MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA ÚSTAV PATOLOGICKÉ FYZIOLOGIE MIKROPROSTŘEDÍ NÁDORŮ HLAVY A KRKU A JEHO DIAGNOSTICKÝ POTENCIÁL Habilitační práce Brno 2018 MUDr. Jaromír Gumulec, Ph.D. 2 3 Abstrakt Úvod. Nádory v oblasti hlavy a krku jsou jedny z nejzávažnějších onkologických onemocnění v ČR a ve světě. Hlavním prognostickým indikátorem pacientů s těmito nádory a současně nástrojem volby léčebné strategie je zařazení do klinického stádia; prognostické biomarkery pro nádory hlavy a krku neexistují a současně odpovídavost na léčbu i v rámci jednoho stádia je velmi heterogenní. Cílem této práce je tuto heterogenitu uchopit pomocí studia nádorového mikroprostředí a na základě získaných dat navrhnout klinicky aplikovatelné závěry. Metodika. Mikroprostředí bylo studováno víceúrovňově – na úrovni séra a tkáňových vzorků pomocí analýzy přežití, ale také na úrovni jednotlivých subpopulací buněk získaných z nádorových vzorků pacientů. Bylo využito metod analýzy genové exprese, metod studia buněčné migrace, invazivity, buněčného růstu a byla analyzována míra reparace dvouřetězcových zlomů DNA. Výsledky. Bylo zjištěno, že transkriptom tkáně přiléhající k tumoru byl v mnoha ohledech „podobnější“ nádorové tkáni a bylo možné jej využít k predikci přítomnosti nádoru. Byl také prokázán prognostický význam BAX, BCL2, TP53 a EGF. V heterogenním prostředí nádorů hlavy a krku byly studovány populace s povrchovými antigeny CD44 a CD90. Populace CD44 je významně zapojena do patogeneze prostřednictvím své účasti v molekulárně-biologických procesech de-diferenciace, proliferace a apoptózy. Populace CD90+ „s nádorem asociovaných fibroblastů“ zásadně podporuje růst vlastní nádorové populace a propůjčuje rezistenci k radioterapii jiným subpopulacím a je tak významným podpůrným článkem nádorového mikroprostředí. Závěr. Přístup k vývoji nových diagnostických a (zejména pak) léčebných strategií musí heterogenitu mikroprostředí reflektovat, protože právě toto je jedna z cest – možná cesta zásadní – pro personalizovanou medicínu potenciálně schopnou radikálního zlepšení prognózy pacientů s pokročilými nádory. Klíčová slova nádory hlavy a krku; prognóza; biomarker; nádorové mikroprostředí; CD90; CD44; migrace; radioterapie; dvouřetězcové zlomy DNA; miRNA 4 Abstract Introduction. Head and neck cancers are one of the most serious oncological diagnoses in the Czech Republic and globally. The main prognostic indicator and a therapy-planning tool is based on staging of tumours. Prognostic biomarkers for head and neck tumours do not exist, and concurrently therapy response is very heterogeneous even within one stage. The aim of the thesis is to propose clinically applicable conclusions by studying the tumour microenvi- ronment Methods. The microenvironment was studied at the level of serum, tissue samples using survival analysis, but also at the level of individual subpopulations of cells obtained from tumour samples of patients. Methods of gene expression analysis, analysis of cell migration, invasiveness, cell growth were used and the analysis of repair of two-strand DNA breaks were used. Results. It has been found that tumour-adjacent tissue transcripts have been in many respects "more similar" to tumour tissues, and this could be used to predict the presence of the tumour. Also the prognostic importance of BAX, BCL2, TP53 and EGF was revealed. In the heterogeneous environment of head and neck tumours, cells with surface antigens CD44 and CD90 were studied. The CD44 population is significantly involved in pathogenesis through its participation in molecular-biological processes of de-differentiation, proliferation and apoptosis. “Tumourassociated fibroblasts” – the CD90+ cells strongly support the growth of tumour population and provides resistance to radiotherapy to other subpopulations and are thus significant supportive element of the tumour microenvironment. Conclusions. Development of new diagnostic and (especially) treatment strategies must reflect the heterogeneity of the microenvironment, as this is one of the paths – perhaps the most important – for personalized medicine potentially able to radically improve the prognosis of patients with advanced tumours. Keywords head and neck tumours; prognosis; biomarker; tumour microenvironment; CD90; CD44; migration; radiotherapy; double strand DNA breaks; miRNA 5 Děkuji za podporu kolegům tvořícím podnětné zázemí pro práci. Díky patří také rodině. 6 Obsah Obsah ............................................................................................................................ 6 1 Úvod .................................................................................................................... 7 1.1 Prognostické biomarkery..................................................................................... 7 1.1.1 Markery klíčových procesů kancerogeneze ........................................................ 8 1.1.2 microRNA jako marker metastáz ........................................................................ 9 1.1.3 Markery odpovědi na (radio)terapii................................................................... 10 1.2 Etiologické faktory nádorů hlavy a krku ........................................................... 10 1.3 Mikroprostředí nádoru....................................................................................... 11 1.3.1 Heterogenita mikroprostředí.............................................................................. 12 1.4 Přehledové články.............................................................................................. 13 1.4.1 Klinická významnost biomarkerů HNSCC – přehledový článek...................... 13 1.4.2 Biomarkery klíčových procesů kancerogeneze – kapitola v knize.................... 24 1.4.3 Role zinku a mědi u HNSCC – review a meta-analýza..................................... 71 2 Hypotézy práce.................................................................................................. 99 3 Metodické přístupy.......................................................................................... 100 4 Výsledky (komentovaný soubor publikací)..................................................... 101 4.1 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA............................................ 101 4.2 Prognostická role c-Met: meta-analýza ........................................................... 114 4.3 Molekulární markery HNSCC na úrovni miRNA........................................... 122 4.4 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru........................................... 130 4.5 Molekulární markery HNSCC na úrovni proteinu .......................................... 139 4.6 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů........................... 146 4.7 Charakterizace buněk mikroprostředí.............................................................. 156 4.8 Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC ................................ 173 4.9 Změny v transkriptomu po ozáření.................................................................. 182 5 Diskuse výsledků............................................................................................. 185 6 Závěr................................................................................................................ 189 7 Použitá literatura.............................................................................................. 190 Prognostické biomarkery 1.1 7 1 Úvod Nádory v oblasti hlavy a krku jsou jedny z nejzávažnějších onkologických onemocnění v rámci České republiky a také ve světě. Označením „nádory hlavy a krku“ se rozumí nádory dutiny ústní (rty, první dvě třetiny jazyka, sliznice dutiny ústní), slinných žláz, faryngu (nazofarynx, orofarynx, hypofarynx) a laryngu. V naprosté většině se jedná o nádory spinocelulární, „head and neck squamous cell carcinoma“, HNSCC (výjimku tvoří právě např. nádory slinných žláz)1,2 . Vzhledem ke svému umístění jsou nádory hlavy a krku, resp. jejich léčba, zejména v pokročilých stádiích, významně mutilující diagnózou. Podobně jako u jiných onkologických malignit je časný záchyt klíčovým předpokladem příznivé prognózy2,3 . Ukazatelem pokročilosti je klasifikace TNM a zařazení do klinického stádia I-IV. I přes specifika jednotlivých lokalit platí, že zatímco lokalizovaná stádia I-II vykazují dobrou prognózu, lokálně pokročilý nádor je terapeuticky zvládnutelný obtížně s pětiletým přežitím 25% a 4% pro stádia IVa a IVb 4 ; přibližně u poloviny diagnostikovaných s pokročilým tumorem dochází během prvních let k recidi- vám5,6 . Prognosticky nepříznivý je také fakt, že v 60 % dochází k primozáchytům právě v těchto pozdních stádiích7 . 1.1 Prognostické biomarkery Hlavním prognostickým indikátorem pacientů s nádory hlavy a krku a současně nástrojem volby léčebné strategie je zařazení do klinického stádia8 . Nicméně odpovídavost na léčbu a prognóza pacientů i v rámci jednoho stádia jsou velmi heterogenní. Klinicky využitelné prognostické biomarkery podobné PSA pro nádor prostaty, či estrogenovému receptoru či HER2 pro nádor prsu9,10 pro nádory hlavy a krku neexistují. V prvních částech práce bylo cílem ověřit prediktivní, resp. prognostickou roli molekulárních markerů v rozvoji HNSCC (kapitoly 4.1, 4.2, 4.3 a 4.5). Tyto markery byly z literatury vytipovány na základě jejich významné funkce v jednom z následujících zásadních kroků kancerogeneze: (1) autonomní signalizace, zvýšená míra proliferace, (2) buněčná smrt, regulace buněčného cyklu, (3) odpověď na zvýšený (oxidační) stres v nádorovém mikroprostředí, (4) angiogeneze, (5) schopnost zakládat metastázy a (6) odpověď na radioterapii. Prognostické biomarkery 1.1 8 1.1.1 Markery klíčových procesů kancerogeneze V současnosti byly popsány desítky molekul s prediktivním/prognostickým potenciálem pro HNSCC. Ty jsou systematicky shrnuty a rozčleněny v kapitole Raudenská et al. „HNSCC Biomarkers Derived from Key Processes of Cancerogenesis“ v knize „Targeting Oral Cancer“ (dostupná na str. 25), resp. v přehledovém článku Polanska et al11 dostupném na str. str. 14. V textu níže jsou zmíněny ty „kandidátní biomarkery“, které byly předmětem našich experimentálních prací. Nezbytným krokem růstu buněk je proliferační signalizace. Toho je u nádorových buněk docíleno aktivací proto-onkogenů12 , díky čemuž se tyto buňky stávají nezávislé na exogenních růstových faktorech. Pro nádory hlavy a krku je klíčovým proto-onkogenem receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR). Jedná se o transmembránovou tyrozin kinázu patřící do rodiny ErB/HER13-15 . K jeho fyziologické aktivaci dochází při navázání ligandu EGF, TGF-α, či amphiregulinu, čímž dojde k dimerizaci EGFR a autofosforylaci tyrozin-kinázové domény EGFR. Takto aktivovaný receptor aktivuje zejména signální dráhy RAS a PI3K a tím ovlivňuje proli- feraci16 , viz obrázek na str. 28. Na základě studií je popsáno, že zvýšená míra exprese EGFR se vyskytuje až u 90 % všech spinocelulárních nádorů hlavy a krku a bývá popsána již u premaligních lézí 17-19 . Studie popisují spojitost s nepříznivou prognózou 11 ,20,21 , s vysokou mírou proliferace, s angiogenezí a s vysokou mírou invazivity národových buněk. Ve spojitosti s EGFR, resp. s rezistencí oproti inhibitorům novými terapeutiky, je také studován tyrozinkinázový receptor pro hepatocytární růstový faktor, c-Met. Jeho fyziologická úloha je spojena s klíčovými procesy během embryogeneze a hojení ran, jmenovitě např. schopnost migrujících buněk odloučit se of extracelulární matrix, uniknout anoikis a zůstat v novotvořené tkáni22 (viz kapitola 4.2). Další klíčovou vlastností nádorových buněk je únik buněčné smrti12 . Mezi nejzásadnější mechanismy ovlivnění buněčné smrti patří mutace supresoru TP53, snížení exprese apoptózu vyvolávajících faktorů (BAX, BIM aj.)23 , zvýšení exprese anti-apoptotických proteinů(např. BCL-xL, BCL2) 24 , či narušení regulace buněčného cyklu 25 . U HNSCC bylo popsáno, že zvýšená exprese BCL-xL a BCL2 se významně podílí na rozvoji tohoto nádoru26 . Jakmile populace nádorové masy přesáhne velikost řádově jednoho mm3 , difuze kyslíku a nutrientů přestává buňkám stačit a v případě jejich dlouhodobého nedostatku tento proces vyústí v nekrózu buněk. Nádorové buňky, podobně jako tomu dochází při hojení ran, jsou schopny indukovat novotvorbu cév. Jedním ze zásadních působků je vaskulární endoteliální růstový faktor A (VEGFA). Ten je indukován zejména transkripčním faktorem indukovaným hypoxií (HIF1A) či prostřednictvím EGFR27,28 . Studie zabývající se HNSCC potvrzují, že míra exprese Prognostické biomarkery 1.1 9 VEGFA koreluje s rezistencí vůči chemoterapii a tím s horší prognózou pacientů a také s pokročilostí nádoru a s horším celkovým přežitím 29-34 . Počáteční fáze kancerogeneze jsou doprovázeny procesy, které se podobají hojení ran. Doprovodným jevem bývá chronický zánět a zvýšená míra oxidativního stresu 35 . Existuje celá řada metod studia redoxního stavu buněk– mikroskopicky na základě fluorescenčních barviv, na základě antioxidační kapacity, na základě míry exprese genů zodpovědných za syntézu antioxidantů (glutathion reduktáza, peroxidáza, aj.) či na základě exprese antioxidačně působících proteinů, např. metalothioneinu (MT)36-38 . Tento protein byl ve vztahu ke spinocelulárním nádorům hlavy a krku studován v řadě studií39-41 a na základě námi provedené meta-analýzy Gumulec et al. byla prokázána vyšší exprese v nádorových tkáních (odds ratio, OR 9,95; 95% CI 5,82-17,03)42 . Vztah tkáňové exprese genů EGF, EGFR, MKI67, BCL2, BAX, FOS, JUN, TP53, VEGF, FLT1, MMP2, MMP9, MT1A a MT2A a spinocelulárních karcinomů je popsán ve studii Raudenska et al. na str. 103. Jejich vztah s HPV statusem pacientů byl zkoumán v práci Polanska et al. na str. 147. Vztah sérových hladin EGFR byl asociován s prognózou, viz studie Polanska et al. na str. 140, kapitola 4.5. 1.1.2 microRNA jako marker metastáz Extenzivně studovanými HNSCC biomarkery jsou také microRNA (miRNA). MiRNA jsou skupinou malých nekódujících RNA molekul s významnou funkcí v regulaci genové exprese na post-transkripční úrovni. Jejich velikost se pohybuje okolo 20 nukleotidů. MiRNA se nepřekládají do proteinové struktury a svým regulačním působením ovlivňují buněčné procesy jako je proliferace, diferenciace, apoptóza, metastázování, angiogeneze a imunitní odpověď. Mnohé studie potvrdily, že miRNA je dobrým biomarkerem, protože je rezistentní ke štěpení ribonukleázami, vydrží bez trvalého poškození extrémní pH i teplotu a jejich distribuce v tkáních a tělních tekutinách se mění v závislosti na druhu, stupni a stádiu nemoci43 . V této práci byla studována exprese miR-200b-5p, miR-29c-3p, miR-34a-5p a miR-375, viz práce Hudcova et al. na str. 123 a metodická studie Hudcova et al. na str. 131. Signální dráha TGF-β/ZEB/miR-200 je zapojena do regulace epiteliálně-mezenchymální tranzice, miR-29 funguje v roli nádorového supresoru, protože potlačuje migraci a invazivitu nádorových buněk prostřednictvím inhibice signální dráhy laminin-integrin, mezi další potenciální nádorověsupresorové faktory patří též miR-34a-5p 44 a miR-375 45 . Etiologické faktory nádorů hlavy a krku 1.2 10 1.1.3 Markery odpovědi na (radio)terapii Nádory hlavy a krku jsou typicky agresivními neopláziemi s vysokou mírou rekurence a nepříznivou prognózou. Kvůli jejich fyzikální blízkosti k vitálním strukturám je užití radikálního chirurgického přístupu často nemožné, neboť může způsobit výrazné snížení kvality života pacientů. V těchto případech jsou preferovány nechirurgické postupy (chemo/radioterapie). Častou limitací těchto přístupů je obtížně predikovatelná radiorezistence, vyskytující se přibližně u 50 % spinocelulárních karcinomů hlavy a krku46 . Selhání radioterapie dramaticky zhoršuje výsledky sekundárně volené „salvage“ chirurgie v porovnání s primárně provedenou operací47 . Správné rozhodnutí první terapeutické modality je proto klíčovým krokem dramaticky ovlivňujícím pacientovo přežití. V současnosti neexistují biomarkery umožňující radiosenzitivitu predikovat dříve, než započne léčba. Je tomu zejména z důvodu výrazné genetické a fenotypové heterogenity nádorové populace, charakteristické zejména pro HNSCC; nádory hlavy a krku se často pohybují ve spektru obou extrémů radiorezistence-radiosenzitivita48 . Ačkoli v minulosti proběhly studie poukazující na geny s potenciálem predikovat rezistentní nádory, „founder“ mutace těchto genů nejsou známy, a tak je výpovědní hodnota takovýchto markerů oslabena49 . Radioterapie je tak často aplikována na základě odezvy na neoadjuvantní chemoterapii s očekáváním obdobné reakce. Míru citlivosti k radioterapii je nicméně možné nepřímo odhadovat na základě komplexních odpovědí buněk na poškození DNA, zejména pak pak na základě míry aktivace opravných mechanismů dvouřetězcových zlomů, typicky vyvolaných právě radioterapií či některými typy chemoterapie. Mimo tento mechanismus jsou studovány další mechanismy – rezistence k apoptóze50 , poškození regulace buněčného cyklu51 , schopnost dělit se s poškozením ge- nomu52 , či schopnost navrátit se do buněčného cyklu i přes aktivaci senescence53 . Situaci komplikuje fakt, že mechanismus radiorezistence je rozdílný nejen u různých nádorů, ale dokonce u různých subpopulací v rámci jednoho nádoru (a vzájemnými interakcemi mezi těmito subpopulacemi) 54 V další části této práce (viz studie Falk et al. na str. 175) byla zaměřena pozornost právě na objasnění asociace mezi mírou reparace dvouřetězcových zlomů s přežíváním buněk in vitro a s prognostickými ukazateli pacientů. 1.2 Etiologické faktory nádorů hlavy a krku Nejzásadnější rizikové faktory spojené s rozvojem HNSCC jsou konzumace tabáku, nadužívání alkoholu, rizikové sexuální chování a v neposlední řadě také genetická predispozice. Některé Mikroprostředí nádoru 1.3 11 dědičné choroby, jako například Fanconiho anemie, vysoce predisponují svého nositele k brzkému rozvoji HNSCC55 . V 80. letech dvacátého století byl odhalen vliv lidského papillomaviru (HPV) v incidenci HNSCC56 . Výskyt HPV indukovaného HNSCC vykazuje významné geografické vlivy; ve Švédsku jde o 90 % nádorů, v zemích s vysokou konzumací tabáku je podíl indukovaného HNSCC výrazně menší, přibližně 20%57 . Existuje Více než sto typů HPV 58 , ve vztahu ke spinocelulárním nádorům jsou nejrizikovější subtypy HPV16 a 1859,60 . Viry přednostně napadající epitel tonzilárních krypt a jsou zdrojem proteinů E6 a E7. Ty inaktivují klíčové tumor supresory – TP53, RB1, P21 aj. a tím umožní průchod buněčným cyklem11 (blíže obrázek na str. 15), ovlivňují buněčnou diferenciaci61 , genovou nestabilitu62 a antivirovou obranu 63 . Biologicky jsou proto HPV+ a HPV– nádory hlavy a krku velmi odlišná onemocnění, byť se jedná o stejný histologický typ tkáně11,64-66 . HPV+ HNSCC pacienti jsou většinou mladší a bez předchozí zkušenosti se zneužíváním alkoholu. K dispozici je mnoho prospektivních i retrospektivních důkazů podporujících hypotézu, že podskupina HPV+ pacientů s karcinomem orofaryngu má příznivější prognózu ve srovnání s pacienty s HPV– formou tohoto onemocnění 67-70 . Důvodem může být větší radiosenzitivita HPV+ tumorů. HPV+ tumory mají sice snížené hladiny nádorového supresoru TP53 v důsledku degradace zprostředkované virovým proteinem E6, ale zbylý TP53 bývá funkční a nemutovaný a pokud radiační poškození buňky zvýší expresi TP53, může dojít k zástavě buněčného cyklu a spuštění buněčné smrti. Naopak u HPV– tumorů bývá TP53 často mutovaný a nefunkční za jakýchkoli podmínek71 . Další odlišnosti HPV+ a HPV– tumorů viz přehledový článek Polanska et al na str. 14. Druhá část této práce je dedikována biologické a klinické charakterizaci HPV+ a HPV– HNSCC tumorů (viz práce Polanska et al. na str. 147). 1.3 Mikroprostředí nádoru V mnoha studiích byla exprese vybraných markerů v nádorové tkáni porovnávána s jeho expresí v okolní histologicky normální tkáni. Vzhledem k tomu, že nádorové buňky a histologicky normální tkáň v okolí nádoru sdílejí stejné mikroprostředí, mohou být tyto „zdravé“ tkáně ovlivněny působky produkovanými nádorem72 , a tak mohou být jen stěží považovány za ideální „kontrolní“ tkáň. Některé cytokiny a růstové faktory podílející se na procesu neoplastické transformace jsou produkovány nenádorovými buňkami vyskytujícími se v okolí nádoru73 . Naopak, parakrinní účinky faktorů produkovaných nádorem mohou narušit homeostázu okolní tkáně doprovázenou zánětlivou reakcí a zvýšenou angiogenezí74 . Z těchto důvodů je velmi důležité charakterizovat vztah a komunikaci nádorových buněk s jejich okolím. Takto nabyté poznatky Mikroprostředí nádoru 1.3 12 mohou zásadně ovlivnit management léčby HNSCC pacientů. Dále předpokládáme, že expresní vzorce histologicky normálních buněk sousedících s nádorem mohou mít prediktivní význam. 1.3.1 Heterogenita mikroprostředí Jednou ze zásadních příčin selhání nechirurgických léčebných modalit je skutečnost, že solidní nádory nevznikají klonálně, ale jsou heterogenní populací různých typů buněk s různými vlast- nostmi75 . Ty se liší rychlostí proliferace, odpovídavosti na léčbu, schopností indukovat zánět, či schopností založit sekundární ložiska76 . Charakterizace buněčných populací mikroprostředí je tak možnou cestou personalizované terapie. Široce studovanými buněčnými populacemi nádorů hlavy a krku jsou ty s povrchovými antigeny THY1 (CD90) a CD4477-79 . Na základě studií je patrné, že buňky CD44+ jsou schopny iniciace kancerogeneze, protein se účastní buněčné migrace a prostřednictvím napojení na signální dráhu EGFR zasahuje do regulace proliferace80- 87 . Buňky exprimující CD44 bývají proto označeny jako „cancer stem cells“ 83,88-90 . THY molekula se vyjma své role v diferenciaci lymfocytů vyskytuje na povrchu mezenchymálních buněk, tedy zejm. fibroblastů77,91,92 . Její výskyt na povrchu epiteliálních buněk může proto indikovat proces epiteliálně-mezenchymální tranzice93 . Ve třetí části této práce (viz práce Svobodova et al. na str. 157) bylo cílem vytvořit primární nádorové linie odvozené z karcinomu hlavy a krku a charakterizovat jednotlivé subpopulace na základě různé exprese povrchových CD-znaků (CD44+ /CD90, CD44- /CD90, CD44+ /CD90+ , CD44- /CD90+ ). Cílem bylo porovnat růstové charakteristiky, tumorigenicitu, invazivitu a schopnost migrace u těchto buněčných subpopulací. Dále bylo cílem studovat genové expresní profily u těchto subpopulací. Cílem bylo porovnat agresivitu jednotlivých buněčných subtypů identifikovaných uvnitř nádoru, ale též určit přínos, který by konkrétní subpopulace mohla mít v rámci rozvoje tumoru. Stimulace růstu benigních, či méně kooperativních subpopulací by mohla být totiž zajímavou strategií pro léčbu nádorových onemocnění. Přehledové články 1.4 13 1.4 Přehledové články V této sekci jsou uvedeny přehledové články dále rozšiřující tématiku stručně nastíněnou v úvodu. 1.4.1 Klinická významnost biomarkerů HNSCC – přehledový článek V předchozích kapitolách byly zmíněny základní molekulární mechanismy rozvoje spinocelulárních karcinomů hlavy a krku aplikovatelné jako prognostické či prediktivní biomarkery. Tato problematika byla podrobněji rozpracována v následujícím11 přehledovém článku na str. 14. „Klinická signifikance“ je dána faktem, že v práci jsou zmíněny pouze studie provedené na pacientech se spinocelulárními nádory hlavy a krku, experimentální práce zmiňující molekulární mechanismy ověřené na buněčných či zvířecích modelech, byť s potenciálem stát se biomarkerem, jsou zmíněny až v následující práci 94 na str. 25. Polanska H, Raudenska M, Gumulec J, et al. Clinical significance of head and neck squamous cell cancer biomarkers. Oral Oncology. 2014;50(3):168-177. Impakt faktor (2014): 3,029 Počet citací (6/2018): 35 Přehledové články 1.4 14 Přehledové články 1.4 15 Přehledové články 1.4 16 Přehledové články 1.4 17 Přehledové články 1.4 18 Přehledové články 1.4 19 Přehledové články 1.4 20 Přehledové články 1.4 21 Přehledové články 1.4 22 Přehledové články 1.4 23 Přehledové články 1.4 24 1.4.2 Biomarkery klíčových procesů kancerogeneze – kapitola v knize Kapitola v knize (str. 25) „Targeting Oral Cancer“ editovaná dr. Andrew Fribleym tematicky navazuje na předchozí práci11 a rozšiřuje ji zejména v několika ohledech: Systematizace vychází z všeobecně uznávaného konceptu „Hallmarks of Cancer“ 12 , a obsahuje také potenciální biomarkery, dosud ověřené pouze na in vitro úrovni či na zvířecích modelech. V kapitole je věnována rozsáhlá pozornost tématu miRNA jako potenciálních biomarkerů spinocelulárních karcinomů. Raudenska M, Gumulec J, Fribley AM, Masarik M. HNSCC Biomarkers Derived from Key Processes of Cancerogenesis. In: Fribley AM, ed. Targeting Oral Cancer. 1st ed. ed. Switzerland: Springer International Publishing; 2016:115-160. Přehledové články 1.4 25 Přehledové články 1.4 26 Přehledové články 1.4 27 Přehledové články 1.4 28 Přehledové články 1.4 29 Přehledové články 1.4 30 Přehledové články 1.4 31 Přehledové články 1.4 32 Přehledové články 1.4 33 Přehledové články 1.4 34 Přehledové články 1.4 35 Přehledové články 1.4 36 Přehledové články 1.4 37 Přehledové články 1.4 38 Přehledové články 1.4 39 Přehledové články 1.4 40 Přehledové články 1.4 41 Přehledové články 1.4 42 Přehledové články 1.4 43 Přehledové články 1.4 44 Přehledové články 1.4 45 Přehledové články 1.4 46 Přehledové články 1.4 47 Přehledové články 1.4 48 Přehledové články 1.4 49 Přehledové články 1.4 50 Přehledové články 1.4 51 Přehledové články 1.4 52 Přehledové články 1.4 53 Přehledové články 1.4 54 Přehledové články 1.4 55 Přehledové články 1.4 56 Přehledové články 1.4 57 Přehledové články 1.4 58 Přehledové články 1.4 59 Přehledové články 1.4 60 Přehledové články 1.4 61 Přehledové články 1.4 62 Přehledové články 1.4 63 Přehledové články 1.4 64 Přehledové články 1.4 65 Přehledové články 1.4 66 Přehledové články 1.4 67 Přehledové články 1.4 68 Přehledové články 1.4 69 Přehledové články 1.4 70 Přehledové články 1.4 71 1.4.3 Role zinku a mědi u HNSCC – review a meta-analýza Všeobecný trend identifikovat prognosticky významné molekuly se typicky zaměřuje na studium na úrovni genomiky či proteomiky. K odlišnostem nádorových a nenádorových buněk patří ale také alterace metabolismu12 – typicky vznikající jako konsekvence selekčního tlaku hypoxie v nádorovém ložisku. Diagnostický potenciál je proto možné spatřovat také na úrovni metabolomiky či metalomiky. Kovy jsou typickými kofaktory širokého spektra enzymů. Od sedmdesátých let dvacátého století vzrostl počet studií poukazujících na fakt, že zejména zinek a měď jsou významnými regulačními mechanismy fyziologických procesů. Ve studiích zejména posledních let je poukazováno na fakt, že tyto kovy zasahují do významných „hallmarks“ – do regulace apoptózy, genové exprese, diferenciace buněk. Změny v hladinách těchto kovů jsou pak spojeny s rozvojem patologií vč. nádorových95 96 . V meta-analýzách Gumulec et al. zaměřujících se na studium hladin zinku97 a zinek-vázajícího proteinu metalothioneinu42 bylo prokázáno, že u spinocelulárních a ovariálních nádorů dochází k signifikantnímu nárůstu exprese zinek-vázajícího metalothioneinu v nádorové tkáni a naopak k poklesu této molekuly u hepatocelulárních karcinomů. Signifikantní pokles koncentrace zinečnatých iontů byl prokázán nejen v prostatické nádorové tkáni, ale také u hepatocelulárních nádorů, nemalobuněčných karcinomů plic a u nádorů štítné žlázy. Zajímavým zjištěním práce byl fakt, že u karcinomů prsu byl prokázán signifikantní vzestup koncentrace zinku oproti kontrole v nádorové tkáni. Na tato review navazuje práce Ressnerova et al.98 na str. 72, zaměřující se výhradně na diagnostický a terapeutický potenciál těchto kovů u HNSCC. Vyjma zinku je v práci fokusováno také na měď a její transportní mechanismy. Bylo zjištěno, že v séru pacientů s HNSCC dochází k signifikantnímu snížení hladiny zinku a ke zvýšení koncentrace mědi a měď-vázajícího ceruloplazminu. Naopak, v nádorové tkáni bylo zjištěno signifikantní zvýšení jak zinku (a zinekvázajícího metalothioneinu), tak mědi (viz obr. na str. 83). Ressnerova A, Raudenska M, Holubova M, et al. Zinc and Copper Homeostasis in Head and Neck Cancer: Review and Meta-Analysis. Current Medicinal Chemistry. 2016;23(13):1304- 1330. Impakt faktor (2016): 3.455 Počet citací (6/2018): 3 Přehledové články 1.4 72 Přehledové články 1.4 73 Přehledové články 1.4 74 Přehledové články 1.4 75 Přehledové články 1.4 76 Přehledové články 1.4 77 Přehledové články 1.4 78 Přehledové články 1.4 79 Přehledové články 1.4 80 Přehledové články 1.4 81 Přehledové články 1.4 82 Přehledové články 1.4 83 Přehledové články 1.4 84 Přehledové články 1.4 85 Přehledové články 1.4 86 Přehledové články 1.4 87 Přehledové články 1.4 88 Přehledové články 1.4 89 Přehledové články 1.4 90 Přehledové články 1.4 91 Přehledové články 1.4 92 Přehledové články 1.4 93 Přehledové články 1.4 94 Přehledové články 1.4 95 Přehledové články 1.4 96 Přehledové články 1.4 97 Přehledové články 1.4 98 Přehledové články 1.4 99 2 Hypotézy práce Cílem práce je odpovědět na níže uvedené hypotézy: • Mikroprostředí nádoru ovlivňuje progresi nádoru a toto je využitelné i diagnosticky – změny v transkriptomu nenádorové – k nádoru přilehlé tkáni mají predikční/prognostické využití • Prognostický význam má nejen změna transkriptomu nádorové tkáně, ale také změna v epigenetických mechanismech. • V nádoru existují různé buněčné subpopulace s různou schopností proliferovat, migrovat, či založit metastázy a s různou schopností podporovat nádorovou tkáň v růstu. • S nádorem asociované fibroblasty ovlivňují odezvu nádorové tkáně na radioterapii Přehledové články 1.4 100 3 Metodické přístupy Mikroprostředí bylo studováno víceúrovňově – na úrovni analýzy séra, tkáňových vzorků, ale také na úrovni jednotlivých subpopulací buněk získaných z nádorových vzorků pacientů. Bylo využito metod analýzy genové exprese, metod studia buněčné migrace, invazivity, buněčného růstu a byla analyzována míra reparace dvouřetězcových zlomů DNA. Zde jsou metody sumarizovány a uvedeny odkazy na konkrétní články zmiňující metodiku detailněji. Nábor a definice pacientů, zpracování tkáňových vzorků a analýza genové exprese pomocí kvantitativní real-time PCR a následná statistická analýza je popsána v práci Raudenska et al.99 , metodika dostupná na str. 104. Zpracování vzorků nádorové tkáně pro analýzu miRNA a následná analýza přežití (Log rank test, Kaplan Meierova anlýza) je dostupná v práci Hudcova et al. 100 , metodika je dostupná na str. 124. Metody elektrochemické detekce miRNA jsou popsány v práci Hudcova et al.101 na str. 132. Metody zpracování vzorků séra pro následnou detekci proteinu EGFR pomocí ELISA jsou popsány v práci Polanska et al., metodika je dostupná na str. 141. Metody detekce HPV16 a HPV18 (detekce pomocí PCR a sekvenování) jsou popsány v práci Polanska et al.102 , metodika dostupná na str. 148. Zpracování bioptických vzorků pro přípravu primokultur in vitro a jejich následná separace pomocí paramagnetických částic s protilátkami specifickými proti CD44 a CD90 je dostupná v práci Svobodova et al. 103 , metodika dostupná na str. 158. Metody ověření subpopoulací fluorescenční mikroskopií, analýza buněčného růstu, migrace pomocí wound-healing assaye, real-time analýza migrace a invazivity, analýza cytotoxicity pomocí MTT testu bioinformatická analýza pro studium transkriptomu je dostupná tamtéž. Analýza tvorby dvouřetězcových zlomů, resp. jejich reparace pomocí mikroskopické analýzy jaderných foků H2AX/53BP1 je popsána v práci Falk et al. 104 , metodika dostupná na str. 176. Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 101 4 Výsledky (komentovaný soubor publikací) V této části jsou formou komentovaného souboru publikací shrnuty poznatky autora v oblasti onkologie hlavy a krku publikované výhradně v časopisech s impakt faktorem. Z důvodu logické návaznosti je dána přednost integraci vlastních článků přímo do textu práce a nikoli až na její konec v podobě přílohy. Každé publikované studii předchází její shrnutí, je uvedena v návaznost na dílo předchozí a návaznosti na další výzkum. 4.1 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA V práci Raudenska et al.99 bylo cílem na tkáňové úrovni popsat asociace exprese genů s klinicko-patologickými vlastnostmi pacientů (charakteristika viz tabulka na str. 105). Byla provedena analýza exprese následujících genů: EGF, EGFR, MKI67, BCL2, BAX, FOS, JUN, TP53, VEGF, FLT1, MMP2, MMP9, MT1A, a MT2A; jejich popis a role viz kapitola Prognostické biomarkery na str. 7. Do této studie bylo zahrnuto celkem 94 tkáňových vzorků histologicky ověřeného spinocelulárního karcinomu hlavy a krku. Tkáň přilehlá nádoru, jinak histologicky „normální“ je v mnohých studiích považována za referenční. Nicméně tato tkáň může podporovat růst vlastní nádorové tkáně, např. prostřednictvím fibroblastů asociovaných s nádorem105 . Toto je v práci zohledněno – ve studii jsou proto kontrolní tkáně dvě – přilehlá (tj. tkáň stejného pacienta, „adjacent“, 31 pacientů) a tkáň pacientů po tonsilektomii („tonsillectomy“, 10 pacientů). Nejprve byly sledovány rozdíly mezi těmito kontrolními tkáněmi. Byly prokázány signifikantní rozdíly u těchto genů – vyšší exprese JUN, EGF, MT2A a BAX a výrazné zvýšení poměru BAX/BCL2 v nádoru přilehlé tkáni oproti vzorkům tonzilektomie. Přítomnost nádoru tedy ovlivňuje přilehlou tkáň tím, že v ní zvyšuje míru apoptózy. Vzhledem k významným rozdílům byla v dalších analýzách exprese těchto genů posuzována zvlášť u obou kontrolních skupin, zatímco u zbylých genů toto nebylo zohledněno. Nejvýznamnější rozdíly v expresi byly pozorovány u genu pro metalothionein 2A, MT2A (viz obrázek na str. 106). Nejvyšší míra exprese tohoto genu byla pozorována v nádorové tkáni a naopak nejmenší míra v zánětlivě změněné tkáni tonzilektomií. V rámci této studie byla pozornost také zaměřena na spojitosti mezi tkáňovou expresí výše uvedených genů a klinicko-patologickými metrikami pacientů. Co se týče stagingu TNM, nebyla prokázána spojitost mezi stádiem T a expresí žádného genu. Bylo nicméně zjištěno, že tkáň Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 102 přilehlá k nádoru také vykazuje změny v expresních profilech v závislosti na stage tumoru, a zasažením uzlin. Bylo zjištěno, že přilehlé (nenádorové) tkáně pacientů se zasažením mízních uzlin vykazovaly snížení exprese genů BAX, EGFR, FLT1 a MMP2; s pozitivitou uzlin souvisela i vyšší exprese BCL2. Aby bylo možné robustněji uchopit vzájemné interakce mezi sledovanými geny a tím více proniknout do patogeneze choroby, byla provedena analýza hlavních komponent, vícerozměrná statistická metoda umožňující komplexní výsledky zredukovat do několika jednoduchých závěrů. Nejvýznamnější posun v rámci expresního vzorce byl nalezen u EGFR a MKI67 mezi tkání nádorovou a přilehlou k nádoru oproti tkáni pacientů indikovaných k tonzilektomii. Pro nádorovou tkáň byl typický posun v expresi JUN, BCL2 a MMP9. Pro tkáň přiléhající k nádoru byl charakteristický posun v expresi JUN a FLT1 a pro tonzilektomie bylo typické odlišné uspořádání EGF, MT2A a MT1A v rámci expresního vzorce (viz obrázek na str. 108). Raudenska M, Sztalmachova M, Gumulec J, et al. Prognostic significance of the tumour-adjacent tissue in head and neck cancers. Tumor Biology. 2015;36(12):9929-9939. Impakt faktor (2015): 3.611 Počet citací (5/2018): 8 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 103 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 104 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 105 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 106 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 107 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 108 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 109 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 110 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 111 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 112 Molekulární markery HNSCC na úrovni mRNA 4.1 113 Prognostická role c-Met: meta-analýza 4.2 114 4.2 Prognostická role c-Met: meta-analýza V předchozí práci Raudenska et al.99 byly studovány změny v tkáňové expresi genů mezi kontrolami a pacienty s nádory, jejich prognostický potenciál studován nebyl. Ve spojitosti se spinocelulárními karcinomy je jednou z široce diskutovaných molekul tyrozinkinázový receptor pro hepatocytární růstový faktor, c-Met106,107 . Jeho fyziologická úloha je spojena s klíčovými procesy během embryogeneze a hojení ran, jmenovitě např. schopnost migrujících buněk odloučit se od extracelulární matrix, uniknout anoikis a zůstat v nově vznikající tkáni22 . Ve spojitosti s progresí nádorů byla tato molekula spjata s fenotypem nádorových kmenových buněk a s mechanismem rezistence oproti inhibitorům EGFR novými terapeutiky, např. cetuximabem108 . I když existuje spektrum prací asociujících tento tyrozinkinázový receptor s nepříznivou prognózou, jejich výsledky se liší a neexistuje meta-analýza, která by tato zjištění podpořila silnější statistickou metodou109,110 . V této práci bylo formou meta-analýzy shrnuto 17 prací s celkem 1724 pacienty studující asociaci přežití pacientů s overexpresí c-Met. Bylo zjištěno, že overexprese je signifikantně korelována s nepříznivým celkovým přežitím (hazard ratio (HR) = 2.19, 95 % interval spolehlivosti (CI) = 1.55-3.10) a přežitím bez relapsu (HR = 1.64, 95% CI = 1.24-2.17, viz obrázek na str. 117). Pomocí této meta-analýzy bylo také zjištěno, že overexprese cMet je také asociována s pozitivitou uzlin, odds ratio (OR) = 1.76, 95 % CI = 1.26-2.45. Na základě změn v expresi cMet je tedy možné predikovat nepříznivou prognózu pacientů. Vsiansky V, Gumulec J, Raudenska M, Masarik M. Prognostic role of c-Met in head and neck squamous cell cancer tissues: a meta-analysis. Scientific reports. 2018;in press. Impakt faktor (2017): 4,122 Počet citací (6/2018): 0 Prognostická role c-Met: meta-analýza 4.2 115 Prognostická role c-Met: meta-analýza 4.2 116 Prognostická role c-Met: meta-analýza 4.2 117 Prognostická role c-Met: meta-analýza 4.2 118 Prognostická role c-Met: meta-analýza 4.2 119 Prognostická role c-Met: meta-analýza 4.2 120 Prognostická role c-Met: meta-analýza 4.2 121 Molekulární markery HNSCC na úrovni miRNA 4.3 122 4.3 Molekulární markery HNSCC na úrovni miRNA Práce Raudenska et al.99 se zabývala analýzou potenciálních tkáňových biomarkerů na úrovni mRNA. Translace (těchto RNA) do proteinů je ovlivněna řadou procesů, mj. epigenetickými mechanismy – pomocí miRNA. Následující práce Hudcova et al. se zaměřuje na studium právě těch miRNA ovlivňujících expresi genů over/under-exprimovaných v nádorové tkáni, jak ukázáno ve studii99 . K predikci bylo využito dat z literatury111 a databáze Targetscan (http://www.targetscan.org). Důraz byl kladen zejména na gen metalothionein a jeho regulační molekuly, např. transkripční faktor MTF1. V této práci (str. 123) byla ověřována exprese miR-29c-3p, miR-34a-5p, miR200b-5p a miR- 375 v nádorové tkáni a ve tkáni přilehlé k nádoru. Signifikantní rozdíly v expresi byly nalezeny u miR-29c-3p a miR-375. Obě zmiňované miRNA byly více exprimované ve tkáni přiléhající k nádoru v porovnání s tkání nádorovou, což odpovídá jejich předpokládané roli nádorového supresoru (viz obrázek na str. 126). Hudcova K, Raudenska M, Gumulec J, et al. Expression profiles of miR-29c, miR-200b and miR-375 in tumour and tumour-adjacent tissues of head and neck cancers. Tumor Biology. 2016;37(9):12627-12633. Impakt faktor (2016): 2,926 Počet citací (6/2018): 8 Molekulární markery HNSCC na úrovni miRNA 4.3 123 Molekulární markery HNSCC na úrovni miRNA 4.3 124 Molekulární markery HNSCC na úrovni miRNA 4.3 125 Molekulární markery HNSCC na úrovni miRNA 4.3 126 Molekulární markery HNSCC na úrovni miRNA 4.3 127 Molekulární markery HNSCC na úrovni miRNA 4.3 128 Molekulární markery HNSCC na úrovni miRNA 4.3 129 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru 4.4 130 4.4 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru V porovnání s molekulárně-biologickými metodikami pro detekci miRNA, které jsou založeny na hybridizaci (qRT-PCR, Northern blot, ISH), jsou voltametrie a CD spektroskopie mnohem rychlejší (v řádu minut). Přinášejí také informace o sekundární struktuře, které mohou mít další zajímavá využití. Elektrochemické metody mohou být neobvyklým a novým přístupem při detekci a analýze miRNA. V naší studii jsme vybrali tři miRNA (miR-23a, miR-34a a miR-320a), které jsou deregulovány v nádorech hlavy a krku a pokusili jsme se je charakterizovat a detekovat pomocí elektrochemických metod. V této studii byly provedeny voltametrické a spektrální analýzy za účelem lepšího poznání struktury miRNA. Pro základní srovnání spekter nukleotidů miRNA byly výsledky doplněny o uracilové DNA (DNA (U)), které mají stejné oligonukleotidové sekvence jako miRNA. Účinkem nahrazení ribózy za deoxyribózu v oligonukleotidu byla prokázána strukturální diverzita. V první části jsme se zabývali eliminací guaninového píku a charakterizací jednotlivých miRNA podle obsahu guaninu (viz obrázek na str. 135). Z výsledků je zřejmé, že podle guaninového píku lze rozlišit od sebe všechny tři studované miRNA. V tomto metodickém článku byla také provedena analýza exprese sérových hladin výše zmíněných miRNA na testovací kohortě 48 pacientů. U všech ze sledovaných bylo popsáno signifikantní zvýšení hladin oproti kontrolní skupině (obr. na str. 134). Hudcova K, Trnkova L, Kejnovska I, Vorlickova M, Gumulec J et al. Novel biophysical determination of miRNAs related to prostate and head and neck cancers. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 2015;44(3):131-138. Impakt faktor (2015): 2,219 Počet citací (6/2018): 4 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru 4.4 131 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru 4.4 132 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru 4.4 133 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru 4.4 134 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru 4.4 135 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru 4.4 136 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru 4.4 137 Elektrochemická detekce miRNA, hladina v séru 4.4 138 Molekulární markery HNSCC na úrovni proteinu 4.5 139 4.5 Molekulární markery HNSCC na úrovni proteinu Další nadějné HNSCC markery a rovněž markery vytipované na základě předchozích experimentů byly ověřeny i na proteinové úrovni ve vzorcích krve. Markery stanovované z krve jsou méně invazivní než tkáňové biopsie a odběr vzorků se může opakovat, což umožňuje sledovat v reálném čase progresi onemocnění a odpověď na léčbu. Jako první byla ověřena hladina EGFR v plazmě HNSCC pacientů a kontrol. Jako kontrola byla využita skupina jedinců bez medikace a bez diagnostikovaných chorob a diabetická skupina (diabetes typu 2; T2DM). Charakterizace pacientů a kontrol je uvedena v tabulce na str. 143. Jako první byla vyhodnocována asociace mezi plazmatickými hladinami EGFR a výskytem HNSCC. Hladina plazmatického EGFR byla u pacientů s HNSCC významně vyšší než u obou typů kontrol se senzitivitou 76,09 % a specifitou 67,27 %; viz obr. na str. 142. Mezi oběma typy kontrol nebyla nalezena statisticky významná změna v hladinách plazmatického EGFR. Dalším stanovovaným parametrem byla asociace plazmatických hladin EGFR a klinicko-patologických charakteristik HNSCC pacientů. Nebyla nalezena žádná signifikantní asociace mezi hladinami EGFR a HPV infekcí stádiem či diferenciací nádoru, zasažením mízních uzlin či výskytem vzdálených metastáz. Vliv HPV infekce a T2DM byl však na hranici statistické významnosti (a je blíže zkoumán v následující práci Polanska et al. na str. 147). Dalším studovaným parametrem byla délka přežívání pacientů. Prognostický význam plazmatických hladin EGFR byl posuzován pomocí Kaplan-Meierovy analýzy přežití a Coxova modelu proporcionálních rizik, nebyla ale prokázána asociace mezi hladinami EGFR a přežíváním pacientů (viz obr. na str. 143). Polanska H, Raudenska M, Hudcova K, et al. Evaluation of EGFR as a prognostic and diagnostic marker for head and neck squamous cell carcinoma patients. Oncology Letters. 2016;12(3):2127-2132. Impakt faktor (2016): 1,482 Počet citací (6/2018): 1 Molekulární markery HNSCC na úrovni proteinu 4.5 140 Molekulární markery HNSCC na úrovni proteinu 4.5 141 Molekulární markery HNSCC na úrovni proteinu 4.5 142 Molekulární markery HNSCC na úrovni proteinu 4.5 143 Molekulární markery HNSCC na úrovni proteinu 4.5 144 Molekulární markery HNSCC na úrovni proteinu 4.5 145 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů 4.6 146 4.6 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů V 80. letech dvacátého století byl odhalen vliv lidského papillomaviru (HPV) v incidenci HNSCC 56 . HPV infekce je zřejmě časnou či dokonce iniciační událostí při patogenezi těchto nádorů. Exprese virových proteinů E6 a E7 vede k inaktivaci klíčových nádorových supresorů TP53, retinoblastomového proteinu (RB1), P107, P130 a P21 a tím zvyšuje syntézu DNA a expresi genů požadovaných pro přechod z G1 do S fáze. Cílem následující102 studie Polanska et al. (str. 147) bylo popsat, jak tkáňová exprese genů souvisejících s buněčným cyklem, buněčnou smrtí, angiogenezí aj. souvisí s přítomností HPV. Do této studie bylo zahrnuto 74 vzorků nádorové tkáně histologicky ověřeného HNSCC, 16 pacientů bylo HPV16-pozitivních (21,6 %), 9 bylo HPV18-pozitivních (12,2 %), 27 bylo infikováno jiným HPV subtypem (36,5 %) a 22 bylo HPV-negativních (29,7 %), popis pacientů viz str. 149. Ve studované kohortě HNSCC pacientů nebyla nalezena žádná asociace mezi výskytem HPV+ HNSCC a kouřením, věkem, diferenciací a stádiem nádoru. Dále byl studován vliv HPVinfekce na expresi těchto genů: EGF, EGFR, MKI67, BCL2, BAX, FOS, JUN, TP53, VEGF, FLT1, MMP2, MMP9, MT1A a MT2A; (viz tabulka na str. 150). U HPV-negativních nádorů byla pozorována vyšší exprese genů MT2A, MMP9, FLT1, VEGFA a POU5F; viz obrázek na str. 150. Na tomto trendu se v případě genu MT2A nejvýznamněji podílela infekce virem HPV18. Dále byla prokázána silná pozitivní korelace s r > 0,50 specifická pouze pro HPV-negativní nádory mezi MT1A a MKI67, a MMP2 a FLT1. Exprese MT2A pozitivně korelovala s BAX, MMP2, MMP9, FLT1, VEGFA, FOS a JUN. Lepší celkové přežití bylo identifikováno u skupiny HPV+ pacientů s vyšší expresí TP53 a BAX a nižší expresí BCL2 (viz obr. na str. 152). Naopak, vysoká exprese MMP9 byla spojená s horším přežíváním u HPV+ i HPV− HNSCC pacientů; 70 % pacientů s nízkou expresí MMP9 v nádorové tkáni bylo naživu ještě po dvou letech od diagnózy onemocnění, zatímco ve skupině s vysokou či střední expresí to bylo pouze 30 %. Polanska H, Heger Z, Gumulec J, et al. Effect of HPV on tumor expression levels of the most commonly used markers in HNSCC. Tumor Biology. 2016;37(6):7193-7201. Impakt faktor (2016): 3.650 Počet citací (5/2018): 3 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů 4.6 147 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů 4.6 148 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů 4.6 149 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů 4.6 150 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů 4.6 151 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů 4.6 152 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů 4.6 153 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů 4.6 154 Biologická a klinická charakterizace HPV+ a HPV− tumorů 4.6 155 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 156 4.7 Charakterizace buněk mikroprostředí Nádorová tkáň je tvořená heterogenní populací nádorových buněk, cévami, buňkami imunitního systému, mezenchymálními buňkami a extracelulární matrix. Z hlediska vlivu na patogenezi nádorů a jejich progresi byly studovány ty populace nesoucí povrchové antigeny CD44 a CD9077-79 . CD44-pozitivní buňky jsou typicky ty schopné iniciovat tumorigenezi83-86 , migraci80 , a metastázování87 . Exprese CD90 je charakteristická mimo svoji úlohu v diferenciaci T-lymfocytů112 také pro mezenchymální buňky – mj. fibroblasty91,92 . Obě tyto populace ovlivňují fenotyp nádoru; např. podíl CD90-pozitivních buněk ve spinocelulárních nádorech je v pozitivní korelaci s velikostí tohoto nádoru113 . S cílem popsat roli jednotlivých subpopulací CD44/CD90 v mikroprostředí byla vytvořena primokultura z dobře diferencovaného karcinomu dutiny ústní (muž, 57 let, nekuřák, HPV18+ T2N0M0 grade 1 tumor, dále označený jako primokultura 132P1, popis vzniku viz publikace Svobodova et al.103 na str. 158). Mezi subpopulacemi byly prokázány následující rozdíly: CD44− nebyly schopny neomezeného růstu na misce (v souladu s očekáváním a literaturou), subpopulace CD44+/CD90− vykazovala nejvyšší míru buněčné migrace (str. 160), CD44+ buňky byly charakteristické vyšší mírou exprese MMP2 a EGFR (proteinová úroveň, str. 161), buňky CD90+ byly charakteristické vyšší mírou apoptózy/nekrózy a naopak CD44+ byly charakteristické vyšší mírou autofagie. Z ko-kultivačních experimentů vyplývá, že „nádorové“ buňky CD44+/CD90− rostou rychleji, jsou-li přímo ko-kultivovány s „mezenchymálními“ buňkami CD44−/CD90+. Obdobně byla provedena také nepřímá ko-kultivace, při níž je možné dále provádět analýzy genové exprese. Z této analýzy bylo zjištěno, že jsou-li CD44+ „nádorové buňky“ ko-kultivovány s CD44+/CD90+ buňkami, dochází (u CD44+) zejména ke snížení markeru proliferace MKI67 a ke zvýšení poměru BAX/BCL2. Tedy – u nádorových buněk v důsledku působení buněk mezenchymálních dochází k ovlivnění růstu nádoru – populace CD44− mezenchymální buňky růst podporují proliferaci nádorových buněk a naopak CD44+ populace mezenchymálních buněk proliferaci nepodporuje a spouští apoptózu. Svobodova M, Raudenska M, Gumulec J, et al. Establishment of oral squamous cell carcinoma cell line and magnetic bead-based isolation and characterization of its CD90/CD44 subpopulations. Oncotarget. 2017;8(39):66254-66269. Impakt faktor (2017): 5,168 Počet citací (5/2018): 1 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 157 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 158 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 159 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 160 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 161 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 162 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 163 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 164 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 165 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 166 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 167 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 168 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 169 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 170 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 171 Charakterizace buněk mikroprostředí 4.7 172 Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC 4.8 173 4.8 Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC Nádory hlavy a krku jsou v blízkosti k vitálním strukturám, užití radikálního chirurgického přístupu tak není vždy ideální. Nechirurgické postupy (chemo/radioterapie) jsou proto často preferovanými modalitami. Přibližně u 50 % nádorů ale dochází k rozvoji radiorezistence, kterou současnými diagnostickými prostředky není možné predikovat46,48 (blíže viz kapitola 1.1.3 Markery odpovědi na (radio)terapii). Následující studie Falk et al. (str. 175) se zaměřuje na analýzu spojitostí mezi mírou reparace dvouřetězcových zlomů pomocí imunofluorescenční analýzy γH2AX/53BP1 foků a rezistencí k radioterapii. Jaderné foky H2AX/53BP1 jsou obecně uznávaným markerem dvouřetězcových zlomů. Nejdříve byla provedena podrobná analýza indukce a oprav dvouřetězcových zlomů DNA u „referenčních“ buněčných linií: (1) nemaligních lidských kožních fibroblastů (NHDF) a u modelových HNSCC buněčných linií (2) Detroit 562 a (3) FaDu. FaDu je buněčná linie pocházející z hypofaryngálního karcinomu bez mutace PI3K, která by umocňovala radiorezistenci. Detroit 562 je buněčná linie odvozená z metastatického pleurálního výpotku karcinomu faryngu nesoucí aktivační mutaci PI3K, lze tedy očekávat radiorezistentnější fenotyp; radiosenzitivita těchto buněčných linií však dosud nebyla v literatuře popsána. Na základě detekovaných foků a jejich rychlosti reparace jsme potvrdili, že linie Detroit může být využita jako model relativní radiorezistence a linie FaDu je oproti ní k radiaci senzitivnější (obr. na str. 179). Tato rezistence k ozáření byla potvrzena i vyšší schopností formovat kolonie, jak ukázáno u modelu metastatické buněčné linie Detroit 562 (colony-forming assay). Obě nádorové linie vykazovaly vyšší míru genetické nestability v porovnání s nenádorovou linií NHDF. Stejným způsobem jsme analyzovali tři primární kultury odvozené z tkáně HNSCC pacientů. Na základě vzniku a oprav H2AX/53BP1 foků bylo potvrzeno že vyšší míra radiosenzitivity se vyskytuje u nádoru TNM T1 a T2, zatímco u T3 tumorů byla prokázána vyšší míra rezistence. Ta byla potvrzena také pomocí průtokové cytometrie (barvení annexinu V/7AAD). 91,5 % buněk T3 přežilo ozáření 2 Gy (-záření; 1Gy / min), str. 179. Na základě těchto poznatků byl proveden screening u dalších 35 HNSCC pacientů. Foky byly zaznamenány ve třech nejdůležitějších časových intervalech po ozáření, ve kterých jsme rovněž měřili životaschopnost buněk čtyřmi různými přístupy (pozitivita buněk na trypanovou modř měřeno na CellCounteru, průtoková cytometrie s annexinem V/7-AAD, průtoková cytometrie s MUSE Cell count and viability kitem a pomocí colony-forming testu). Předběžné analýzy potvrzují shora popsané závěry, tj. vztah mezi účinnější opravou DSB definovanou jako nižší Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC 4.8 174 počet buněk s vysokou hustotou H2AX/53BP1 foků (8 hodin po ozáření nebo později) a přežití buněk po ozáření. Vypozorovány byly také FaDu-podobné a Detroit-podobné skupiny HNSCC nádorů. Obdobně jako v předchozí studii charakterizující CD44/CD90 fenotypy (str. 157) byla u těchto subpopulací popsána rozdílná citlivost, resp. rozdílná míra reparace po ozáření. Smíšené kultury CD90+ a CD90− kultivované dohromady vykazovaly nižší tvorbu a rychlejší opravy γH2AX / 53BP1 foků, než bylo pozorováno u stejných dvou subpopulací kultivovaných odděleně (str. 179). Celkově tyto výsledky naznačují, že přinejmenším u některých nádorů by mohly být γH2AX/53BP1 foky slibným markerem radiosenzitivity daného nádoru. Falk M, Horakova Z, Svobodova M, Masark M, Kopecna O, Gumulec, J et al. gamma H2AX/53BP1 foci as a potential pre-treatment marker of HNSCC tumors radiosensitivity - preliminary methodological study and discussion. European Physical Journal D. 2017;71(9). Impakt faktor (2015): 1,288 Počet citací (6/2018): 0 Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC 4.8 175 Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC 4.8 176 Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC 4.8 177 Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC 4.8 178 Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC 4.8 179 Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC 4.8 180 Radiosenzitivita primokultur a buněčných linií HNSCC 4.8 181 Změny v transkriptomu po ozáření 4.9 182 4.9 Změny v transkriptomu po ozáření S cílem popsat komplexní molekulárně-biologické změny v nádorových buňkách po ozáření byla provedena microarray umožňující studovat rozdíly v komplexní genové expresi 372 genů spojených s opravou DNA, buněčnou smrtí, metabolismem nádorových buněk, buněčnou motilitou, kmenovostí, epiteliálně-mezenchymální tranzicí a angiogenezí. Jako model HNSCC byly použity buněčné linie FaDu a Detroit 562. Jako model netransformovaných buněk byly použity nemaligní lidské kožní fibroblasty (NHDF). Linie FaDu je odvozena z primárního dlaždicobuněčného karcinomu faryngu a v této studii je použita jako model „primárního nádoru“, linie Detroit 562 je naproti tomu odvozena ze sekundárního ložiska faryngálního karcinomu v pleuře, je použita jako model „sekundárního ložiska“. Fibroblastová linie NHDF zde figuruje jako „nenádorová reference“; fibroblasty jsou po epiteliálních buňkách nejčastější komponentou mikroprostředí. Zkoumali jsme, zda buněčné linie FaDu a Detroit vykazují po ozáření odlišnosti v genové expresi ve srovnání s nenádorovými NHDF a jaké jsou rozdíly mezi buňkami FaDu a Detroit a jak tyto odlišnosti korelují s účinností oprav DSB. Obrázek 1 Interaktom genů signifikantně up-regulovaných u buněčné linie FaDu barevně kódovaných dle biologického procesu, jehož se účastní. červená, apoptotické proces (17 genů), modrá, buněčná odpověď na stres (26 genů), zelená, odezva na ionizující záření (13 genů). Vytvořeno pomocí databáze StringDB. Změny v transkriptomu po ozáření 4.9 183 Díky tomuto přístupu byly nalezeny expresní vzorce charakteristické pro jednotlivé linie (viz Obrázek 1). Tyto expresní vzorce budou později využity k charakterizaci tkání pacientů. Pro opravu DSB u nádorových buněk zřejmě hraje velkou roli ATM (ataxia-telangiectasia mutated) a BRCA2, jejichž role je menší u nenádorových NHDF. Radiosenzitivní buňky FaDu také udržují déle vysokou expresi genů souvisejících s opravami DNA. Na základě souboru upregulovaných genů bylo zjištěno, že signální dráha GO0044767 (single-organism developmental process) je charakteristicky zapojena do reakce na záření v nádorových buňkách a nezapojuje se u NHDF. Pokud jde o charakteristické geny pro jednotlivé buněčné linie po ozáření, bylo prokázáno, že u NHDF jsou nejvíce up-regulované geny pro: Fibronectin 1; Proteasome (Prosome, Macropain) 26S Subunit, Non-ATPase, 14; Myosin IB; Interferon Gamma; Replication Protein A3; Intercellular Adhesion Molecule 1; Programmed Cell Death 1 Ligand 1; Growth Arrest And DNA Damage-Inducible Alpha; ER Membrane Protein Complex Subunit 7; UV Radiation Resistance Associated; Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 2; Nejvíce utlumená byla pak exprese genů pro: Nuclear Factor, Erythroid 2 Like 2; BRCA2; KRAS, viz Tabulka 1. U linie Detroit 562 byly nejvíce up-regulované geny pro: Platelet Derived Growth Factor Receptor Alpha; BCL2Antagonist/Killer 1; Connective Tissue Growth Factor; Myosin IB. Nejvíce utlumená byla pak exprese genů: Cathepsin S/ indicative of poor prognosis; Cell Division Cycle 42; autophagy related 10. Změny v transkriptomu po ozáření 4.9 184 U linie FaDu byly nejvíce up-regulované geny pro: Cadherin 2; Proteasome (Prosome, Macropain) 26S Subunit, Non-ATPase, 14; Checkpoint Kinase 2; Myosin IB; Tumor Protein P53; Heat Shock Protein Family A (Hsp70) Member 5; Ring Finger Protein 8; Fibronectin 1; Heat Shock Protein 90 Alpha Family Class A Member 1; Vascular Endothelial Growth Factor A. Nejvíce utlumená byla pak exprese genů: Cathepsin S; Split Hand/Foot Malformation; Cell Division Cycle 42; Nuclear Factor, Erythroid 2 Like 2; Fibroblast Growth Factor 2. Tabulka 1: Odezva genové exprese na ionizující záření. Geny současně up/down-regulované u sledovaných buněk po ozáření. Geny Odpověď na iradiaci (buněčná linie) NHDF FaDu Detroit 562 ATM ↑ ↑ BAK1 ↑ ↑ ↑ BAX ↑ ↑ ↑ BRCA1 ↑ BRCA2 ↓ ↑ ↑ CHEK2 ↑ HUS1 ↑ KRT14 ↑ NABP2 ↑ RNF8 ↑ SIRT1 ↑ ↑ SNAI2 ↑ ↑ TP53 ↑ NBN ↑ ↑ ↑ Diskuse výsledků 5 185 5 Diskuse výsledků Výzkum nádorové biologie posledních dekád byl výrazně fokusován na popis vlastnosti nádorových buněk samotných; velkou měrou bylo toto umožněno vytvořením modelů buněčných linií. Po vytvoření linie karcinomu děložního čípku HeLa v padesátých letech114 se postupně objevily další buněčné modely, díky nímž byly popsány zásadní buněčné procesy a pochopená molekulární úroveň patologických stavů115 . Přes významný přínos naráží tento přístup na významné limitace: Buněčné linie se dělí tisíce generací v buněčné kultuře, v prostředí radikálně odlišném oproti přirozenému. V průběhu času se buňky adaptovaly na „život“ v Petriho misce a ztratily mnohé vlastnosti svého původního fenotypu 116 . Nepřítomnost přirozeného extracelulárního stromatu s jeho fyzikálně-chemickými vlastnostmi není jediným důvodem. Zatímco buněčné linie jsou charakteristicky jednoho buněčného typu, nádory in situ obsahují také fibroblasty, myelofibroblasty, neuroendokrinní buňky, adipocyty, buňky imunitního systému, krevní a lymfatické cévy a tím tvoří mikroprostředí nádoru. To významně participuje na všech krocích tumorigeneze – iniciace, progrese i metastázování117 a pro jejich komplexní chápání není možná redukce na jeden buněčný typ. Analogicky, častým přístupem při hledání „tkáňového nádorového markeru“ je prosté porovnání nádorové tkáně pacienta s tkání nádoru přilehlou, histologem označenou jako „normální“. Nicméně, v průběhu progrese nádoru ovlivňují nádorové buňky přilehlé stroma s cílem vytvořit tumor-podporující prostředí118 . Typicky jsou ovlivněny fibroblasty – bylo prokázáno, že až 80 % morfologicky normálních fibroblastů karcinomu prsu vykazuje odlišný fenotyp „cancer-associated fibroblastů“ (CAF)119 . Role CAF je obdobná myelofibroblastům při hojení ran – secernují prozánětlivé cytokiny, růstové faktory s cílem vytvořit permisivní prostředí118 . Není proto možné s jistotou považovat nádoru přilehlou tkáň jako referenční, protože právě zde tvoří fibroblasty buněčnou majoritu, byť jsou morfologicky normální72 . V naší práci Raudenska et al 99 (dostupné na str. 103) byly proto použity dvě referenční tkáně – tkáň nádoru přilehlá a tkáň pacientů po tonzilektomii. Vzorky získané při tonzilektomii představují tkáň vystavenou chronickému zánětu, která však dosud neprošla procesem nádorové transformace. V práci bylo zjištěno, že transkriptom tkáně přiléhající k tumoru byl v mnoha ohledech „podobnější“ nádorové tkáni – expresí (tumor-podporujících) růstových faktorů EGF, Diskuse výsledků 5 186 jejich receptorů, markerů proliferace MKI67, antioxidačně působících MT2A a apoptózu regulujících BAX genů. Lze teoreticky předpokládat, že tkáně přilehlé k nádoru mohou produkcí EGF podporovat růst nádoru, což je v souladu s dalšími studiemi21,120-122 . Vyjma EGF a jiných genů dochází také k významně vyšším hladinám miRNA – miR-29c-3p a miR-375 v přilehlé tkáni oproti tkáni nádorové, jak bylo ukázáno ve studii Hudcova et al.100 (dostupné na str. 123). Prostřednictvím epigenetické regulace tak mohou být ovlivněny buněčné pochody imunitní odpovědi (GO:0006955), buněčné adheze (GO:0007155), buněčné komunikace (GO:0007154) aj., jak bylo zjištěno za pomocí kombinace bioinformatických nástrojů TargetScan 7.2 (www.targetscan.org) a Gene ontology Enrichment analysis (Panter 13.1, geneontology.org). Fakt, že transkriptom nádorové tkáně se liší oproti histologicky stejné tkáni pacienta bez nádoru má také diagnostický potenciál – charakteristická exprese výše uvedených genů jednak predikuje malignitu, jednak může být využita k ověření okrajů při chirurgickém odstranění nádoru. Nádory jsou dynamickým onemocněním a proto pouhé porovnání bioptických vzorků nádorový okraj/střed nádorů zdaleka nepopisuje heterogenitu spektra buněk. V průběhu tumorigeneze dochází k vývoji a selekci geneticky odlišných subpopulací nádorových buněk uvnitř nádorového ložiska, propůjčující nádorům schopnost rezistence123 . Pochopení a charakterizace této heterogenity je tak nezbytným krokem pro vývoj cílených léčebných strategií budoucí personalizované léčby. Pro heterogenitu spinocelulárních nádorů hlavy a krku hrají zásadní roli povrchové antigeny CD90 a CD4477-79 . CD44-pozitivní buňky jsou typicky ty schopné iniciovat tumorigenezi 83-86 , migraci80 a metastázování87 . Exprese CD90 je charakteristická pro mezenchymální buňky – tedy – v případě nádorové tkáně zejména CAFs91,92 . S cílem popsat roli jednotlivých subpopulací CD44/CD90 v mikroprostředí byla vytvořena primokultura z dobře diferencovaného karcinomu dutiny ústní (viz publikace Svobodova et al. 103 na str. 158). Tyto subpopulace (CD44+/CD90−, CD44+/CD90+, CD44−/CD90+ a CD44−/CD90−) se mezi sebou lišily v mnoha ohledech (viz kapitola 4.7); z perspektivy vlivu mikroprostředí je nejzásadnějším zjištěním, že subpopulace pozitivní na CD90 a negativní na CD44, tj. „s nádorem asociované fibroblasty“ podporovaly růst „nádorové“ populace CD44+/CD90−, zatímco populace negativní na CD44 (a pozitivní na CD90) nádorovou populaci v agresivním fenotypu spíše tlumily a způsobovaly prudký nárůst poměru BAX/BCL2. U těchto nádorových buněk ovlivněných buňkami CD90+/CD44+ (CAFs) bylo zjištěno, že na základě změn v genové expresi dochází k aktivaci genů souvisejících s embryonálními buněčnými procesy (GO:0001711 pathway analýza), což je ve shodě s literaturou. Chen et al souhlasně prokázali, že u buněk plicního nádoru dochází po ovlivnění fibroblasty asociovanými s nádorem ke zvýraznění „cancer stem cell“ fenotypu provázeného zvýšením exprese markeru NANOG 124 . Vyjma uvedeného Diskuse výsledků 5 187 bylo ve studii potvrzeno, že na základě genové exprese dochází právě u subpopulace CD44 k aktivací buněčných kaskád souvisejících s regulací proliferace epiteliálních buněk (GO:0050678), buněčného cyklu (GO:0051726), regulací apoptózy (GO:0042981), migrací monocytů (GO:0071674), aj., zatímco u buněk CD90+ oproti buňkám negativním na tento marker nedochází ke změně v transkriptomu sledovaných genů, ani ke změnám v migračním potenciálu. Závěry vycházející pouze z analýzy transkriptomu indikují, že právě CD44+ jsou populací zodpovědnou za agresivní fenotyp nádorů. Populace CD90, ač nevykazující zásadní rozdíly v aktivaci genů „hallmarks of cancer“ nicméně podporují CD44 populaci v růstu, jak demonstrováno migračními analýzami. Navíc, z perspektivy reakce subpopulací na ozáření bylo patrné, že kultury CD90+ a CD90− kultivované dohromady vykazovaly nižší míru tvorby dvouřetězcových zlomů DNA a rychlejší dynamiku jejich oprav (str. 179). Nabízí se spekulace, že míru agresivity tumoru není možné stanovit na základě (jednoduché analýzy) transkriptomu jedné subpopulace, ale takovými metodami, integrujícími poznatky o vzájemné interakci jednotlivých buněčných populací v mikroprostředí. Tyto metody jsou nicméně metodicky a časově náročné a v současné chvíli nejsou jednoduše redukovatelné do podoby přímočarého klinicky využitelného testu. Mikroprostředí je typicky definováno svou složkou buněčnou a extracelulární – tedy složky organismu vlastní, byť nádorově změněné. Fenotyp mikroprostředí je nicméně definován také exogenními biologickými vlivy – pro HNSCC má nejzásadnější význam přítomnost HPV. I když jsou HPV+ , tak HPV− charakteristické ovlivněním zejména supresoru TP53, u obou typů nádorů dochází k tomuto jevu zcela odlišnými cestami; zatímco u HPV− se toto děje typicky v důsledku genové nestability a z toho vyplývajících mutací TP53, HPV+ tumory toto činní prostřednictvím virových proteinů E6 a E7 71 . Ty inhibují (jinak intaktní) tumor supresor67-70 . TP53 „dysfunkce“ je proto do jisté míry reverzibilní. I když je podstatná část TP53 inhibována virovými proteiny, při nárůstu buněčného stresu (např. v důsledku chemo/radioterapie) dochází ke zvýšení exprese TP53 a tato malá, dosud neinhibovaná frakce pravděpodobně umožní zástavu buněčného cyklu a naměřování buněk do buněčné smrti, jak popsáno ve studii Westra et al.71 . Toto bylo nepřímo potvrzeno i v naší studii – celkové přežití HPV+ pacientů se liší v závislosti na míře tkáňové exprese pro-apoptotického BAX a TP53. Přežívání s vyšší expresí obou těchto genů je lepší, viz str. 152. Popsání prognostických biomarkerů pro karcinomy hlavy a krku, resp. absence biomarkerů pro schopných predikovat efekt nechirurgické léčby je významnou limitací současné diagnosticky a terapie tohoto onemocnění. Protože existují tyto zásadní rozdíly v závislosti na HPV statusu, Diskuse výsledků 5 188 je nutné očekávat, že potenciální panel biomarkerů bude odlišný pro HPV+ a HPV– tumory, jak demonstrováno v naší studii. Na základě změn v tkáňové expresi (nižší exprese MMP9, MT2A, FLT1, VEGFA a FOU5F1 u HPV+ tumorů) bylo prokázáno zapojení do kaskád souvisejících se signalizací VEGF (GO:0038084) a „embryonální vývoj“, (GO:0009790). V tomto ohledu je zajímavá zejména asociace s MT2A. Tento protein, ač primárně zapojený do antioxidačních funkcí, do patogeneze choroby zasahuje pravděpodobně významnou měrou; v meta-analýze Gumulec et al. byla ověřena spojitost vysoké exprese s nepříznivou prognózou, 42 . Ostrakhovitch et al popsali, že MT je schopen zabránit vazbě TP53 na DNA a tím ovlivnit jeho tumorsupresorové působení125 . Určitou strategií pro stanovení efektu léčby, např. právě diskutované radioterapie, může být analýza genové nestability a míry reparace dvouřetězcových zlomů DNA buněk získaných z biopsie a ozářených in vitro, jak popsáno v práci Falk et al dostupné na str. 175. Touto metodou bylo prokázáno, že míru radiorezistence nádorové tkáně je možné predikovat. Nádory o vyšším stádiu vykazovaly vyšší míru radiorezistence a přinejmenším u některých nádorů je touto metodou možné predikovat radiosenzitivitu a tím výhledově objektivněji volit léčbu konkrétnímu pacientovi. Současně je touto metodou možné odlišit zejména extrémně radiorezistentní, resp. extrémně radiosenzitivní tkáně; jeden ze tří pacientů, u nichž je na základě kliniky očekávána radiosenzitivita, vykazuje enormní míru tvorby dvouřetězcových zlomů. Naopak vysoká míra radiorezistence byla patrná u jednoho pacienta ze čtyř, projevující se velmi rychlou reparací vzniklých zlomů, rychlejší či stejně rychlou jako u buněčné linie fibroblastů. Mikroprostředí, resp. jeho heterogenita, významně ovlivňuje progresi nádorů. Výše uvedené výsledky – heterogenní odpověď radioterapie, rozdílná schopnost subpopulací migrovat – jasně dokládají, že charakterizace mikroprostředí je nezbytná pro volbu optimálního terapeutického postupu konkrétního pacienta. Závěr 6 189 6 Závěr Hlavním faktorem podílejícím se na letalitě nádorových onemocnění a selhání nechirurgické léčby je vysoká míra heterogenity buněčné nádorové populace126 . Tato heterogenita je u různých nádorů variabilní, nádory hlavy a krku jsou charakterizovány její poměrně vysokou měrou. Přes množství studií popisujících tuto variabilitu mikroprostředí a její klinickou relevanci stagnuje vývoj nových léčebných postupů a způsobů, kterak problematiku „dynamické evoluce“ uchopit klinickými studiemi. Téma heterogenity nádorového mikroprostředí je v práci studováno víceúrovňově – na úrovni analýzy séra, tkáňových vzorků, ale také na úrovni jednotlivých subpopulací buněk získaných z nádorových vzorků pacientů se spinocelulárními karcinomy. Zásadním problémem léčby spinocelulárních karcinomů je existence rezistence k nechirurgickým terapeutickým postupům, kterou není možné predikovat před zahájením léčby. Klinicky využitelné prognostické biomarkery podobné PSA pro nádor prostaty, či estrogenovému receptoru či HER2 pro nádor prsu9,10 pro nádory hlavy a krku neexistují. „Biomarkery“ jsou tradičně vnímány jako produkt nádorových buněk. Díky komplexnosti mikroprostředí dochází v důsledku přítomností nádoru k ovlivnění jinak histologicky normální „k nádoru přilehlé“ tkáně a tato tkáň poté mění svůj transkriptom. Ty nejenže jsou schopny podporovat růst vlastní nádorové tkáně, jsou také schopny na základě spektra transkriptomu nádorovou tkáň predikovat. Zásadní poznatky byly získány studiem interakce subpopulací jednotlivých buněk charakteristických přítomností povrchových antigenů CD44 a CD90. Nejenže bylo zjištěno, že populace CD44 je významně zapojena do patogeneze prostřednictvím své účasti v molekulárně-biologických procesech de-diferenciace, proliferace, apoptózy, bylo také pozorováno, že populace „nenádorová“ CD90, jinak nevykazující „fenotyp agresivního nádoru“, zásadně podporuje růst vlastní nádorové populace a propůjčuje rezistenci k radioterapii jiným subpopulacím. Populace buněk s povrchovým antigenem CD90, tedy populace s nádorem asociovaných fibroblastů je významným podpůrným článkem nádorového mikroprostředí. Spinocelulární nádory hlavy a krku, podobně jako většina solidních tumorů, nejsou monoklonální neoplázií. Přístup k vývoji nových diagnostických a (zejména pak) léčebných strategií musí tuto heterogenitu mikroprostředí reflektovat, protože právě toto je jedna z cest – možná cesta zásadní – pro personalizovanou medicínu schopnou radikálního zlepšení prognózy pacientů s pokročilými nádory. Použitá literatura 7 190 7 Použitá literatura 1. Ramos M, Benavente S, Giralt J. Management of squamous cell carcinoma of the head and neck: updated European treatment recommendations. Expert Review of Anticancer Therapy. 2010;10(3):339-344. 2. Thomas GR, Nadiminti H, Regalado J. Molecular predictors of clinical outcome in patients with head and neck squamous cell carcinoma. International Journal of Experimental Pathology. 2005;86(6):347-363. 3. Goldberg HI, Lockwood SA, Wyatt SW, Crossett LS. TRENDS AND DIFFERENTIALS IN MORTALITY FROM CANCERS OF THE ORAL CAVITY AND PHARYNX IN THE UNITED-STATES, 1973-1987. Cancer. 1994;74(2):565-572. 4. Forastiere A, Koch W, Trotti A, Sidransky D. Medical progress - Head and neck cancer. New England Journal of Medicine. 2001;345(26):1890-1900. 5. Ghoshal S, Mallick I, Panda N, Sharma SC. Carcinoma of the buccal mucosa: Analysis of clinical presentation, outcome and prognostic factors. Oral Oncology. 2006;42(5):533-539. 6. Jones KR, Lodgerigal RD, Reddick RL, Tudor GE, Shockley WW. PROGNOSTIC FACTORS IN THE RECURRENCE OF STAGE-I AND STAGE-II SQUAMOUSCELL CANCER OF THE ORAL CAVITY. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 1992;118(5):483-485. 7. Fínek J. Novinky v léčbě pokročilých nádorů hlavy a krku. Klinická farmakologie a farmacie. 2006;20(3):162-164. 8. Goldson TM, Han Y, Knight KB, Weiss HL, Resto VA. Clinicopathological predictors of lymphatic metastasis in HNSCC: implications for molecular mechanisms of metastatic disease. J Exp Ther Oncol. 2010;8(3):211-221. 9. Fernandez AG, Gimenez N, Fraile M, et al. Survival and clinicopathological characteristics of breast cancer patient according to different tumour subtypes as determined by hormone receptor and Her2 immunohistochemistry. A single institution survey spanning 1998 to 2010. Breast. 2012;21(3):366-373. 10. Wallner LP, Frencher SK, Hsu JWY, et al. Changes in serum prostate-specific antigen levels and the identification of prostate cancer in a large managed care population. Bju International. 2013;111(8):1245-1252. 11. Polanska H, Raudenska M, Gumulec J, et al. Clinical significance of head and neck squamous cell cancer biomarkers. Oral Oncology. 2014;50(3):168-177. 12. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 2011;144(5):646-674. 13. Albitar L, Pickett G, Morgan M, Wilken JA, Maihle NJ, Leslie KK. EGFR isoforms and gene regulation in human endometrial cancer cells. Molecular Cancer. 2010;9. 14. Ullrich A, Coussens L, Hayflick JS, et al. HUMAN EPIDERMAL GROWTHFACTOR RECEPTOR CDNA SEQUENCE AND ABERRANT EXPRESSION OF THE AMPLIFIED GENE IN A431 EPIDERMOID CARCINOMA-CELLS. Nature. 1984;309(5967):418-425. 15. Ciardiello F, Tortora G. Epidermal growth factor receptor (EGFR) as a target in cancer therapy: understanding the role of receptor expression and other molecular determinants that could influence the response to anti-EGFR drugs. European Journal of Cancer. 2003;39(10):1348-1354. Použitá literatura 7 191 16. Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signalling network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2001;2(2):127-137. 17. Zuo J-H, Zhu W, Li M-Y, et al. Activation of EGFR Promotes Squamous Carcinoma SCC10A Cell Migration and Invasion Via Inducing EMT-Like Phenotype Change and MMP-9-Mediated Degradation of E-Cadherin. Journal of Cellular Biochemistry. 2011;112(9):2508-2517. 18. Holz C, Niehr F, Boyko M, et al. Epithelial-mesenchymal-transition induced by EGFR activation interferes with cell migration and response to irradiation and cetuximab in head and neck cancer cells. Radiotherapy and Oncology. 2011;101(1):158-164. 19. Box C, Rogers SJ, Mendiola M, Eccles SA. Tumour-microenvironmental interactions: paths to progression and targets for treatment. Seminars in Cancer Biology. 2010;20(3):128-138. 20. Grandis JR, Melhem MF, Gooding WE, et al. Levels of TGF-alpha and EGFR protein in head and neck squamous cell carcinoma and patient survival. Journal of the National Cancer Institute. 1998;90(11):824-832. 21. Ang KK, Berkey BA, Tu XY, et al. Impact of epidermal growth factor receptor expression on survival and pattern of relapse in patients with advanced head and neck carcinoma. Cancer Research. 2002;62(24):7350-7356. 22. Birchmeier C, Birchmeier W, Gherardi E, Vande Woude GF. Met, metastasis, motility and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003;4(12):915-925. 23. Sun Q, Sakaida T, Yue W, Gollin SM, Yu J. Chemosensitization of head and neck cancer cells by PUMA. Molecular Cancer Therapeutics. 2007;6(12):3180-3188. 24. Lee TL, Yeh J, Friedman J, et al. A signal network involving coactivated NF-kappa B and STAT3 and altered p53 modulates BAX/BCL-XL expression and promotes cell survival of head and neck squamous cell carcinomas. International Journal of Cancer. 2008;122(9):1987-1998. 25. Kim CH, Koh YW, Han JH, et al. C-MET expression as an indicator of survival outcome in patients with oral tongue carcinoma. Head and Neck-Journal for the Sciences and Specialties of the Head and Neck. 2010;32(12):1655-1664. 26. Pena JC, Thompson CB, Recant W, Vokes EE, Rudin CM. Bcl-xL and Bcl-2 expression in squamous cell carcinoma of the head and neck. Cancer. 1999;85(1):164- 170. 27. Rak J, Yu JL, Klement G, Kerbel RS. Oncogenes and angiogenesis: Signaling threedimensional tumor growth. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 2000;5(1):24-33. 28. Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW, et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature. 1999;399(6733):271-275. 29. Hong DY, Lee BJ, Lee JC, Choi JS, Wang SG, Ro JH. Expression of VEGF, HGF, IL- 6, IL-8, MMP-9, Telomerase in Peripheral Blood of Patients with Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Clinical and Experimental Otorhinolaryngology. 2009;2(4):186-192. 30. Jaiswal SG, Gadbail AR, Chaudhary MS, Jaiswal GR, Gawande M. Correlation of serum levels of vascular endothelial growth factor with TNM staging, histopathologic grading, and surgical therapy for oral squamous cell carcinoma. Quintessence International. 2011;42(9):771-779. 31. Smith BD, Smith GL, Carter D, Sasaki CT, Haffty BG. Prognostic significance of vascular endothelial growth factor protein levels in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 2000;18(10):2046-2052. Použitá literatura 7 192 32. Tse GM, Chan AWH, Yu KH, et al. Strong immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor predicts overall survival in head and neck squamous cell carcinoma. Annals of Surgical Oncology. 2007;14(12):3558-3565. 33. Brizel DM, Dodge RK, Clough RW, Dewhirst MW. Oxygenation of head and neck cancer: changes during radiotherapy and impact on treatment outcome. Radiotherapy and Oncology. 1999;53(2):113-117. 34. Kyzas PA, Cunha IW, Ioannidis JPA. Prognostic significance of vascular endothelial growth factor immunohistochemical expression in head and neck squamous cell carcinoma: A meta-analysis. Clinical Cancer Research. 2005;11(4):1434-1440. 35. Wang F, Arun P, Friedman J, Chen Z, Van Waes C. Current and potential inflammation targeted therapies in head and neck cancer. Current Opinion in Pharmacology. 2009;9(4):389-395. 36. Ruttkay-Nedecky B, Nejdl L, Gumulec J, et al. The Role of Metallothionein in Oxidative Stress. International Journal of Molecular Sciences. 2013;14(3):6044-6066. 37. Li XY, Chen HN, Epstein PN. Metallothionein protects islets from hypoxia and extends islet graft survival by scavenging most kinds of reactive oxygen species. Journal of Biological Chemistry. 2004;279(1):765-771. 38. Sato M, Bremner I. OXYGEN FREE-RADICALS AND METALLOTHIONEIN. Free Radical Biology and Medicine. 1993;14(3):325-337. 39. Ioachim E, Assimakopoulos D, Peschos D, Zissi A, Skevas A, Agnantis NJ. Immunohistochemical expression of metallothionein in benign premalignant and malignant epithelium of the larynx: Correlation with p53 and proliferative cell nuclear antigen. Pathology Research and Practice. 1999;195(12):809-814. 40. Sochor J, Hynek D, Krejcova L, et al. Study of Metallothionein Role in Spinocellular Carcinoma Tissues of Head and Neck Tumours using Brdicka Reaction. International Journal of Electrochemical Science. 2012;7(3):2136-2152. 41. Krejcova L, Fabrik I, Hynek D, et al. Metallothionein Electrochemically Determined using Brdicka Reaction as a Promising Blood Marker of Head and Neck Malignant Tumours. International Journal of Electrochemical Science. 2012;7(3):1767-1784. 42. Gumulec J, Raudenska M, Adam V, Kizek R, Masarik M. Metallothionein Immunohistochemical Cancer Biomarker: A Meta-Analysis. Plos One. 2014;9(1). 43. Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, et al. Circulating microRNAs as stable bloodbased markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008;105(30):10513-10518. 44. Kumar B, Yadav A, Lang J, Teknos TN, Kumar P. Dysregulation of MicroRNA-34a Expression in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Promotes Tumor Growth and Tumor Angiogenesis. Plos One. 2012;7(5). 45. Avissar M, Christensen BC, Kelsey KT, Marsit CJ. MicroRNA Expression Ratio Is Predictive of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 2009;15(8):2850-2855. 46. Wolf GT. Options for preserving the larynx in patients with advanced laryngeal and hypopharyngeal cancer. Ear Nose Throat J. 2001;80(12):897-901. 47. Gilbert J, Forastiere AA. Organ preservation for cancer of the larynx: current indications and future directions. Seminars in Radiation Oncology. 2004;14(2):167-177. 48. Francesco P, Roberto P, Giuseppina DVS, et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 2015;37(5):763-770. 49. Mountzios G, Rampias T, Psyrri A. The mutational spectrum of squamous-cell carcinoma of the head and neck: targetable genetic events and clinical impact. Ann Oncol. 2014;25(10):1889-1900. Použitá literatura 7 193 50. Ettl T, Viale-Bouroncle S, Hautmann MG, et al. AKT and MET signalling mediates antiapoptotic radioresistance in head neck cancer cell lines. Oral Oncol. 2015;51(2):158-163. 51. Peng G, Cao RB, Li YH, Zou ZW, Huang J, Ding Q. Alterations of cell cycle control proteins SHP1/2, p16, CDK4 and cyclin D1 in radioresistant nasopharyngeal carcinoma cells. Mol Med Rep. 2014;10(4):1709-1716. 52. Maalouf M, Alphonse G, Colliaux A, et al. Different mechanisms of cell death in radiosensitive and radioresistant p53 mutated head and neck squamous cell carcinoma cell lines exposed to carbon ions and x-rays. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2009;74(1):200-209. 53. Wang Q, Wu PC, Roberson RS, et al. Survivin and escaping in therapy-induced cellular senescence. Int J Cancer. 2011;128(7):1546-1558. 54. Affolter A, Schmidtmann I, Mann WJ, Brieger J. Cancer-associated fibroblasts do not respond to combined irradiation and kinase inhibitor treatment. Oncol Rep. 2013;29(2):785-790. 55. Kutler DI, Auerbach AD, Satagopan J, et al. High incidence of head and neck squamous cell carcinoma in patients with Fanconi Anemia. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 2003;129(1):106-112. 56. Syrjanen K, Syrjanen S, Lamberg M, Pyrhonen S, Nuutinen J. Morphological and immunohistochemical evidence suggesting human papillomavirus (HPV) involvement in oral squamous-cell carcinogenesis. International Journal of Oral Surgery. 1983;12(6):418-424. 57. Marur S, D'Souza G, Westra WH, Forastiere AA. HPV-associated head and neck cancer: a virus-related cancer epidemic. Lancet Oncology. 2010;11(8):781-789. 58. Slebos RJC, Yi YJ, Ely K, et al. Gene expression differences associated with human papillomavirus status in head and neck squamous cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 2006;12(3):701-709. 59. Haedicke J, Iftner T. Human papillomaviruses and cancer. Radiotherapy and Oncology. 2013;108(3):397-402. 60. Kreimer AR, Clifford GM, Boyle P, Franceschi S. Human papillomavirus types in head and neck squamous cell carcinomas worldwide: A systematic review. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 2005;14(2):467-475. 61. Vega-Pena A, Illades-Aguiar B, Flores-Alfaro E, Lopez-Bayghen E, Reyes-Maldonado E, Alarcon-Romero LD. Correlation between Ki-67 and telomerase expression with in situ hybridization for high-risk human papillomavirus. Archives of Biological Sciences. 2013;65(1):81-90. 62. Dyson N, Howley PM, Munger K, Harlow E. The human papilloma virus-16 E7oncoprotein is able to bind to the retinoblastoma gene-product. Science. 1989;243(4893):934-937. 63. Mantovani F, Banks L. The Human Papillomavirus E6 protein and its contribution to malignant progression. Oncogene. 2001;20(54):7874-7887. 64. Braakhuis BJM, Snijders PJF, Keune WJH, et al. Genetic patterns in head and neck cancers that contain or lack transcriptionally active human papillomavirus. Journal of the National Cancer Institute. 2004;96(13):998-1006. 65. Jo S, Juhasz A, Zhang K, et al. Human Papillomavirus Infection as a Prognostic Factor in Oropharyngeal Squamous Cell Carcinomas Treated in a Prospective Phase II Clinical Trial. Anticancer Research. 2009;29(5):1467-1474. 66. Ritchie JM, Smith EM, Summersgill KF, et al. Human papillomavirus infection as a prognostic factor in carcinomas of the oral cavity and oropharynx. International Journal of Cancer. 2003;104(3):336-344. Použitá literatura 7 194 67. Ang KK, Harris J, Wheeler R, et al. Human Papillomavirus and Survival of Patients with Oropharyngeal Cancer. New England Journal of Medicine. 2010;363(1):24-35. 68. Fakhry C, Westra WH, Cmelak SLA, et al. Improved survival of patients with human papillomavirus-positive head and neck squamous cell carcinoma in a prospective clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 2008;100(4):261-269. 69. Ragin CCR, Taioli E. Survival of squamous cell carcinoma of the head and neck in relation to human papillomavirus infection: Review and meta-analysis. International Journal of Cancer. 2007;121(8):1813-1820. 70. Pai SI, Westra WH. Molecular Pathology of Head and Neck Cancer: Implications for Diagnosis, Prognosis, and Treatment. Annual Review of Pathology-Mechanisms of Disease. Vol 4. Palo Alto: Annual Reviews; 2009:49-70. 71. Westra WH, Taube JM, Poeta ML, Begum S, Sidransky D, Koch WM. Inverse relationship between human papillomavirus-16 infection and disruptive p53 gene mutations in squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Cancer Res. 2008;14(2):366-369. 72. Chandran UR, Dhir R, Ma CQ, Michalopoulos G, Becich M, Gilbertson J. Differences in gene expression in prostate cancer, normal appearing prostate tissue adjacent to cancer and prostate tissue from cancer free organ donors. Bmc Cancer. 2005;5. 73. Joshi A, Cao DL. TGF-beta signaling, tumor microenvironment and tumor progression: the butterfly effect. Frontiers in Bioscience-Landmark. 2010;15:180-194. 74. Sanz-Pamplona R, Berenguer A, Cordero D, et al. Aberrant gene expression in mucosa adjacent to tumor reveals a molecular crosstalk in colon cancer. Mol Cancer. 2014;13:46. 75. Gregoire V, Lefebvre JL, Licitra L, Felip E, Working E-E-EG. Squamous cell carcinoma of the head and neck: EHNS-ESMO-ESTRO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 2010;21:v184-v186. 76. Bragado P, Estrada Y, Sosa MS, et al. Analysis of Marker-Defined HNSCC Subpopulations Reveals a Dynamic Regulation of Tumor Initiating Properties. Plos One. 2012;7(1). 77. Tang KH, Dai YD, Tong M, et al. A CD90(+) Tumor-Initiating Cell Population with an Aggressive Signature and Metastatic Capacity in Esophageal Cancer. Cancer Research. 2013;73(7):2322-2332. 78. Satpute PS, Hazarey V, Ahmed R, Yadav L. Cancer Stem Cells in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma: A Review. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 2013;14(10):5579-5587. 79. Major AG, Pitty LP, Farah CS. Cancer Stem Cell Markers in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Stem Cells International. 2013. 80. Ponta H, Sherman L, Herrlich PA. CD44: From adhesion molecules to signalling regulators. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2003;4(1):33-45. 81. Perez A, Neskey DM, Wen J, et al. CD44 interacts with EGFR and promotes head and neck squamous cell carcinoma initiation and progression. Oral Oncology. 2013;49(4):306-313. 82. Herishanu Y, Gibellini F, Njuguna N, Keyvanfar K, Wiestner A. CD44 Signaling Via PI3K/AKT and MAPK/FRK Pathways Protects CLL Cells from Spontaneous and Drug Induced Apoptosis. Blood. 2008;112(11):203-203. 83. Joshua B, Kaplan MJ, Doweck I, et al. FREQUENCY OF CELLS EXPRESSING CD44, A HEAD AND NECK CANCER STEM CELL MARKER: CORRELATION WITH TUMOR AGGRESSIVENESS. Head and Neck-Journal for the Sciences and Specialties of the Head and Neck. 2012;34(1):42-49. Použitá literatura 7 195 84. Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003;100(7):3983-3988. 85. Collins AT, Berry PA, Hyde C, Stower MJ, Maitland NJ. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 2005;65(23):10946-10951. 86. Li C, Heidt DG, Dalerba P, et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 2007;67(3):1030-1037. 87. Gunthert U, Hofmann M, Rudy W, et al. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma-cells. Cell. 1991;65(1):13-24. 88. Prince ME, Sivanandan R, Kaczorowski A, et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2007;104(3):973-978. 89. La Fleur L, Johansson A-C, Roberg K. A CD44(high)/EGFR(low) Subpopulation within Head and Neck Cancer Cell Lines Shows an Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype and Resistance to Treatment. Plos One. 2012;7(9). 90. Janisiewicz AM, Shin JH, Murillo-Sauca O, et al. CD44+cells have cancer stem celllike properties in nasopharyngeal carcinoma. International Forum of Allergy & Rhinology. 2012;2(6):465-470. 91. Ko KS, Arora PD, McCulloch CAG. Cadherins mediate intercellular mechanical signaling in fibroblasts by activation of stretch-sensitive calcium-permeable channels. Journal of Biological Chemistry. 2001;276(38):35967-35977. 92. Kisselbach L, Merges M, Bossie A, Boyd A. CD90 Expression on human primary cells and elimination of contaminating fibroblasts from cell cultures. Cytotechnology. 2009;59(1):31-44. 93. Lu H, Clauser KR, Tam WL, et al. A breast cancer stem cell niche supported by juxtacrine signalling from monocytes and macrophages. Nature Cell Biology. 2014;16(11):1105-+. 94. Raudenska M, Gumulec J, Fribley AM, Masarik M. HNSCC Biomarkers Derived from Key Processes of Cancerogenesis. In: Fribley AM, ed. Targeting Oral Cancer. 1st ed. ed. Switzerland: Springer International Publishing; 2016:115-160. 95. Costello LC, Franklin RB. The intermediary metabolism of the prostate: a key to understanding the pathogenesis and progression of prostate malignancy. Oncology. 2000;59(4):269-282. 96. Franklin RB, Feng P, Milon B, et al. hZIP1 zinc uptake transporter down regulation and zinc depletion in prostate cancer. Molecular Cancer. 2005;4. 97. Gumulec J, Masarik M, Adam V, Eckschlager T, Provaznik I, Kizek R. Serum and Tissue Zinc in Epithelial Malignancies: A Meta-Analysis. Plos One. 2014;9(6). 98. Ressnerova A, Raudenska M, Holubova M, et al. Zinc and Copper Homeostasis in Head and Neck Cancer: Review and Meta-Analysis. Current Medicinal Chemistry. 2016;23(13):1304-1330. 99. Raudenska M, Sztalmachova M, Gumulec J, et al. Prognostic significance of the tumour-adjacent tissue in head and neck cancers. Tumor Biology. 2015;36(12):9929- 9939. 100. Hudcova K, Raudenska M, Gumulec J, et al. Expression profiles of miR-29c, miR- 200b and miR-375 in tumour and tumour-adjacent tissues of head and neck cancers. Tumor Biology. 2016;37(9):12627-12633. 101. Hudcova K, Trnkova L, Kejnovska I, et al. Novel biophysical determination of miRNAs related to prostate and head and neck cancers. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 2015;44(3):131-138. Použitá literatura 7 196 102. Polanska H, Heger Z, Gumulec J, et al. Effect of HPV on tumor expression levels of the most commonly used markers in HNSCC. Tumor Biology. 2016;37(6):7193-7201. 103. Svobodova M, Raudenska M, Gumulec J, et al. Establishment of oral squamous cell carcinoma cell line and magnetic bead-based isolation and characterization of its CD90/CD44 subpopulations. Oncotarget. 2017;8(39):66254-66269. 104. Falk M, Horakova Z, Svobodova M, et al. gamma H2AX/53BP1 foci as a potential pre-treatment marker of HNSCC tumors radiosensitivity - preliminary methodological study and discussion. European Physical Journal D. 2017;71(9). 105. Kinugasa Y, Matsui T, Takakura N. CD44 Expressed on Cancer-Associated Fibroblasts Is a Functional Molecule Supporting the Stemness and Drug Resistance of Malignant Cancer Cells in the Tumor Microenvironment. Stem Cells. 2014;32(1):145-156. 106. Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM. MET signalling: principles and functions in development, organ regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(12):834- 848. 107. Sun S, Wang Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met(+) cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 2011;129(10):2337-2348. 108. Tartarone A, Lazzari C, Lerose R, et al. Mechanisms of resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors gefitinib/erlotinib and to ALK inhibitor crizotinib. Lung Cancer. 2013;81(3):328-336. 109. Szturz P, Raymond E, Abitbol C, Albert S, de Gramont A, Faivre S. Understanding cMET signalling in squamous cell carcinoma of the head & neck. Crit Rev Oncol Hematol. 2017;111:39-51. 110. Baschnagel AM, Tonlaar N, Eskandari M, et al. Combined CD44, c-MET, and EGFR expression in p16-positive and p16-negative head and neck squamous cell carcinomas. J Oral Pathol Med. 2017;46(3):208-213. 111. Pekarik V, Gumulec J, Masarik M, Kizek R, Adam V. Prostate Cancer, miRNAs, Metallothioneins and Resistance to Cytostatic Drugs. Current Medicinal Chemistry. 2013;20(4):534-544. 112. True LD, Zhang H, Ye M, et al. CD90/THY1 is overexpressed in prostate cancerassociated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Modern Pathology. 2010;23(10):1346-1356. 113. Liotta F, Querci V, Mannelli G, et al. Mesenchymal stem cells are enriched in head neck squamous cell carcinoma, correlates with tumour size and inhibit T-cell proliferation. British Journal of Cancer. 2015;112(4):745-754. 114. Scherer WF, Syverton JT, Gey GO. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. J Exp Med. 1953;97(5):695-710. 115. Gillet J-P, Varma S, Gottesman MM. The Clinical Relevance of Cancer Cell Lines. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 2013;105(7):452-458. 116. Gao H, Korn JM, Ferretti S, et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 2015;21:1318. 117. Wang M, Zhao J, Zhang L, et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. Journal of Cancer. 2017;8(5):761-773. 118. Xing F, Saidou J, Watabe K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 2010;15:166- 179. Použitá literatura 7 197 119. Sappino AP, Skalli O, Jackson B, Schurch W, Gabbiani G. Smooth-muscle differentiation in stromal cells of malignant and non-malignant breast tissues. Int J Cancer. 1988;41(5):707-712. 120. Kalyankrishna S, Grandis JR. Epidermal growth factor receptor biology in head and neck cancer. Journal of Clinical Oncology. 2006;24(17):2666-2672. 121. Grandis JR, Tweardy DJ. Elevated levels of transforming growth-factor-alpha and epidermal growth-factor receptor messenger-rna are early markers of carcinogenesis in head and neck-cancer. Cancer Research. 1993;53(15):3579-3584. 122. Grandis JR, Tweardy DJ, Melhem MF. Asynchronous modulation of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor protein expression in progression of premalignant lesions to head and neck squamous cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 1998;4(1):13-20. 123. Dagogo-Jack I, Shaw AT. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 2017;15:81. 124. Chen W-J, Ho C-C, Chang Y-L, et al. Cancer-associated fibroblasts regulate the plasticity of lung cancer stemness via paracrine signalling. Nature Communications. 2014;5:3472. 125. Ostrakhovitch EA, Olsson PE, Jiang S, Cherian MG. Interaction of metallothionein with tumor suppressor p53 protein. FEBS Lett. 2006;580(5):1235-1238. 126. Greaves M. Evolutionary determinants of cancer. Cancer Discov. 2015;5(8):806-820.