim H. Correlations between
Epstein-Barr virus antibody levels and risk factors for multiple sclerosis in healthy
individuals. Mult Scler 2007; 13: 420-23.
Nielsen TR, Rostgaard K, Nielsen NM, Koch-Henriksen N, Haahr S, Sørensen PS, et al.
Multiple sclerosis after infectious mononucleosis. Arch Neurol 2007; 64: 72-5.
Niller HH, Wolf H, Ay E, Minarovits J. Epigenetic dysregulation of epstein-barr virus
latency and development of autoimmune disease. Adv Exp Med Biol 2011; 711: 82-102.
Nussbaum RL, McInnes RR, Willard HF. Klinická genetika. Nakladatelství Triton, 2004.
Offner H. Neuroimmunoprotective effects of estrogen and derivatives in experimental
autoimmune encephalomyelitis: therapeutic implications for multiple sclerosis. J Neurosci
Res 2004; 78: 603-24.
Okada K, Adachi H. Human immunoglobulin G suppresses the production of matrix
metalloproteinase-9 in peripheral blood mononuclear cells of patients with multiple sclerosis.
Clinical and Experimental Neuroimmunology 2015; 6:281-88.
Oksenberg JR, Barcellos LF. Multiple sclerosis genetics: leaving no stone unturned. Genes
Immun. 2005; 6:375-87.
Orlow I, Roy P, Reiner AS, Yoo S, Patel H, Paine S et. al.; GEM Study Group. Vitamin D
receptor polymorphisms in patients with cutaneous melanoma. Int J Cancer. 2012; 130 (2):
405-18.
Ortiz GG, Pacheco-Moisés FP, Macías-Islas MÁ, Flores-Alvarado LJ, Mireles-Ramírez
MA, González-Renovato ED et al. Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis.
Arch Med Res 2014; 45:687–97.
Orton SM, Herrera BM, Yee IM, Valdar W, Ramagopalan SV, Sadovnick AD, et al.
Canadian Collaborative Study Group. Sex ratio of multiple sclerosis in Canada: a
longitudinal study. Lancet Neurol 2006; 5:932–36.
Ottervald J, Franzen B, Nilsson K, Andersson LI, Khademi M, Eriksson B et al. Multiple
sclerosis: Identification and clinical evaluation of novel CSF biomarkers. J Proteomics 2010;
3(6): 1117-32.
pathogenesis and treatment. Mult Scler 2004; 10: 290–7.
Pender MP. Infection of autoreactive B lymphocytes with EBV, causing chronic autoimmune
diseases. Trends Immunol 2003; 24:584-88.
Pierrot-Deseilligny C, Souberbielle JC. Contribution of vitamin D insufficiency to the
pathogenesis of multiple sclerosis. Ther Adv Neurol Disord. 2013; 6: 81-116.
Platten M, Youssef S, Hur EM, Ho PP, Han MH, Lanz TV et al. Blocking angiotensinconverting
enzyme induces potent regulatory T cells and modulates TH1- and TH17-mediated
autoimmunity. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106 (35): 14948-953.
Polman CH, Reingold SC, Banwell B, Clanet M, Cohen JA, Filippi M, et al. Diagnostic
criteria for multiple sclerosis: 2010 revisions to the McDonald criteria. Ann Neurol. 2011;
69: 292–302.
135
Polman CH, Reingold SC, Edan G, Filippi M, Hartung HP, Kappos L, et al. Diagnostic
criteria for multiple sclerosis: 2005 revisions to the „McDonald Criteria“. Ann Neurol. 2005;
58: 840–6.
Prat E, Tomaru U, Sabater L, Park DM, Granger R, Kruse N, et al. HLA-DRB5*0101
and -DRB1*1501 expression in the multiple sclerosis-associated HLA-DR15 haplotype. J
Neuroimmunol 2005;167: 108–19.
Prat E, Tomaru U, Sabater L, Park DM, Granger R, Kruse N, et al. HLA-DRB5*0101
and -DRB1*1501 expression in the multiple sclerosis-associated HLA-DR15 haplotype. J
Neuroimmunol. 2005; 167: 108–19.
Presthus J. Report on the multiple sclerosis investigations in West-Norway. Acta Psychiatr
Scand Suppl 1960; 35:88–92.
Proost P, Van Damme J, Opdenakker G. Leukocyte gelatinase B cleavage releases
encephalitogens from human myelin basic protein. Biochem Biophys Res Commun. 1993;
192: 1175-81.
Ram M, Sherer Y, Shoenfeld Y. Matrix Metalloproteinase-9 and Autoimmune Diseases. J
Clin Immunol 2006; 26:299-307.
Ramagopalan SV, Maugeri NJ, Handunnetthi L, Lincoln MR, Orton SM, Dyment DA et
al. Expression of the multiple sclerosis-associated MHC class II Allele HLA-DRB1*1501 is
regulated by vitamin D. PloS Genet. 2009;5: e1000369.
Randerson-Moor JA, Taylor JC, Elliott F, Chang YM, Beswick S, Kukalizch K et al.
Vitamin D receptor gene polymorphisms, serum 25-hydroxyvitamin D levels, and melanoma:
UK case-control comparisons and a meta-analysis of published VDR data. Eur J Cancer.
2009; 45: 3271-81.
Reinke S, Broadhurst D, Sykes B, et al. Metabolomic profiling in multiple sclerosis:
insights into biomarkers and pathogenesis. Mult Scler 2014; 20:1396–400.
Ristori G, Cannoni S, Stazi MA, Vanacore N, Cotichini R, Alfò M, et al. Multiple
sclerosis in twins from continental Italy and Sardinia: a nationwide study. Ann Neurol 2006;
59:27–34.
Robinson J, Waller MJ, Parham P, de Groot N, Bontrop R, Kennedy LJ, et al.
IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major
histocompatibility complex. Nucleic Acids Res. 2003; 1:311-4.
Roxburgh RH, Seaman SR, Masterman T, Hensiek AE, Sawcer SJ, Vukusic S et al.
Multiple Sclerosis Severity Score: using disability and disease duration to rate disease
severity. Neurology 2005; 64, 1144-1151.
Royal W 3rd, Mia Y, Li H, Naunton K. Peripheral blood regulatory T cell measurements
correlate with serum vitamin D levels in patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol
2009; 213:135-41.
Sadovnick AD. Genetic background of multiple sclerosis. Autoimmun Rev 2012; 11:163-66.
Salo T, Lyons JG, Rahemtulla F, Birkedal-Hansen H, Larjava H. Transforming
growth factor-pl up-regulates type IV collagenase expression in cultured human
keratinocytes. J Biol Chem. 1991; 266:11436–41.
136
Sanders VJ, Felisan S, Waddell A, Tourtellotte WW. Detection of herpesviridae in
postmortem multiple sclerosis brain tissue and controls by polymerase chain reaction. J
Neurovirol 1996; 2:249–58.
Schmidt H, Williamson D, Ashley-Koch A. HLA-DR15 haplotype and multiple sclerosis: a
HuGE review. Am J Epidemiol 2007; 165:1097-109.
Schmied MC, Zehetmayer S, Reindl M, Ehling R, Bajer-Kornek B, Leutmezer F et al.
Replication study of multiple sclerosis (MS) susceptibility alleles and correlation of DNAvariants
with disease features in a cohort of Austrian MS patients. Neurogenetics. 2012;
13:181-7.
Sellebjerg F, Sørensen TL. Chemokines and matrix metalloproteinase-9 in leukocyte
recruitment to the central nervous systém. Brain Res Bull. 2003; 61: 347-55.
Seltzer JL, Adams SA, Grant GA, Eisen AZ. Purification and properties of a gelatinspecific
neutral protease from human skin. J Biol Chem. 1981; 256: 4662–68.
Seltzer JL, Eisen AZ, Bauer EA, Morfia NP, Glanville RW, Burgeson RE. Cleavage of
type VII collagen by interstitial collagenase and type IV collagenase (gelatinase) derived
from human skin. J Biol Chem. 1989, 264: 3822–26.
Shimizu F, Tasaki A, Sano Y, Ju M, Nishihara H, Oishi M et al. Sera from remitting and
secondary progressive multiple sclerosis patients disrupt the blood-brain barrier. PLoS One
2014;9: e92872.
Shoenfeld Y, Fučíková T, Bartůňková J. Autoimunita -vnitřní nepřítel. Grada 2007; ISBN:
8024720449.
Simon KC, Munger KL, Ascherio A. Vitamin D and multiple sclerosis: epidemiology,
immunology, and genetics. Curr Opin Neurol. 2012; 25 (3): 246-51. Polymorphisms in
vitamin D metabolism related genes and risk of multiple sclerosis.Simon KC, Munger KL,
Xing Yang, Ascherio AMult Scler. 2010 Feb; 16(2):133-8.
Sioka C, Papakonstantinou S, Markoula S, Gkartziou F, Georgiou A, Georgiou I, et al.
Vitamin D receptor gene polymorphisms in multiple sclerosis patients in northwest Greece. J
Negat Results Biomed. 2011; 10: 3. 42
Smith KJ, Pyrdol J, Gauthier L, Wiley DC, Wucherpfennig KW. Crystal structure of
HLA-DR2 (DRA*0101, DRB1*1501) complexed with a peptide from human myelin basic
protein. J Exp Med. 1998;188(8):1511-20.
Smolders J, Damoiseaux J, Menheere P, Tervaert JW, Hupperts R. Association study on
two vitamin D receptor gene polymorphisms and vitamin D metabolites in multiple sclerosis.
Ann N Y Acad Sci. 2009; 1173: 515-20.
Smolders J, Thewissen M, Peelen E, Menheere P, Tervaert JW, Damoiseaux J et al.
Vitamin D status is positively correlated with regulatory T cell function in patients with
multiple sclerosis. PLoS One 2009 13;4: e6635.
Soldan SS, Berti R, Salem N, Secchiero P, Flamand L, Calabresi PA, et al. Association of
human herpes virus 6 (HHV-6) with multiple sclerosis: increased IgM response to HHV-6
early antigen and detection of serum HHV-6 DNA. Nat Med 1997; 3:1394–97.
Soliven B, Szuchet S. Signal transduction pathways in oligodendrocytes: role of tumor
necrosis factor-alpha. Int J Dev Neurosci. 1995; 13: 351-67.
137
Sombekke MH, Lukas C, Crusius JB, Tejedor D, Killestein J, Arteta D, et al. HLADRB1*1501
and spinal cord magnetic resonance imaging lesions in multiple sclerosis. Arch
Neurol. 2009; 66: 1531-36.
Spach KM, Nashold FE, Dittel BN, et al. IL-10 signaling is essential for 1,25
dihydroxyvitamin D3- mediated inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis. J
Immunol 2006; 177: 6030-37.
Steelman AJ. Infection as an Environmental Trigger of Multiple Sclerosis Disease
Exacerbation. Front Immunol 2015; 6:520.
Stegbauer J, Lee DH, Seubert S, Ellrichmann G, Manzel A, Kvakan H et al. Role of the
renin-angiotensin system in autoimmune inflammation of the central nervous system. Proc
Natl Acad Sci U S A 2009; 106 (35): 14942-47.
Šterzl Ivan, et al. Základy imunologie. 1. vydání, Praha: Karolinum, 2005.
Stetler-Stevenson WG, Brown PD, Onisto P, Levy AT, Liotta LA. Tissue inhibitor
of metalloproteinases-2 (TIMP-2) mRNA expression in tumor cell lines and human tumor
tissues. J Biol Chem. 1990, 265: 13933–38.
Stoop MP, Dekker LJ, Titulaer MK, Lamers RJ, Burgers PC, Sillevis Smitt PA et al.
Quantitative Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Fourier Transform Ion Cyclotron
Resonance (MALDIFT-ICR) Peptide Profiling and Identification of Multiple-SclerosisRelated
Proteins. J Proteome Res 2009; 8 (3): 1404-14.
Stoop MP, Rosenling T, Attali A, Meesters RJ, Stingl C, Dekker LJ et al. Minocycline
effects on the cerebrospinal fluid proteome of experimental autoimmune encephalomyelitis
rats. J Proteome Res 2012; 11: 4315-25.
Sundström P, Juto P, Wadell G, Hallmans G, Svenningsson A, Nyström L, et al. An
altered immune response to Epstein-Barr virus in multiple sclerosis: a prospective study.
Neurology 2004;62: 2277-82.
Sundström P, Nyström M, Ruuth K, Lundgren E. Antibodies to specific EBNA-1 domains
and HLA DRB1*1501 interact as risk factors for multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 2009
30; 215: 102-7.
Szklarczyk A, Conant K. Matrix metalloproteinases, synaptic injury, and multiple sclerosis.
Front Psychiatry 2010; 1:130.
Tajouri L, Ovcaric M, Curtain R, Johnson MP, Griffiths LR, Csurhes P et al. Variation
in the vitamin D receptor gene is associated with multiple sclerosis in an Australian
population. J Neurogenet. 2005; 19 (1): 25-38.
Tejada-Simon MV, Zang YC, Hong J, Rivera VM, Zhang JZ. Cross-reactivity with
myelin basic protein and human herpesvirus-6 in multiple sclerosis. Ann Neurol. 2003; 53:
189-97.
Teutsch SM, Booth DR, Bennetts BH, Heard RN, Stewart GJ. Identification of 11 novel
and common single nucleotide polymorphisms in the interleukin-7 receptor-alpha gene and
their associations with multiple sclerosis. Eur. J. Hum. Genet; 2003; 11: 509-15.
Thacker EL, Mirzaei F, Ascherio A. Infectious mononucleosis and risk for multiple
sclerosis: a meta-analysis. Ann Neurol 2006; 59:499-503.
Thyroid. 2010; 20 (7): 715-25
138
Thompson AJ, Banwell BL, Barkhof F, Carroll WM, Coetzee T, Comi G et al. Diagnosis
of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurol. 2018; 17(2):
162-73.
Tizaoui T, Kaabachi W, Hamzaoui A, Hamzaoui K. Association between vitamin D
receptor polymorphisms and multiple sclerosis: systematic review and meta-analysis of casecontrol
studies. Cell Mol Immunol. 2015; 12: 243-52.
Tomer Y. Genetic susceptibility to autoimmune thyroid disease: past, present, and future.
van Heemst J, Huizinga TJ, van der Woude D, Toes RE. Fine-mapping the human
leukocyte antigen locus in rheumatoid arthritis and other rheumatic diseases: identifying
causal amino acid variants? Curr Opin Rheumatol. 2015; 27 (3): 256-61.
van Sechel AC, Bajramovic JJ, van Stipdonk MJ, Persoon-Deen C, Geutskens SB, van
Noort JM. EBV-induced expression and HLA-DR-restricted presentation by human B cells of
alpha B-crystallin, a candidate autoantigen in multiple sclerosis. J Immunol 1999; 162:129-
35.
Vachová M. Epidemie roztroušené sklerózy ve světě? Cesk Slov Neurol N 2012;75/108:701-
6.
Vašků A, Goldbergová M, Izakovičová Hollá L, Šišková L, Groch L, Beránek M.
A haplotype constituted of four MMP-2 promoter polymorphisms (-1575G/A, -1306C/T,
-790T/G and -735C/T) is associated with coronary triple-vessel disease. Matrix Biol. 2004;
22: 585-91.
Vos CMP, van Haastert ES, de Groot CJA, van der Valk P, Vries HE. Matrix
metalloproteinase-12 is expressed phagocytotis macrophages in active multiple sclerosis
lesions. J Neuroimmunol. 2003; 138: 106-14.
Vukusic S, Van Bockstael V, Gosselin S, Confavreux C. Regional variations in the
prevalence of multiple sclerosis in French farmers. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2007;78:
707-9.
Wang PP, Nestel EP, Bordeau V et al. Cutting edge: 1.25 dihydroxyvitamin D3 is a direct
inducer of antimicrobial peptide gene expresssion. J Immunol 2004; 173: 2909-12.
Wang TT, Tavera-Mendoza LE, Laperriere D, et al. Large-scale in silico and microarraybased
indentification of direct 1.25 dihydroxyvitamin D3 target genes. Mol Endocrinol
2005;19: 2685-95.
Wang X, Tromp G, Cole CW, Verloes A, Sakalihasan N, Yoon S et al. Analysis of coding
sequences for tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP1) and (TIMP2) in patients with
aneurysms. Matrix Biol 1999;1n8:121–24.
Waubant E, Goodkin D, Bostrom A, Bacchetti P, Hietpas J, Lindberg R et al. IFN beta
lowers MMP-9/TIMP-1 ratio, which predicts new enhancing lesions in patients with SPMS.
Neurology 2003; 60: 52-57.
Weatherby SJ, Thomson W, Pepper L, Donn R, Worthington J, Man CL, et al. HLADRB1
and disease outcome in multiple sclerosis. J. Neurol. 2001; 248: 304-310.
Weber F, Fontaine B, Cournu-Rebeix I, Kroner A, Knop M, Lutz S et al. IL2RA and
IL7RA genes confer susceptibility for multiple sclerosis in two independent European. Genes
Immun. 2008; 9: 259-63.
139
Weinstock GM. Genomic approaches to studying the human microbiota. Nature. 2012; 489:
250–6.
Wekerle H. Nature plus nurture: the triggering of multiple sclerosis. Wekerle H. Swiss Med
Wkly. 2015; 145: w14189.
Welgus HG, Campbell EJ, Cury JD, Eisen AZ, Senior RM, Wilhelm SM. Neutral
metalloproteinases produced by human mononuclear phagocytes. Enzyme profile, regulation,
and expression during cellular development. J Clin Invest. 1990; 86: 1496-502.
Whitacre CC, Reingold SC, O'Looney PA. A gender gap in autoimmunity. Science 1999;
283:1277-8.
Willer CJ, Dyment DA, Risch NJ, Sadovnick AD, Ebers GC; Canadian Collaborative
Study Group. Twin concordance and sibling recurrence rates in multiple sclerosis. Proc Natl
Acad Sci U S A 2003; 100:12877-82.
Willer CJ, Herrera BM, Morrison KM, Sadovnick AD, Ebers GC; Canadian
Collaborative Study on Genetic Susceptibility to Multiple Sclerosis. Association between
microchimerism and multiple sclerosis in Canadian twins. J Neuroimmunol 2006; 179:145-
51.
World Health Organization, Multiple Sclerosis International Federation. Atlas: Multiple
Sclerosis Resources in the World. Geneva, Switzerland: World Health Organization;2008.
Wosik K, Cayrol R, Dodelet-Devillers A, Berthelet F, Bernard M, Moumdjian R et al.
Angiotensin II controls occludin function and is required for blood brain barrier
maintenance: relevance to multiple sclerosis. J Neurosci 2007; 27:9032-42.
Wu H, Zhao M, Yoshimura A, Chang C, Lu Q. Critical Link Between Epigenetics and
Transcription Factors in the Induction of Autoimmunity: a Comprehensive Review. Clin Rev
Allergy Immunol 2016;11.
www.allele frequencies.net/test/deafault1.asp. Allele frequencies in worldwide populations.
Xiao D, Ye X, Zhang N, Ou M, Guo C, Zhang B et al. A meta-analysis of interaction
between Epstein-Barr virus and HLA-DRB1*1501 on risk of multiple sclerosis. Sci Rep
2015;5: 18083.
Xu E, Xia X, Lu B, Xing X, Juany Q, Ma Y. Association of matrix metalloproteinase-2
Xu MQ, Cao HL, Wang WQ, Wang S, Cao XC, Yan F et al. Fecal microbiota
transplantation broadening its application beyond intestinal disorders. World J Gastroenterol
2015; 21: 102–11.
Yanai K, Saito T, Hirota K, Kobayashi H, Murakami K, Fukamizu A. Molecular
variation of the human angiotensinogen core promoter element located between the TATA
box and transcription initiation site affects its transcriptional activity. J Biol Chem 1997; 272:
30558–62.
Yushchenko M, Mader M, Elitok E, Bitsch A, Dressel A, Tumani H et al.
Interferon-beta-1b decreased matrixmetalloproteinase-9 serum levels in primary progressive
multiple sclerosis. J Neurol. 2003; 250: 1224-28.
Zhang B, Ye S, Herrmann SM, Eriksson P, Maat M, Vand A. Functional
polymorphism in the regulatory region of gelatinase B gene in relation to severity of coronary
atherosclerosis. Circulation 1999; 99: 1788-94.
140
Zhou Y, Yu Ch, Miao X, Tan W, Liang G, Xiong P et al. Substantial reduction in risk of
breast cancer associated with genetic polymorphisms in the promoters of the matrix
metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 genes. Carcinogenesis 2004;
25: 399-404.
Živkovič M, Djurič T, Dinčič E, Rajčevič R, Alavantič D, Stankovič A. Matrix
metalloproteinase-9-1562C/T gene polymorphism in Serbian patients with multiple sclerosis.
J Neuroimmunol. 2007; 189: 147-50.
Živkovič M, Kolaković A, Stojković L, Dinčić E, Kostić S, Alavantić D et al. Reninangiotensin
system gene polymorphisms as risk factors for multiple sclerosis. J Neurol Sci.
2016; 363: 29-32.
Živkovič M, Stankovič A, Dinčič E, Popovič M, Popovič S, Raicević R et al. The tag SNP
for HLA-DRB1*1501, rs3135388, is significantly associated with multiple sclerosis
susceptibility: cost-effective high-throughput detection by real-time PCR. Clin. Chim. Acta.
2009; 406: 27-30.
Zoukos Y. Disease-modifying treatments: mode of action. J Neurol 2004; 251: V/19-V/24.
Zuvich RL, McCauley JL, Oksenberg JR, Sawcer SJ, De Jager PL; International
Multiple Sclerosis Genetics Consortium, Aubin C, Cross AH, Piccio L, Aggarwal NT,
Evans D, Hafler DA, et al. Genetic variation in the IL7RA/IL7 pathway increases multiple
sclerosis susceptibility. Hum Genet. 2010; 127:525-35.