LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERZITY
V BRNĚ
GENETICKÉ A LABORATORNÍ MARKERY U
PACIENTŮ S ISCHEMICKOU CHOROBOU
SRDEČNÍ
(SOUBOR PUBLIKACÍ)
MUDr. Vladimír Kincl, Ph.D.
HABILITAČNÍ PRÁCE
BRNO 2018
2
Pokládám za milou povinnost poděkovat
svému učiteli:
prof. MUDr. Jaroslavu Meluzínovi, CSc, za odborné vedení, cenné rady, podněty a
velkou trpělivost při konzultacích
přednostům I.interní kardioangiologické kliniky:
prof. MUDr. Jiřímu Vítovcovi, CSc a prof.MUDr. Lence Špinarové, Ph.D., za
vytváření prostředí pro vědeckou práci
svým kolegům:
doc. MUDr. Romanovi Panovskému, Ph.D., MUDr. Janu Máchalovi, Ph.D., za
pomoc při zpracování získaných dat
pracovníkům Ústavu patologické fyziologie LF MU pod vedením prof. MUDr. Anny
Vašků, CSc, za genetické analýzy a cenné rady a konzultace
3
Obsah:
1. Úvod
1.1. Ateroskleroza věnčitých tepen a její komplikace
1.1.2. Stabilní ischemická choroba srdeční
1.1.3. Akutní koronární syndromy
1.2. Genové polymorfismy u vybraných genů
1.2.1. Endoteliální NO syntáza (eNOS)
1.2.2. Eotaxin
1.2.3. Matrix metaloproteináza 13
1.3. Laboratorní markery u ICHS
1.4. Literatura k úvodní části
2. Vlastní práce
2.1. Vztah polymorfismů eNOS 4a/b a -786T/C k ischemické chorobě srdeční,
obezitě a diabetes mellitus
2.1.1. Soubor a metodika
2.1.2. Výsledky
2.1.3. Diskuse
2.1.4. Literatura k práci Vztah polymorfismů eNOS 4a/b a -
786T/C ischemické chorobě srdeční, obezitě a diabetes mellitus
2.2. Souvislost rs640198 polymorfismu v genu pro matrix metaloproteinázu 13 a
závažnosti ICHS
2.2.1. Soubor a metodika
2.2.2. Výsledky
2.2.3. Diskuse
4
2.2.4. Literatura k práci Souvislost rs640198 polymorfismu v genu pro
matrix metaoproteinázu 13 a závažností ICHS
2.3. Vztah mezi třemi jednonukleotidovými polymorfismy v genu pro eotaxin (CCL
11), hexanukleotidovým opakujícím řetězcem a závažností ICHS
2.3.1. Soubor a metodika
2.3.2. Výsledky
2.3.3. Diskuse
2.3.4. Literatura k práci Vztah mezi třemi jednonukleotidovými
polymorfismy v genu pro eotaxin (CCL 11), hexanukleotidovým opakujícím
řetězcem a závažností ICHS
2.4. Laboratorní markery u pacientů s ICHS
2.4.1. Soubor a metodika
2.4.2. Výsledky
2.4.3. Diskuse
2.4.4. Literatura k práci Laboratorní markery u pacientů s ICHS
2.5 Vztah mezi dlouhodobými klinickými výsledky pacientů a eNOS −786 C/T, 4 a/b,
MMP-13 rs640198 G/T, Eotaxin 426 C/T, −384 A/G, and 67 G/A polymorfismy
2.5.1. Soubor a metodika
2.5.2. Výsledky
2.5.3. Diskuse
2.5.4. Literatura k práci Vztah mezi dlouhodobými klinickými výsledky
pacientů a eNOS −786 C/T, 4 a/b, MMP-13 rs640198 G/T, Eotaxin 426
C/T, −384 A/G, and 67 G/A polymorfismy
5
3. Shrnutí
4. Abstrakt
5. Originály publikovaných prací
.
6
1. ÚVOD
1.1. Ateroskleroza věnčitých tepen a její komplikace
Aterosklerotické postižení cévní stěny je příčinou řady chorob. V koronární lokalizaci
se ateroskleroza může manifestovat jako ischemická choroba srdeční (ICHS), a to
jak v podobě chronické (stabilní) tak i v akutních formách. Vznik a progrese
aterosklerozy jsou podmíněny mnoha příčinami, mezi základní patří hlavně
hyperlipoproteinemie, diabetes mellitus, hypertenze a kouření [1,2,3]. Z dalších
faktorů je nutné jmenovat renální insuficienci, která zejména v posledním stadiu, tedy
u pacientů v predialyzační fázi a u chronicky dialyzovaných představuje závažné
riziko progrese aterosklerozy [4,5]. Naproti tomu vliv počátečních stadií renální
nedostatečnosti, sérové hladiny kyseliny močové a různých genových polymorfismů
je stále předmětem výzkumu [6 - 9].
Ateroskleroza se vyvíjí v několika fázích, klasifikace American Heart
Association popisuje dělení aterosklerotických lézí na 6 typů. Prvním stadiem jsou
pěnové buňky (léze typu I), které jsou viditelné pouze mikroskopicky v intimě cév.
Dalším stadiem jsou tukové proužky, které už jsou patrné jako žlutavé tečky a
proužky na povrchu intimy. Tyto změny mohou být přítomny už od první dekády
života člověka. Od třetí dekády života se objevuje třetí stadium, které představují tzv.
intermediární léze a čtvrtý stupeň jsou ateromy – kde dochází k dalšímu hromadění
lipidů a formování lipidového jádra. Mezi lipidovým jádrem a endotelem se nachází
makrofágy a pěnové buňky, ojedinělé buňky hladké svaloviny a malé množství
kolagenu. Ve čtvrté dekádě se potom objevují léze typu V, které se podle množství
pojivové tkáně dělí na podtypy. Va (fibroaterom), který má lipidové jádro, Vb –
kalcifikovaná léze, Vc – dělí se na 2 skupiny: bez lipidového jádra, který bývá
příčinou významných koronárních stenoz a tzv. gelatinozní léze s obsahem
7
edematozní tekutiny a fibrinogenu. Poslední stadium, charakterizované typem VI, má
podtypy VIa – léze s rupturou, VIb – s hemoragií (krvácením/hematomem v plátu) a
VIc – kde jsou přítomny všechny předchozí komplikace [10,11]. Na rozvoji
aterosklerozy podílejí mechanismy genové, molekulární a buněčné, které představují
dlouhodobý soubor reakcí s primárně zánětlivým charakterem. V časných stadiích se
projevují zánětlivé mechanismy v kombinaci s usazováním lipidů ve stěně cévy, které
mohou být dále potencovány i dalšími lokálními a systémovými infekcemi. Přítomné
další rizikové faktory jako hypertenze, diabetes mellitus a samozřejmě
hyperlipoproteinemie dále podporují aktivitu aterosklerotického procesu. Zánětlivé
reakce mají i hlavní podíl na komplikacích aterosklerozy, tj. hlavně rozvoji akutních
koronárních syndromů.
1.1.2. Stabilní ischemická choroba srdeční
Časná manifestace onemocnění koronárních tepen se u většiny pacientů projevuje
jako endoteliální dysfunkce a mikrovaskulární postižení [12,13]. Endoteliální
dysfunkce je stav poškození funkce endotelu se zvýšenou permeabilitou cévní stěně
a nerovnováhou mezi vazodilatačními a vazokonstrikčními eventuálně
protrombogenními a antitrombogeními faktory [11]. Na dysfunkční endotel adherují
leukocyty a tato adheze je usnadněna zvýšenou expresí tzv. adhezivních molekul.
Tento děj nastává obzvláště v místech s narušeným laminárním prouděním krve a
zvýšeným smykovým napětím (např. bifurkace tepen). To má za následek snížení
produkce oxidu dusnatého (NO), který má protizánětlivé účinky. Leukocyty
(monocyty) migrují dále do intimy, akumulují oxidované LDL částice a mění se na
pěnové buňky. S narůstajícím zužováním lumen koronární tepny se přidávají projevy
ischemie myokardu jako kontraktilní dysfunkce myokardu, arytmie a angina pectoris.
8
1.1.3. Akutní koronární syndromy
Nejčastější příčinou akutních koronárních syndromů je snížení perfuze myokardu při
významné koronární ateroskleroze se současnou přítomností trombu. Tyto
komplikace vznikají nejčastěji na tzv. vulnerabilním aterosklerotickém plátu.
Vulnerabilní aterosklerotický plát je charakterizován hlavně svým složením –
obsahuje velké lipidové jádro pokryté tenkou fibrozní čepičkou a přítomností velkého
množství zánětlivých buněk (makrofágů a neutrofilů) [11]. Aktivované buňky
produkují některé enzymy, např. matrixmetalloproteinázu (MMP), což má za
následek oslabení fibrozní čepičky plátu a tedy větší sklon ke vzniku ruptury. Dalšími
změnami, které způsobují progresi nestability aterosklerotického plátu jsou
kalcifikace a krvácení do plátu.
1.2. Genové polymorfismy u vybraných genů
Genové polymorfismy jsou varianty sekvence deoxyribonukleové kyseliny (DNA),
které se nazývají alely. Místo v sekvenci DNA je polymorfní, pokud výskyt vzácnější
alely v populaci přesahuje 1%. Efekty genových polymorfismů mohou být pozitivní,
negativní nebo neutrální. Jednonukleotidové polymorfismy (SNP – single nucleotide
polymorphism) jsou substituce jedné nukleotidové báze v řetězci DNA s frekvencí
nad 1% v populaci. Jejich celkový počet se odhaduje na 10 milionů a jsou
považovány za jednu z příčin multifaktoriálních onemocnění (hypertenze,
ateroskleróza apod.) [14]. U těchto onemocnění dochází k současnému ovlivňujícímu
se působení mnoha relativně častých genových variant a interakcí z prostředí a
k postupnému rozvoji patologických stavů [11].
9
1.2.1. Endoteliální NO syntáza (eNOS)
Endoteliální NO syntáza je jednou ze tří izoforem tohoto enzymu, dalšími jsou
neuronální NOS a inducibilní NOS. Za normálních podmínek se eNOS podílí na
regulaci cévního tonu, proliferace buněk, adheze leukocytů a agregaci trombocytů
[15]. Z těchto účinků vyplývá protektivní vliv eNOS na kardiovaskulární systém. Je
známo několik hlavních SNP v genu pro eNOS, které mohou ovlivňovat aktivitu
enzymu a produkci NO. Jeden z nich, T-786C polymorfismus má thymin nahrazen
cytosinem v nukleotidu -786 v 5´ regionu eNOS genu [16]. Tato varianta genu
způsobuje redukci aktivity promotoru genu a byla popsána jako rizikový faktor pro
ICHS v japonské populaci [16]. Další polymorfismus – opakovací (repeat) 27 párů
bazí (bp) je lokalizován v intronu 4 eNOS genu - 4a4b polymorfismus, byla
publikována souvislost se změnami v plazmatických hladinách NO [17]. U tohoto
polymorfismu jsou publikované údaje o vztahu k ICHS rozporné [18, 19, 20].
1.2.2. Eotaxin
Eotaxin (CCL 11) je chemokin, který má atrakční vlastnost pro řadu krevních buněk,
popsán byl v 90. letech 20.století pro eozinofily [21,22] a později i pro neutrofily,
bazofily, makrofágy a prekurzory mastocytů [23, 24, 25]. Tato látka byla
identifikována jako jeden z mediátorů zánětu cévní stěny [25]. Gen pro eotaxin je
lokalizován na 17. chromozomu v regionu q21.1-q21.2 [26]. Byl zkoumán vliv
několika polymorfismů v genu pro eotaxin na rozvoj ICHS. První z nich se nachází
v prvním exonu genu, jedná se o 67G>A polymorfismus, vedoucí k nahrazení
aminokyselinu alaninu na pozici 23 threoninem. Další dva polymorfismy jsou
promotorové: −426C>T a −384A>G [27]. U 67G>A polymorfismu jsou popsané
10
výsledky ve vztahu k ICHS rozporné [28, 29, 30] a závisí na použitém modelu
dědičnosti. U promotorových polymorfismů není dostatek prací na toto téma, v naší
práci [31] jsme přímý vztah mezi výskytem a rozsahem ICHS a −426C>T a −384A>G
polymorfismy neprokázali. U polymorfismu 67 G>A byl nalezen signifikantně častější
výskyt varianty GG u pacientů s akutním koronárním syndromem.
1.2.3. Matrix metaloproteináza 13
Tato metaloproteináza (MMP-13) je jednou ze skupiny metaloproteináz, což jsou
enzymy schopné štěpit struktury kolagenu, a tím se podílet na rozvoji aterosklerozy,
ruptuře aterosklerotického plátu a vzniku aneuryzmat [32,33]. Exprese různých
podtypů MMP a jejich inhibitorů je rozdílná v závislosti na stupni aterosklerotické léze
[34]. Matrix metaloproteináza 13 je aktivní proti typu kolagenu typu I a III [35,36] a má
zásadní úlohu v přeměně kolagenu v organismu [36]. Hlavním producentem MMP-13
jsou makrofágy v intimě cév [34,37]. U aterosklerotických plátů byly nejvyšší hodnoty
MMP-13 a také MMP-1 zjištěny u fibrozních plaků což odpovídá vyššímu zastoupení
makrofágů [37]. Dalším zvažovaným účinkem MMP-13 je preventivní vliv na
aterosklerotický plát na základě štěpení molekuly ICAM-1 pomocí aktivity MMP-13
[38]. Tato molekula je spojena s rozvojem aterosklerozy a výskytem ICHS, gen pro
MMP-13 je lokalizován na chromozomu 11 (11 q22.2–q22.3) [33]. Exprese MMP-13
téměř neprobíhá v normální stěně arterií, ale je zvýšená v narůstajících
aterosklerotických lézích [34,37].
1.3. Laboratorní markery u ICHS
Byla popsána řada markerů vztahujících se k výskytu, závažnosti a klinickému
průběhu koronární aterosklerozy a ICHS. Vzhledem k tomu, že ateroskleroza je
11
považována za primárně zánětlivý proces, jsou publikované práce zaměřeny
zejména na přímé a nepřímé markery zánětu jako jsou hs-CRP, hladina leukocytů a
fibrinogen [39-41]. Z dalších parametrů můžeme potom uvést kyselinu močovou [42]
nebo kreatinin [43].
1.4. Literatura k úvodní části:
1) Nicholls SJ, Hsu A, Wolski K, Hu B, Bayturan O, Lavoie A, Uno K, Tuzcu EM,
NissenSE.Intravascular ultrasound-derived measures of coronary atherosclerotic
plaque burden and clinical outcome. J Am Coll Cardiol 2010;55:2399–2407.
2) Pekkanen J, Linn S, Heiss G, Suchindran CM, Leon A, Rifkind BM, Tyroler HA.
Ten-year mortality from cardiovascular disease in relation to cholesterol level among
men with and without preexisting cardiovascular disease. N Eng J Med
1990;322:1700–1707.
3) Bayturan O, Tuzcu EM, Uno K, Lavoie AJ, Hu T, Shreevatsa A, Wolski K,
SchoenhagenP,KapadiaS,NissenSE,NichollsSJ.Comparison of rates of progression
of coronary atherosclerosis in patients with diabetes mellitus versus those with the
metabolic syndrome. Am J Cardiol 2010;105:1735–1739.
4) Levin A. Clinical epidemiology of cardiovascular disease in chronic kidney disease
prior to dialysis. Semin Dial. 2003 Mar-Apr;16(2):101-5
5) Collins AJ. Cardiovascular mortality in end-stage renal disease. Am J Med Sci.
2003 Apr;325(4):163-7.
6) Schiffrin EL,Lipman ML,Mann JF.Chronic kidney disease:effects on the
cardiovascular system. Circulation 2007;116:85–97.
12
7) Matsushita K, Coresh J, Sang Y, Chalmers J, Fox C, Guallar E, Jafar T, Jassal
SK, Landman GW, Muntner P, Roderick P, Sairenchi T, Schottker B, Shankar A,
Shlipak M, Tonelli M, Townend J, van Zuilen A, Yamagishi K, Yamashita K,
Gansevoort R, Sarnak M, Warnock DG, Woodward M, Arnlov J, Consortium CKDP.
Estimated glomerular filtration rate and albuminuria for prediction of cardiovascular
outcomes: a collaborative meta-analysis of individual participant data. Lancet
Diabetes Endocrinol 2015;3:514–525.
8) G.Abraham, O.G.Bhalala, P.I.W.deBakker, S.Ripatti,and M. Inouye,“Towards a
molecular systems model of coronary artery disease,”Current Cardiology
Reports,vol.16,article 488,2014.
9) B. P. Prins, V. Lagou, F. W. Asselbergs, H. Snieder, and J. Fu, “Genetics of
coronary artery disease:genome-wide association studies and beyond,”
Atherosclerosis, vol. 225, no. 1, pp. 1–10, 2012.
10) Stary HC, Chandler AB, Dinsmore RE, et. al. A definition of advanced types of
atherosclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis: a report
from the Comittee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American
Heart Association. Circulation, 1995; 92:1355-1374
11) Aschermann M a kol., Kardiologie, Galén 2004
12) Kitta Y,Obata JE,Nakamura T,Hirano M,Kodama Y,Fujioka D,Saito Y,Kawabata
K, Sano K, Kobayashi T, Yano T, Nakamura K, Kugiyama K. Persistent impairment of
endothelial vasomotor function has a negative impact on outcome in patients with
coronaryartery disease. J Am Coll Cardiol 2009;53:323–330
13
13) Gulati M, Cooper-DeHoff RM, McClure C, Johnson BD, Shaw LJ, Handberg EM,
ZinehI,Kelsey SF,Arnsdorf MF,Black HR,Pepine CJ, Merz CN.Adverse
cardiovascular outcomes in women with nonobstructive coronary artery disease: a
report from the Women’s Ischemia Syndrome Evaluation Study and the St James
Women Take Heart Project. Arch Intern Med 2009;169843–850.
14) Collins FS, Guyer MS, Charkravarti A. Variations on a theme: cataloging human
DNA sequence variation. Science, 1997;278:1580-1581
15) Förstermann U, Münzel T. Endothelial nitric oxide synthase in vascular disease:
from marvel to menace. Circulation. 2006; 113 (13): 1708–14.
16) Nakayama T, Yasue H, Yoshimura M, Shimasaki Y, Kugiyama K, Ogawa H,
Motoyama T, Saito Y, Ogawa Y, Miyamoto Y, Nakao K. T-786C mutation in the 5´flanking
region of the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with
coronary spasm. Circulation 1999;99:2864-70
17) Wang XL, Mahaney MC, Sim AS, Wang J, Wang J, Blangero J, Almasy L,
Badenhop RB, Wilcken DEL. Genetic contribution of the endothelial constitutive nitric
oxide synthase gene to plasma nitric oxide levels. Arterioscler Thromb Vasc. Biol
1997;17:3147-53
18) Wang XL, Sim AS, Badenhop RF, McCredie RM, Wilcken DEL. A smokingdependent
risk of coronary artery disease associated with a polymorphism of the
endothelial nitric oxide synthase gene. Nat Med 1996;2:41-5
19) Gardemann A, Lohre J, Cayci S, Katz N, Tillmanns H, Haberbosch W. The T
allele of the missense Glu298Asp endothelial nitric oxide gene polymorphism is
14
associated with coronary heart disease in younger individuals with high
atherosclerosis risk profile. Atherosclerosis 2002;160:167-75
20) Hwang JJ, Tsai CT, Yeh HM, Chiang FT, Hsu KL, Tseng CD, Liau CS, Tseng YZ,
Lai LP. The 27-bp tandem repeat polymorhism in intron 4 of the endothelial nitric
oxide synthase gene is not associated with coronary artery disease in a hospitalbased
Taiwnanese population. Cardiology 2002;97:67-72
21) Griffiths-Johnson DA, Collins PD, Rossi AG, Jose PJ, Williams TJ The
chemokine, eotaxin, activates guinea-pig eosinophils in vitro and causes their
accumulation into the lung in vivo. Biochem Biophys Res Commun 1993;197:1167–
1172
22) Ponath PD, Qin S, Ringler DJ, Clark-Lewis I, Wang J, Kassam N, Smith H, Shi X,
Gonzalo JA, Newman W, Gutierrez-Ramos JC, Mackay CR Cloning of the human
eosinophil chemoattractant, eotaxin. Expression, receptor binding, and functional
properties suggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils. J Clin
Invest 1996;97:604–612
23) Yamada H,Hirai K,Miyamasu M,Iikura M,Misaki Y,Shoji S,Takaishi T, Kasahara
T, MoritaY,Ito K. Eotaxin is a potent chemotaxin for human basophils. Biochem
Biophys Res Commun 1997;231:365–368
24) Menzies-Gow A, Ying S, Sabroe I, Stubbs VL, Soler D, Williams TJ, Kay AB
(2002) Eotaxin (CCL11) and eotaxin-2 (CCL24) induce recruitment of eosinophils,
basophils, neutrophils, and macrophages as well as features of early- and late-phase
allergic reactions following cutaneous injection in human atopic and nonatopic
volunteers. J Immunol 169:2712–2718
15
25) Haley KJ, Lilly CM, Yang JH, Feng Y, Kennedy SP, Turi TG, Thompson JF,
Sukhova GH, Libby P, Lee RT. Over expression of eotaxin and the CCR3 receptor in
human atherosclerosis: using genomic technology to identify a potential novel
pathway of vascular inflammation. Circulation 2000;102:2185–2189
26) Garcia-Zepeda EA, Rothenberg ME, Weremowicz S, Sarafi MN, Morton CC,
Luster AD. Genomic organization, complete sequence, and chromosomal location of
the gene for human eotaxin (SCYA11), an eosinophil-specific CC chemokine.
Genomics 1997;41:471–476
27) Miyamasu M, Sekiya T, Ohta K, Ra C, Yoshie O, Yamamoto K, Tsuchiya N,
Tokunaga K, Hirai K. Variations in the human CC chemokine eotaxin gene. Genes
Immun 2001;2:461–463
28) Zee RY, Cook NR, Cheng S, Erlich HA, Lindpaintner K, Lee RT, Ridker PM.
Threonine for alanine substitution in the eotaxin (CCL11) gene and the risk of
incident myocardial infarction. Atherosclerosis 2004;175:91–94
29) Sheikine Y, Olsen B, Gharizadeh B, Jatta K, Tornvall P, Ghaderi M. Influence of
eotaxin 67G>A polymorphism on plasma eotaxin concentrations in myocardial
infarction survivors and healthy controls. Atherosclerosis 2006;189:458–463
30) Rosner SA, Ridker PM, Zee RY, Cook NR. Interaction between inflammationrelated
gene polymorphisms and cigarette smoking on the risk of myocardial
infarction in the Physician's Health Study. Hum Genet 2005;118:287–294
31) Máchal J, Vašků A, Kincl V, Hlavna M, Bartáková V, Jurajda M, Meluzín J.
Association between three single nucleotide polymorphisms in eotaxin (CCL 11)
16
gene, hexanucleotide repetition upstream, severity and course of coronary
atherosclerosis. J Appl Genet. 2012 Aug;53(3):271-8
32) H.H. Lu, Z.Q. Sheng, Y. Wang, L. Zhang, Levels of soluble adhesion molecules
in patients with various clinical presentations of coronary atherosclerosis. Chin Med J
(Engl) 123 (2010), 3123-3126
33) A.M. Pend´as, I. Santamar´ ıa, M.V. Alvarez, M. Pritchard, C. L´opez-Ot´ ın, Fine
physical mapping of the human matrix metalloproteinase genes clustered on
chromosome 11q22.3. Genomics 37 (1996), 266-268
34) Y. Yu, T. Koike, S. Kitajima, E. Liu, M. Morimoto, M. Shiomi, K. Hatakeyama, Y.
Asada, K.Y. Wang, Y. Sasaguri, T. Watanabe, J. Fan, Temporal and quantitative
analysis of expression of metalloproteinases (MMPs) and their endogenous inhibitors
in atherosclerotic lesions. Histol Histopathol 23 (2008), 1503-1516
35) R.Kato,Y.Momiyama,R.Ohmori,H.Taniguchi,H.Nakamura, F. Ohsuzu, Plasma
matrix metalloproteinase-8 concentrations are associated with the presence and
severity of coronary artery disease. Circ J 69 (2005), 1035-1040.
36) D. Mao, J.K. Lee, S.J. VanVickle, R.W. Thompson, Expression of collagenase-3
(MMP-13) in human abdominal aortic aneurysms and vascular smooth muscle cells
in culture. Biochem Biophys Res Commun 1999; (261), 904-910.
37) G.K. Sukhova, U. Sch¨onbeck, E. Rabkin, F.J. Schoen, A.R. Poole,
R.C.Billinghurst, P.Libby,Evidence forincreased collagenolysis by interstitial
collagenases-1 and -3 in vulnerable human atheromatous plaques. Circulation 1999;
(99) 2503-2509.
17
38) C. Tar´ ın, M. Gomez, E. Calvo, J.A. L´opez, C. Zaragoza, Endothelial nitric oxide
deficiency reduces MMP-13-mediated cleavage of ICAM-1 in vascular endothelium: a
role in atherosclerosis. Arterioscler Thromb VascBiol 29 (2009), 2732.
39) Taniguchi H, Momiyama Y, Ohmori R, Yonemura A, Yamashita T, Tamai S,
Nakamura H, Ohsuzu F. Associations of plasma C – reactive protein levels with the
presence and extent of coronary stenosis in patients with stable coronary artery
disease. Atherosclerosis 2005; 178:173–177
40) Sabatine MS, Morrow DA, Cannon CP, Murphy SA, Demopoulos LA, DiBattiste
PM, McCabe CH, Braunwald E, Gibson CM. Relationship between baseline white
blood cell count and degree of coronary artery disease and mortality in patients with
acute coronary syndromes: a TACTICS-TIMI 18 (Treat Angina with Aggrastat and
determine Cost of Therapy with an Invasive or Conservative strategy-Thrombolysis In
Myocardial Infarction 18 trial) substudy. J Am Coll Cardiol 2002; 40:1761–1768.
41) Danesh J, Collins R, Appleby P, Peto R. Association of fibrinogen, C-reactive
protein, albumin, or leukocyte count with coronary heart disease. JAMA 1998;
279:1477–1482.
42) Jelic-Ivanovic Z, Memon L, Spasojevic-Kalimanovska V, BogavacStanojevic N,
Spasic S. Independent association of high serum uric acid concentration with
angiographically defined coronary artery disease. Tohoku J Exp Med 2007;
211(4):369–77.
43) Cerne D, Kaplan-Pavlovic S, Kranjec I, Jurgens G. Mildly elevated serum
creatinine concentration correlates with the extent of coronary atherosclerosis. Renal
Failure 2000; 22(6):799–808.
18
2. Vlastní práce
2.1. Vztah polymorfismů eNOS 4a/b a -786T/C k ischemické chorobě srdeční,
obezitě a diabetes mellitus
Cílem práce bylo zjistit eventuální závislost různých variant eNOS 4a/b a -786T/C
polymorfismů k angiograficky prokázané ICHS a k dalším rizikovým faktorům, jako
jsou obezita a diabetes mellitus.
2.1.1. Soubor a metodika
V této studii bylo zahrnuto 1313 pacientů, kteří podstoupili koronarografické vyšetření
na I.interní kardioangiologické klinice FN U sv. Anny v Brně. U pacientů bylo dále
provedeno základní fyzikální vyšetření, anamnéza, EKG, odběry krevního obrazu a
základní biochemické vyšetření. Všichni pacienti podepsali informovaný souhlas se
zařazením do studie a s oběrem krevního vzorku na genetickou analýzu a studie byla
schválena ústavní etickou komisí. Pacienti se selháním jater, ledvin, těžkou anémií,
závažnými neurologickými nebo endokrinními onemocněními a malignitami byli
vyřazeni. Po koronarografickém vyšetření byli dále vyřazeni pacienti s nevýznamnou
aterosklerózou nebo spastickou anginou pectoris. Následný počet zařazených
pacientů byl 1161. Základní klinická charakteristika souboru pacientů je zachycena
v tab.1.
Koronarografie
Koronarografické vyšetření bylo provedeno standardní technikou, lékaři
specializovanými v invazivní a intervenční kardiologii. Stenotické léze byly
hodnoceny ve více projekcích k co nejpřesnější kvantifikaci. S ohledem na morfologii
koronárních tepen byli pacienti rozděleni do dvou skupin; 1) pacienti s významnou
19
koronární aterosklerózou, tj. alespoň jedna koronární tepna se stenóza ≥50%, 2)
pacienti s hladkostěnnými věnčitými tepnami.
Kardiovaskulární rizikové faktory
Rizikové faktory ICHS byly definovány následovně: hypercholesterolemie jako
probíhající léčba hypolipidemiky nebo hladina celkového cholesterolu nad 5,0mmol/l
při vyšetření, diabetes mellitus jako probíhající léčba inzulinem, perorálními
antidiabetiky nebo dietou nebo lačná glykemie nad 7,0mmol/l za hospitalizace,
hypertenze jako terapie antihypertenzivy, nebo opakovaná hodnota TK nad 140/90,
obezita jako body mass index (BMI) nad 30kg/m2
.
Genetická analýza
Deoxyribonukleová kyselina (DNA) byla extrahována z leukocytů v periferní krvi
s použitím proteinázy K, a vysrážena isopropanolem a chloroformem. Isolované
vzorky DNA byly testovány na polymorfismy eNOS 4a/b a -796T/C pomocí
polymerázové řetězové reakce (PCR). Tato byla provedena pro polymorfismus 4a/b
s použitím DNA primerů 5´- ACCTCAG-CCCAGTAGTG-3´sense, 5´GCAAGTGTCAGATAGGATT-3´
antisense a Taq polymerázy. Produkty PCR měly
573 párů bazí (bp) pro genotyp aa, 604 bp pro bb a 573+604 bp pro ab alely. Tyto
fragmenty byly rozděleny elektroforézou na agarozovém gelu s přídavkem ethidium
bromidu. Pro analýzu polymorfismu -796T/C byly použity primery 5´TGGAGAGTGCTGGTGTACCCCA-3´
sense, 5´-GCCTCCACCCCCACCCTGTC-3´
antisense a Taq polymeráza. Produkty PCR o velikosti 180bp byly inkubovány
s restrikční endonukleázou Msp I při 37 °C po dobu 5 hodin. Konečné fragmenty
měly 140+40 bp pro TT genotyp, 90+50+40 pro CC genotyp a 140+90+50+40 pro
TC alely a byly rozděleny elektroforézou na agarozovém gelu s ethidium bromidem.
20
Statistická analýza
Vztahy mezi genotypy a angiograficky potvrzenou ICHS a dalšími rizikovými faktory
byly určeny pomocí multivariantní analýzy (Wilksův test), významné závislosti mezi
genotypy nebo alelami a onemocněními byly hodnoceny pomocí χ2 a Fisher exact
testu, s použitím sofware Statistica (verze 8.0, StatSoft, Tulsa, USA).
Počet pacientů / muži 1161 / 813
Průměrný věk (roky) 64,2
ICHS/ hladkostěnné koronární tepny (n) 939 / 222
Hypertenze (n/%) 906 / 78%
Hyperlipoproteinemie (n/%) 712 / 61,3%
Diabetes mellitus (n/%) 348 / 30%
Obezita (n/%) 345 / 29,7%
Celkový cholesterol (průměr±SD) 4,53±1,1 mmol/l
Body mass index (průměr±SD) 28,7±4,2
Tabulka 1. Demografická a klinická charakteristika souboru
21
2.1.2. Výsledky
Distribuce genotypů v celém souboru byla následující: CC = 13 %, CT = 50 %, TT =
37 %; frekvence T alely 62.5 %, C alely 37.5 % pro -786T/C polymorfismus. Pro
intronový 4a/b polymorfismus byla distribuce: aa = 3.8 %, ab = 28.8 %, bb = 67.4 %.
Alelová frekvence byla 81.8 % pro b a 18.2 % pro a. Genotypy obou polymorfismů
byly v Hardyho-Weinbergově rovnováze.
Multivariantní analýza neprokázala žádnou významnou interakci mezi -786T/C
polymorfismem a samotnou ICHS nebo ICHS v kombinaci s diabetem,
hyperlipoproteinemií nebo obezitou. Pro 4a/b polymorfismus, nebyla prokázán vztah
mezi tímto polymorfismem a samostatnou ICHS (Tabulka 2) nebo ICHS v kombinaci
s obezitou (Tabulka 3). Naproti tomu byly nalezeny významné interakce mezi
genotypy a diabetes mellitus. Genotypy aa+ab byly téměř trojnásobně častější u
diabetiků bez ICHS proti nediabetickým pacientům bez ICHS - OR 2.79; 95% CI
1.27–6.07, P = 0,009, Pcorr = 0,03 (Tabulka 4).
Celková tabulka četností – 4 a/b polymorfismus a ICHS
ICHS 4a/b – ab 4a/b – bb 4a/b – aa Celkem
1 272 632 35 939
2 63 150 9 222
All 335 782 44 1161
Tabulka 2 - Vztah mezi 4a/b polymorfismem a ICHS, počty pacientů podle
genotypu; p pro genotypy = 0,964, p pro alely =0,987
ICHS 1 = ICHS ano ICHS 2 = ICHS ne
22
Souhrnná tabulka četností – 4 a/b polymorfismus a ICHS a obezita
Gr. ICHS Obezita
4a/b –
ab
4a/b –
bb
4a/b – aa Řádek celkem
1 1 1 83 190 6 279
2 1 2 189 442 29 660
Celkem 272 632 35 939
3 2 1 20 45 1 66
4 2 2 43 105 8 156
Celkem 63 150 9 222
Sloupec celkem 335 782 44 1161
Tabulka 3 - 4a/b polymorfismus a ICHS a obezita, počty pacientů podle genotypu –
neprokázán významný vztah
ICHS 1 = ICHS ano, ICHS 2 = ICHS ne, Obezita 1 = obézní , obezita 2 = neobézní
23
Souhrnná tabulka četností – 4 a/b polymorfismus a ICHS a diabetes mellitus
Gr. ICHS Diabetes 4a/b - ab 4a/b - bb 4a/b - aa Řada - celkem
1 1 1 92 215 11 318
2 1 2 180 417 24 621
Celkem 272 632 35 939
3* 2 1 15 14 1 30
4* 2 2 48 136 8 192
Celkem 63 150 9 222
Sloupec celkem 335 782 44 1161
Tabulka 4 - 4a/b polymorfismus a ICHS s diabetes mellitus, počty pacientů podle
genotypu
*Významné rozdíly mezi skupinami 3 a 4 pro ab+aa: 16/14 vs. 56/136, OR=2.79,
95% CI 1.27-6.07, P=0,009, Pcorr=0,03
ICHS 1 = ICHS ano, ICHS 2 = ICHS ne, Diabetes 1 = diabetici, Diabetes 2 = pacienti
bez diabetu
Byl rovněž nalezen vztah mezi 4a/b polymorfismem a ICHS v kombinaci s obezitou a
diabetem. Genotyp bb je signifikantně častější u pacientů s ICHS, obezitou a
diabetem ve srovnání s obézními diabetiky bez ICHS (OR=3.63, 95% CI 1.23-10.67,
Pcorr=0.05); a rovněž u ischemiků bez obesity a diabetu proti obézním diabetikům
bez ICHS (OR=3.38, 95% CI 1.21-9.46, Pcorr=0.05). Dále byl nalezen rozdíl u
pacientů bez ICHS, obesity a diabetu, proti obézním diabetikům bez ICHS (OR=3.59
(1.23-10.50), Pcorr=0.05) (Tabulka 5).
24
Souhrná tabulka četností – 4 a/b polymorfismus a ICHS s obezitou a diabetes
mellitus
Sk. ICHS Diabetes Obezita 4a/b - ab 4a/b - bb 4a/b - aa Řádek celkem
1 1 1 1 39 87 1 127
2 1 1 2 53 128 10 191
Celkem 92 215 11 318
3 1 2 1 44 103 5 152
4 1 2 2 136 314 19 469
Celkem 180 417 24 621
5 2 1 1 10 6 0 16
6 2 1 2 5 8 1 14
Celkem 15 14 1 30
7 2 2 1 10 39 1 50
8 2 2 2 38 97 7 142
Celkem 48 136 8 192
Sloupec celkem 335 782 44 1161
Tabulka 5 - 4a/b polymorfismus a ICHS s obesitou a diabetes mellitus, počty pacientů podle
genotypů
Významné rozdíly:
Skupina 1 vs 5 pro bb: 87/40 vs. 6/10, OR=3.63, 95% CI 1.23-10.67, Pcorr=0.05
Skupina 4 vs 5 pro bb: 314/155 vs. 6/10, OR=3.38, 95% CI 1.21-9.46, Pcorr=0.05
Skupina 5 vs 7 pro bb : 6/10 vs 39/11, OR =5.91 (1.76-19.88), Pcorr=0.01
Skupina 5 vs 8 pro bb : 6/10 vs. 97/45, OR=3.59 (1.23-10.50), Pcorr=0.05
ICHS 1 = ICHS ano, ICHS 2 = ICHS ne, Diabetes 1 = diabetici, Diabetes 2 = nediabetici, obezita 1 =
obézní, obezita 2 = neobézní pacienti
25
2.1.3. Diskuse
Vztah mezi T-786C polymorfismem a ICHS byl zkoumán v mnoha pracích, ale
výsledky jsou stále rozporné [1-4]. Autoři Fatini a kol. [1] zjistili, že genotyp 4a/a je
nezávislý predisponující faktor k akutním koronárním syndromům (ACS) (OR 2,5,
95% CI 1,1-5,4, p=0,02), ale nebyla nalezena žádná spojitost u polymorfismů eNOS -
786CC and 894TT, pouze přítomnost genotypu -786CC zesilovala predispozici k
ACS u 4a/a homozygotů.
Metanalýza 26 studií zahrnujícící 23028 subjektů [2] , ukázala významně vyšší riziko
ICHS u 4a/a homozygotů, avšak ne u homozygotních nosičů -786C alely. Další
práce [4] zjistila více kardiovaskulárních úmrtí u -786TT než u -786 TC + CC nosičů
ve follow-up studii na více než tisícovce pacientů. Autoři předpokládají, že tato
genetická varianta je spojena vyšší aktivitou NO, což znamená zvýšenou produkci
reaktivních forem kyslíku a dusíku. To vede k aktivaci matrix metalloproteináz a
následné predispozici k ruptuře aterosklerotického plátu. V naší studii, multivariantní
analýza neprokázala významnou spojitost mezi -786T/C polymorfismem a samotnou
ICHS, nebo ICHS v kombinaci s obezitou a diabetes mellitus.
Vliv intronového polymorfismu 4a/b na plasmatické hladiny NO zkoumalo několik
prací [5,6], jejich výsledky však nebyly potvrzeny dalšími studiemi [7,8]. Tento
polymorfismus je lokalizován v intronu genu, a je tedy nepravděpodobné, že by
ovlivňoval strukturu proteinu, ale může hrát roli jako marker vazebné nerovnováhy
s jinými variantami eNOS genu [8,9].
Alvarez a kol. [10] popsali, že CC varianta polymorfismu T-786C zvyšuje riziko časné
ICHS u kanadské populace, ale 4a/b polymorfismu nikoliv. Naproti tomu, další autoři
[1] popsali, že náchylnost ke vzniku ICHS je specificky podpořena kombinací
genotypů 4a/a a 786CC.
26
Vztah mezi intronovým polymorfismem 4a/b a diabetes mellitus byl popsán
Galanakisem a kol.[11], autoři nalezli významnou závislost mezi přítomností a alely a
diabetem, bez ohledu na to jestli jde o diabetes 1. nebo 2. typu. Tyto výsledky jsou
v souladu s našimi, kde jsme potvrdili vyšší zastoupení aa a ab genotypu u pacientů
s diabetes mellitus bez ICHS ve srovnání s pacienty bez ICHS a bez diabetu. Vztah
mezi eNOS genem a diabetem stále není přesně objasněn. Laboratorní studie
s microarray prokázaly, že u inzulin produkujících buněk stimulovaných cytokiny je
asi 50% genů ovlivněných cytokiny NO – dependentních [12].
Interakce mezi 4a/b polymorfismem a obezitou rovněž nebyla příliš zkoumána,
Hofmann a kol. [13] neprokázali významný vztah mezi obezitou nebo zvýšenou
lačnou glykemií, krevním tlakem a 4a/b nebo Glu298Asp polymorfismem. Tento
nález je rovněž ve shodě s našimi výsledky, kdy obezita ani u pacientů s ICHS ani u
kontrol nekorelovala s 4a/b polymorfismem. Limitací naší práce byla selektovaná
populace, jednalo se o pacienty přijaté k provedení koronarografie, a další limitací byl
menší počet pacientů v některých podskupinách.
Závěrem lze konstatovat, že v naší studii jsme nalezli významnou závislost mezi 4a/b
polymorfismem a diabetes mellitus u pacientů bez ICHS, a dále mezi 4a/b
polymorfismem a ICHS v kombinaci s diabetem a obezitou. Nebyla nalezena
významná závislost mezi tímto polymorfismem a samotnou ICHS.
27
2.1.4. Literatura k práci Vztah polymorfismů eNOS 4a/b a -786T/C k ischemické
chorobě srdeční, obezitě a diabetes mellitus
1) Fatini C, Sofi F, Sticchi E, Gensini F, Gori AM, Fedi S, Lapini I, Rostagno C,
Comeglio M, Brogi D, Gensini G, Abbate R, Influence of endothelial nitric oxide
synthase gene polymorphisms (G894T, 4a4b, T-786C) and hyperhomocysteinemia
on the predisposition to acute coronary syndromes Am Heart J 2004;147:516-21
2) Casas JP, Bautista LE, Humpries SE, Hingorani AD. Endothelial nitric oxide
synthase genotype and ischemic heart disease. Circulation 2004;109:1359-1365
3) Colombo MG, Paradossi U, Andreassi MG, Botto N, Manfredi S, Masetti S, Biagini
A, Clerico A. Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and risk of
coronary artery disease. Clin Chem 2003;49 (3): 389-395
4) Rossi GP, Maiolino G, Zanchetta M, Sticchi D, Pedon L, Cesari M, Montemurro D,
De Toni R, Zavattiero S, Pessina AC. The T-786C endothelial nitric oxide synthase
genotype predicts cardiovascular mortality in high risk patients. J Am Coll Cardiol
2006;48:1166-1174
5) Tsukada T, Yokoyama K, Arai T, Takemoto F, Hara S, Yamada A, Kawaguchi Y,
Hosoya T, Igari J.. Evidence of association of the eNOS gene polymorphism with
plasma NO metabolite levels in humans. Biochem Biophys Res Comun.
1998;245:190-193
6) Wang XL, Sim AS, Wang MX, Murrell GAC, Trudinger B, Wang J. Genotype
dependent and cigarette specific effects on endothelial nitric oxide synthase gene
expression and enzyme activity. FEBS Lett. 2000;471:45-50
28
7) Yoon Y, Song J, Hong SH, Kim JQ. Plasma nitric oxide concentrations and nitric
oxide synthase gene polymorphisms in coronary artery disease. Clin Chem.
2000;46:1626-1630
8) Jeerooburkhan N, Jones LC, Bujac S, Cooper JA, Miller GJ, Vallance P,
Humphries SE, Hingorani AD. Genetic and environmental determinants of plasma
nitrogen oxides and risk of ischemic heart disease. Hypertension. 2001;38:1054-
1061
9) Yoshimura M, Yasue H, Nakayama M, Shimasaki Y, Ogawa H, Kugiyama K, Saito
Y, Miyamoto Y, Ogawa Y, Kaneshige T, Hiramatsu H, Yoshioka T, Kamitani S,
Teraoka H, Nakao K. Genetic risk factors for coronary artery spasm: signigicance of
endothelial nitric oxide synthase gene T-786C and missense Glu298Asp variants. J
Investig Med 2000;48:367-74
10) Alvarez R, Gonzales P, Batala A, Reguero JR, Iglesias-Cubero G, Hevia S,
Cortina A, Merino E, Gonzalez I, Alvarez V, Coto E. Association between the NOS3
(-786T/C) and the ACE (I/D) DNA genotypes and early coronary artery disease. Nitric
oxide 2001;5:343-8
11) Galanakis E, Kofteridis D, Stratigi K, Petraki E, Vazgiourakis V, Fragouli E,
Mamoulakis D, Boumpas DT, Goulielmos GN. Intron 4 a/b polymorphism of the
endothelial nitric oxide synthase gene is associated with both type 1 and type 2
diabetes in a genetically homogeneous population. Human Immunol 2008;69 (4-
5):279-283
12) Kutlu B, Cardozo AK, Darville MI, Kruhoffer M, Magnusson N, Orntoft T, Eizirik
DL., Discovery of gene networks regulating cytokine-induced dysfunction and
apoptosis in insulin-producing INS-1 cells, Diabetes 52 (2003), p. 2701-2719
29
13) Hoffmann IS, Tavares-Mordwinkin R, Castejon AM, Alfieri AB and Cubeddu LX.
Endothelial nitric oxide synthase polymorphism, nitric oxide production, salt sensitivity
and cardiovascular risk factors in Hispanic. J Human Hypertension (2005) 19, 233–
240.
30
2.2. Souvislost rs640198 polymorfismu v genu pro matrix metaloproteinázu
13 a závažnosti ICHS
Cílem práce bylo zjistit vztah rs640198 polymorfismu k rozvoji ICHS a její závažnosti
2.2.1 Soubor a metodika
Studie zahrnula 1071 pacientů se suspektní nebo známou ICHS, přijatých na I.
Interní kardioangiologickou kliniku FN U sv. Anny k provedení koronarografie. Během
krátkodobé hospitalizace pacienti podstoupili vyšetření a odběry jak popisováno
v předchozí práci (viz výše). Byly definovány 2 skupiny pacientů podle nálezu na
koronárních tepnách: 1) pacienti s významnou ICHS (tj. alespoň jedna koronární
tepna se stenózou nad 50 %) 2) pacienti s nesignifikantní aterosklerózou – tj.
stenózami do 50% a pacienti s hladkostěnnými koronárními tepnami. Dále byl
stanoven celkový počet významných koronárních stenoz bez ohledu na počet
postižených tepen. Dále bylo do analýzy zahrnuto 203 dobrovolníků bez anamnezy či
rizikových faktorů ICHS z ordinace praktických lékařů.
Analýza MMP-13 polymorfismu (rs640198)
Krevní vzorky získané pro analýzu polymorfismu byly uchovávány při -18°C.
Z leukocytů periferní krve byla získána DNA pomocí proteinázy K a vysrážena
isopropanolem a chloroformem. Byla hodnocen polymorfismus rs640198, T/G na
pozici 6373 v genu pro MMP-13. Genotypizace polymorfismu rs640198 byla
provedena pomocí 5´ exonukleázy (Taqman®) na přístroji ABI Prism® 7000 (Applied
Biosystems, USA). Všechny analýzy byly verifikovány pomocí přímého sekvenování
s použitím Big Dye v 1.1 přípravků (Applied Biosystems).
31
Analýza plazmatických hladin MMP-13
Plazmatické koncentrace MMP-13 byly stanoveny metodou ELISA u 20 zdravých
dobrovolníků.
Statistická analýza
Spojité veličiny jsou prezentovány jako medián a rozsah, kategorické veličiny jako
počty (procenta). Pro analýzu rozdílu mezi skupinami byly použity neparametrické
testy (Mann-Whitney U-test, Kruskal-Wallis ANOVA test nebo Fisherův exaktní test).
Distribuce genotypů a alelických četností a jejich rozdílů byla vypočítáná pomocí χsquare
testu. Bonferroniho korekce (Pcorr) byla použita pro mnohočetná srovnání,
pokud to bylo nezbytné. Lineární regresní model byl použit k vytvoření
multivariantního modelu vztahů mezi MMP-13 genotypy (GG+GT vs TT), věkem,
pohlavím, hladinou HDL cholesterolu, CRP a terapií statiny. Pro analýzy byl použit
softwarový balík Statistica verze 9. Hodnota p< 0,05 byla považována za
významnou.
2.2.2. Výsledky
Základní popis souboru pacientů podle zkoumaného genotypu je v Tabulce 1, byly
shledány hraničně významné rozdíly v MMP-13 polymorfismu mezi pacienty s ICHS
a zdravými kontrolami (Pg = 0,06, Pa = 0,04, Tabulka 1) .
32
MMP-13 GG
(N = 521)
MMP-13 GT
(N = 459)
MMP-13 TT
(N = 91)
P-hodnota
Věk (medián,
rozsah)
41 (12–94) 41 (18–104) 40 (18–61) 0.582
Pohlaví (M/Ž,
% mužů)
360 (69%) 309 (67%) 65 (71%) Pg = 0.689
Pa = 0.975
Hyperlipidemie 325 (62%) 270 (59%) 57 (63%) Pg = 0.490
Pa = 0.547
Hypertenze 418 (80%) 357 (78%) 75 (82%) Pg = 0.481
Pa = 0.840
Diabetes
mellitus
154 (30%) 143 (31%) 30 (33%) Pg = 0.752
Pa = 0.455
Obezita 172 (33%) 123 (27%) 31 (34%) Pg = 0.08
Pa = 0.230
Kouření 66 (13%) 65 (14%) 19 (21%) Pg = 0.113
Pa = 0.07
Rodinná anamnéza
ICHS nebo CMP
(do 60 let)
98
(N = 420, 23%)
68
(N = 373, 18%)
14
(N = 75, 19%)
Pg = 0.188
Pa = 0.108
ICHS 398 (76%) 368 (80%) 79 (87%) Pa = 0.02
Pg = 0.06
Tabulka 1. Popisná statistika hlavních parametrů souboru. ICHS = ischemická
choroba srdeční, CMP = cévní mozková příhoda, Pg-pravděpodobnost rozdílu mezi
genotypy, Pa- pravděpodobnost rozdílu mezi alelami
33
Počet postižených
tepen
MMP-13-TT MMP-13-TG MMP-13-GG Četnost alel
T/G
Pg Pa Pg-corr Pa-corr
ICHS1 (N=252) 24 (10%) 101 (40%) 127 (50%) 0,296/0,704 0,104 0,125
ICHS2 (N=252) 20 (8%) 108 (43%) 124 (49%) 0,294/0,706 0,199 0,139
ICHS3(N=272) 29 (11%) 127 (46%) 116 (43%) 0,340/0,660 0,01 0,006 0,05 0,03
ICHS4 (N=69) 6 (9%) 32 (46%) 31 (45%) 0,319/0,681 0,176 0,104
Non-ICHS5 (N=106) 8 (8%) 41 (39%) 57 (53%) 0,269/0,731 0,364 0,508
Non-ICHS6 (N=120) 4 (3%) 50 (42%) 66 (55%) 0,248/0,758
Všechny skupiny
(N=1071)
91 (8%) 459 (43%) 521 (49%) 0,300/0,700
Zdravé kontroly
(N=203)
21 (10%) 79 (39%) 103 (51%) 0,298/0,702 0,07 0,122
Tabulka 2 – počty postižených tepen a MMP-13 genotypy
ICHS1-postižení 1 koronární tepny, ICHS2-postižení 2 tepen, ICHS3-postižení 3 tepen, ICHS4-postižení kmene levé věnčité tepny,
Non-ICHS5-ateroskleroza věnčitých tepen bez významné stenozy, Non-ICHS6-hladkostěnné věnčité tepny, Pg-pravděpodobnost
rozdílu mezi genotypy, Pa- pravděpodobnost rozdílu mezi alelami, Pgcorr, Pacorr- P hodnoty korigované pro vícečetná srovnání
34
Počet význ.
stenoz
MMP-13-TT MMP-13-TG MMP-13-GG Frekvence
alel T/G
Pg Pa Pg-corr Pa-corr
≥5(N = 163) 14 (9%) 86 (53%) 63 (38%) 0.350/ 0.750 0.008 0.004 0.04 0.02
4(N = 123) 10 (8%) 54 (44%) 59 (48%) 0.301/ 0.699 0.308 0.188
3(N = 187) 22 (12%) 67 (36%) 98 (52%) 0.297/ 0.703 0.06 0.174
2(N = 167) 12 (7%) 76 (46%) 79 (47%) 0.299/ 0.701 0.346 0.162
1(N = 205) 21 (10%) 85 (42%) 99 (48%) 0.310/ 0.690 0.120 0.07
0(N = 226) 12 (5%) 91 (40%) 123 (54%) 0.254/ 0.746
Všechny
skupiny (N =
1071)
91 (8%) 459 (43%) 521 (49%) 0.300/ 0.700
Tabulka 3. Počet významných stenóz a MMP-13 genotypy
Pg-pravděpodobnost rozdílu mezi genotypy, Pa- pravděpodobnost rozdílu mezi alelami
35
OR ( 95% CI) P - hodnota
Nosičství T- alely (TT
nebo TG)
1,34 (0,76-2,38) 0,31
Pohlaví (ženy vs muži) 0.19 (0.10–0.37) < 0.001
Věk 1.06 (1.04–1.09) < 0.001
HDL 0.26 (0.12–0.56) < 0.001
CRP 1.03 (1–1.06) 0.006
Tabulka 4. Multivariantní logistická regresní analýza pro interakce mezi MMP-13
genotypy a rozvojem ICHS, s úpravou na další faktory (HDL – high density
lipoprotein, CRP – C reaktivní protein)
Když byla provedena další stratifikace rizika ICHS skupiny podle počtu postižených
tepen, byly nalezeny významné rozdíly v distribuci genotypu MMP-13 stejně jako
v alelických frekvencích mezi pacienty s postižením 3 koronárních tepen (ICHS3) a
skupinou s hladkostěnnými koronárními tepnami (Non-ICHS6); Pgcorr = 0.05, Pacorr
= 0.03, Tabulka 2. V kodominantním modelu dědičnosti byly genotypy TT a TG
spojeny s významně vyšším rizikem postižení 3 tepen ve srovnání s pacienty bez
aterosklerotických lézí (odds ratio 1,64, 95% CI 1,07-2,53; Pcorr = 0.05, senzitivita
0.57, specificita 0.55). Nebyly pozorovány významné rozdíly mezi zdravými osobami
a osobami bez postižení koronárních tepen (Tabulka 2).
Pokud byl dán do souvislosti celkový počet stenoz koronárních tepen a MMP-13
polymorfismu, byla nalezen významný vztah mezi distribucí genotypů a četností alel
mezi pacienty s 5 a více stenózami ve srovnání s pacienty bez aterosklerotického
36
postižení (Pg corr = 0,04, Pa corr = 0,02, Tabulka 3). Zvýšené riziko přítomnosti 5 a
více stenoz (odds ratio = 1,90, 95% CI 1,26–2,86, P corr = 0,004) bylo pozorováno u
TT a TG nosičů. Tento marker má senzitivitu 0,61 a specificitu 0,54. Pokud byl použit
lineární regresní model k vytvoření multivariantního modelu vztahů mezi MMP-13
genotypy (GG+GT vs TT), věkem, pohlavím, hladinou HDL cholesterolu, CRP a
statinovou terapií, genotyp MMP-13 nebyl potvrzen jako významný prediktor ICHS
(Tabulka 4).
Dále byl analyzován vztah mezi cévními abnormalitami a MMP-13 genotypem v naší
skupině pacientů. Přestože aneuryzma aorty se vyskytovalo pouze u 7 pacientů
(0,7%), byla v této malé skupině zjištěna vyšší frekvence T alely (Pa = 0,03).
Plazmatické hladiny MMP-13 byly analyzovány u zdravých jedinců bez ICHS, byly
naměřeny jen nízké hladiny MMP-13 (0.021 ± 0.01 ng/mL). V této skupině nebyly
nalezeny žádné významné rozdíly mezi MMP-13 genotypy (P =0.571).
2.2.3. Diskuze
V jedné z předchozích prací byly popsány dva haplotypy v promotoru genu pro MMP-
2, které byly signifikantně více nebo méně časté u pacientů s onemocněním 3
koronárních tepen ve srovnání s osobami bez ICHS [1]. V současné studii byl
rs640198 (intronový) polymorfismus v MMP-13 genu spojený s postižením 3
koronárních tepen a také s přítomností 5 a více stenoz v koronárním řečišti. Můžeme
zde zvažovat funkční souvislosti mezi MMP-2 a MMP-13, protože MMP-2 je schopna
aktivovat MMP-13 z proMMP-13 a působit vzájmeně pomocí svých proteolytických
aktivit na extracelulární matrix [2]. Už dříve bylo popsáno, že remodelace cévní stěny
během aterosklerotického procesu (kolagen-elastin) je určena poměrem celková
MMP/TIMP. Tato souvislost byla potvrzena pokusem na potkanech [3]. Na základě
této práce lze konstatovat, že nejen exprese MMP nebo hladiny MMP a jejich
37
inhibitorů v krvi, ale také charakteristiky krevního toku ovlivňují proces remodelace a
progresi aterosklerozy [3]. Dalším aspektem důležitosti MMP-13 je prenatální role
v průběhu organogeneze kardiovaskulárního systému [4]. Matrix metalloproteináza -
13 (RNA i protein) byla výrazně potlačena během druhého a třetího trimestru
těhotenství, v porovnání s množstvím metaloproteináz jako celku, které jsou
vytvářeny v decidua a trofoblastu [4]. To by mohlo znamenat, že MMP-13 účinkuje
především v časných fázích vývoje kardiovaskulárního systému [4]. Předpokládaná
snížená funkce T alely v rs640198 MMP-13 polymorfismu je spojená se ztrátou
lokusu transkripčního faktoru Pbx-1 a může mít vztah ke snížené expresi MMP-13
během časných fází vývoje srdce a kardiovaskulárního systému [5]. Podle této
hypotézy a na základě zde prezentovaných výsledků je otázkou, zda je možný vztah
mezi ICHS a vrozenými abnormalitami kardiovaskulárního systému, i když s nízkou
klinickou významností. Při použití multidetektorové výpočetní tomografie jako
screeningu ICHS u velkého souboru pacientů (N=4 543) byly nalezeny
neaterosklerotická postižení kardiovaskulárního systému u 200 pacientů (4,4%) [6].
Nejčastějčí koronární anomálie byly: vrozené variety koronárních tepen (38%, odstup
pravé koronární tepny z levého koronárního sinu), aneuryzma ascendentní aorty ≥
40mm (22%), hypertrofická kardiomyopatie s apikálním zesílením myokardu (14%),
chlopenní vady (8%), vrozené srdeční vady, jako defekt síňového septa (6%), a dále
non-kompaktní kardiomyopatie LK, myxom levé síně či aneuryzma hrotu LK (po 2%).
V naší studii byla frekvence T alely častější u pacientů s anamnézou plicní embolie a
aneuryzmatu aorty. Tento nález je v souladu se současnými poznatky, že
polymorfismy v genech pro MMP-2, MMP-3, MMP-13 a ELN se můžou nezávisle
podílet na patogenezi aneuryzmatu abdominální aorty [7,8]. Strukturální změny v žilní
stěny současně se zvýšenou expresí MMP-2, MMP-9 a MMP-13 u žilní dilatace a
38
trombembolické choroby mohou svědčit pro možnou roli těchto metaloproteináz
v patogenezi těchto stavů [9].
U jiných polymorfismů v dalších genech pro MMP, zvláště MMP-3 a MMP-9, byl už
dříve popsán jejich vztah ke vzniku koronární aterosklerozy a/nebo k její progresi,
ke vzniku restenozy po koronárních intervencích a k rozvoji nestability
aterosklerotických plátů vedoucí k infarktu myokardu [10-13]. Určité genotypy MMP-
1, MMP-3 a MMP-9 s nižší transkripční aktivitou byly rovněž spojeny s vyšším
výskytem selhání arteriovenozních shuntů u hemodialyzovaných pacientů, což může
být způsobeno větším nahromaděním extracelulární matrix vedoucím ke stenoze
shuntu [14]. O souvislosti MMP-13 a ICHS u lidí bylo dosud známo velmi málo.
Exprese MMP-2 i MMP-13 byla popsána rozdílná v aortě, karotidách, femorální tepně
a dolní duté žíle na zvířecím modelu [3], což zřejmě snižuje prediktivní hodnotu
hladiny MMP-13 v krvi. V další publikované práci byla hladina MMP-8 spojena
s výskytem ICHS [15]. Později byla publikována komplexní analýza komponent
extracelulární matrix včetně cévního proteomu [16]. Proteomické metody umožnily
identifikaci proteinů přítomných v extracelulárním prostoru, nových glykoproteinů a
objasnění řízení proteolytické aktivity ve tkáních interakcí proteolytických enzymů a
degradačních produktů. To může teoreticky být podkladem pro nové terapeutické
přístupy v léčbě kardiovaskulárních nemocí [16].
Závěrem lze konstatovat, že nosičství T alely v rs640198 polymorfismu genu pro
MMP-13 bylo v této studii spojeno se závažností ICHS vyjádřenou počtem
postižených koronárních tepen stejně jako celkovým počtem stenoz v koronárním
řečišti. Je však potřeba dalšího výzkumu role MMP-13 v patogenezi abnormalit
kardiovaskulárního systému a aterosklerotického postižení.
39
2.2.4. Literatura k práci: Souvislost rs640198 polymorfismu v genu pro matrix
metaloproteinázu 13 a závažnosti ICHS
1) A. Vasku, M. Goldbergová, L. Izakovicová Hollá, L.Sisková, L. Groch, M. Beránek,
S. Tschöplova, V. Znojil, J. Vácha, A haplotype constituted of four MMP-2 promoter
polymorphisms (-1575G/A, -1306C/T, -790T/G and -735C/T) is associated with
coronary triple-vessel disease, Matrix Biol 22 (2004), 585-591.
2) J.L.Beaudeux, P.Giral,E.Bruckert,M.J.Foglietti, M.J.Chapman, [Matrix
metalloproteinases and atherosclerosis. Therapeutic aspects]. Ann Biol Clin (Paris)
61 (2003), 147-58.
3) P. Basu, U. Sen, N. Tyagi, S.C. Tyagi, Blood flow interplays with elastin: collagen
and MMP: TIMP ratios to maintain healthy vascular structure and function. Vasc
Health Risk Manag 6 (2010), 215-28.
4) Anacker J, Segerer SE, Hagemann C, Feix S, Kapp M, Bausch R, Kämmerer U.
Human decidua and invasive trophoblasts are rich sources of nearly all human matrix
metalloproteinases. Mol Hum Reprod. 2011 Oct;17(10):637-52.
5) C.P. Chang, K. Stankunas, C. Shang, S.C. Kao, K.Y. Twu, M.L.Cleary,
Pbx1functions indistinct regulatory networks to pattern the great arteries and cardiac
outflow tract. Development 135 (2008), 3577-3586.
6) T. Knickelbine, J.R. Lesser, T.S. Haas, E.R. Brandenburg, B.K.Gleason-Han, B.
Flygenring, T.F.Longe, R.S. Schwartz, B.J. Maron, Identification of unexpected
nonatherosclerotic cardiovascular disease with coronary CT angiography. JACC
Cardiovasc Imaging 2 (2009), 1085-1092.
40
7) K.D. Rizas, N. Ippagunta, M.D. 3rd Tilson, Immune cells and molecular mediators
in the pathogenesis of the abdominal aortic aneurysm. Cardiol Rev 17 (2009), 201-
210.
8) C. Saracini, P. Bolli, E.Sticchi, G. Pratesi, R. Pulli, F. Sofi, C. Pratesi, G.F. Gensini,
R. Abbate, B. Giusti, Polymorphisms of genes involved in extracellular matrix
remodeling and abdominal aortic aneurysm. J Vasc Surg 55 (2012), 171-179.
9) C. Irwin, A. Synn, i. Kraiss, O. Zhang, M.M. Griffen, G.C. Hunter,
Metalloproteinase expression in venous aneurysms. J Vasc Surg 48 (2008), 1278-
1285.
10) M.P. de Maat, J.W. Jukema, S. Ye, A.H. Zwinderman, P.H. Moghaddam, M.
Beekman, J.J. Kastelein, A.J. van Boven, A.V. Bruschke, S.E. Humphries, C. Kluft,
A.M. Henney, Effect of the stromelysin-1 promoter on efficacy of pravastatin in
coronary atherosclerosis and restenosis. Am J Cardiol 83 (1999), 852-856.
11) S. Fallah, M. Seifi, A. Ghasemi, M. Firoozrai, A. Samadikuchaksaraei,
Matrixmetalloproteinase-9 and paraoxonase 1Q/R192 gene polymorphisms and the
risk of coronary artery stenosis in Iranian subjects. J Clin Lab Anal 24 (2010),
305310.
12) M. Seifi, S. Fallah, M. Firoozrai, Influence of genetic polymorphism in
matrixmetalloproteinase-3 on extent of coronary atherosclerosis and risk of coronary
artery stenosis. ArchMed Res 40 (2009), 600-604.
13) B. Zhang, S. Ye, S.M. Herrmann, P. Eriksson, M. de Maat, A. Evans, D. Arveiler,
G. Luc, F. Cambien, A. Hamsten, H. Watkins, A.M. Henney, Functional
41
polymorphism in the regulatory region of gelatinase B gene in relation to severity of
coronary atherosclerosis. Circulation 99 (1999), 1788-1794.
14) C.C. Lin, W.C. Yang, M.Y. Chung, P.C. Lee, Functional polymorphisms in
matrixmetalloproteinases-1, -3,-9 are associated with arteriovenous fistula patency in
hemodialysis patients. Clin J Am Soc Nephrol 5 (2010), 1805-1814.
15) R.Kato,Y.Momiyama,R.Ohmori,H.Taniguchi,H.Nakamura, F. Ohsuzu, Plasma
matrix metalloproteinase-8 concentrations are associated with the presence and
severity of coronary artery disease. Circ J 69 (2005), 1035-1040.
16) A.Didangelos, X.Yin, K.Mandal, M.Baumert, M.Jahangiri, M. Mayr, Proteomics
characterization of extracellular space components in the human aorta,
MolCellProteomics 9(2010), 2048-2062.
42
2.3. Vztah mezi třemi jednonukleotidovými polymorfismy v genu pro eotaxin
(CCL 11), hexanukleotidovým opakujícím řetězcem a závažností ICHS
Cílem práce bylo zjistit závislost mezi 3 jednonukleotidovými polymorfismy
(promotorovými −426C>T a 384A>G, v prvním exonu 67G>A), hexanukleotidovým
řetězcem (GAAGGA)n 10.9 kb a rozvojem koronární aterosklerozy
2.3.1 Soubor a metodika
Bylo zahrnuto 1050 pacientů z I.interní kardioangiologické kliniky FN U sv. Anny
v Brně přijatých k provedení koronarografie. Ischemická choroba srdeční byla
definována jako alespoň jedna stenóza koronární tepny ≥50% v jakémkoliv
segmentu. Skupiny s postižením 1, 2 nebo 3 koronárních tepen byly definovány jako
postižení hlavních segmentů ramus interventricularis anterior, ramus circumflexus
nebo pravé koronární tepny se stenózou ≥50%. Pacienti s hladkostěnnými tepnami
byli použiti jako kontrolní skupina, pacienti se stenózou do 50% byli vyřazeni, stejně
jako pacienti s vazospastickou anginou a po srdeční transplantaci. Pacienti
s bronchiálním astmatem byli rovněž vyřazeni pro možný vliv eotaxinových
polymorfismů na toto onemocnění. Ve zbylé skupině 933 pacientů mělo 760
angiograficky prokázanou ICHS a 172 bylo zařazeno jako kontroly s hladkostěnými
koronárními tepnami. Podle klinických příznaků a laboratorních hodnot byli pacienti
rozděleni na skupinu se stabilní anginou pectoris (N=529) nebo s akutním
koronárním syndromem (AKS). Ode všech subjektů byl získán písemný informovaný
souhlas a studie byla schválena ústavní etickou komisí.
Laboratorní metody
Genová DNA byla izolována z leukocytů periferní krve standardní metodou
s použitím fenol-chloroformové extrakce. Byly zkoumány 2 jednonukleotidové
43
polymorfismy (SNP) v promotoru genu pro eotaxin a jeden SNP v exonu 1: C>T v
pozici −426 (rs16969415), A>G v pozici −384 (rs17809012) a SNP 67 G>A
(rs1129844). Jednonukleotidové polymorfismy byly analyzováno pomocí
polymerázové řetězové reakce (PCR) a následně restrikční enzymové analýzy.
Každá PCR byla provedena v objemu 25µL s použitím Taq polymerázy (Finzymes).
Všechny restrikční enzymové analýzy byly provedeny v objemu 10 µL. Restrikční
analýzy C>T v pozici −426 a A>G v pozici −384 byly provedeny s použitím TaqI
restrikčního enzymu podle instrukcí výrobce (NEB, UK). V případě SNP C>T −426
byla délka výsledných fragmentů 204 a 41 bp pro -426C, 245 bp pro -426T. U
polymorfismu A>G −384 délka fragmentů byla 204 bp pro 384A, 184 bp pro -384G.
Polymorfismus 67G>A byl stanoven pomocí restrikční endonukleázy BsrI podle
pokynů výrobce (NEB, UK). Genotypy byly určeny pomocí elektroforézy. Analýza
repetitivních sekvencí byla provedena pouze u 472 subjektů. Přípravky pro PCR
reakci byly následující: Taq® polymeráza s Taq® 10X PCR Buffer (bez Mg2+,
Fermentas), 1.5 mM Mg2+, dNTPs (dATP + dCTP + dGTP + dTTP, 200 μM každý,
Fermantas), počáteční primer (5‘AGCCTAACATTCAAGCCTCACA-3’), reverzní
primer (5‘-GACCACAGCCCAAGTTTCTTTC-3’), 10 pmol/μl každý v 20μl reakčním
objemu. Reakční podmínky PCR: 95 °C/1 min, 30× (95 °C/30 s, 58 °C/30 s, 72 °C/60
s, 72 °C/30 min, 4 °C/ ochlazení). Reakční směs 10 µL pro analýzu fragmentů se
skládala z 0.5 μl GeneScan™ – 400 HD ROX® Size Standard (Applied Biosystems),
0.5 μl of 10x ředěného PCR produktu a 9 μl HiDi™ Formamide (Applied Biosystems).
Vzorek byl pak denaturován po dobu 5 minut v 95°C následované 5 minutovou
inkubací na ledu. Analýza fragmentů byla provedena pomocí 4-kapilárního
automatického analyzátoru ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems). Výsledky byly
analyzovány pomocí GeneMapper v. 3.5 software (Applied Biosystems).
44
Pro další hodnocení byly hodnoceny sekvence ≤8 repeticí jako krátké, ≥9 repeticí
jako dlouhé. Tato hraniční hodnota odpovídá mediánu celkového počtu alel.
Statistická analýza
Statistická analýza byla provedena pomocí s použitím programu Statistica (StatSoft,
verze 11). Fisherův exaktní test byl použit pro kategorická data, Mann-Whitney U-test
pro spojité veličiny. Logistická regrese byla použita pro výpočet odds ratio a intervalů
spolehlivosti. Byly srovnány frekvence genotypů ve skupinách s akutním koronárním
syndromem, stabilní ICHS a kontrolní skupině. Pro vyhodnocení genetického vlivu na
rozsah ICHS byli srovnáváni pacienti s postižením jedné věnčité tepny proti těm
s postižením 3 tepen. Protože nebyly známy žádné informace o vlivu různých
genotypů v eotaxinovém genu na ICHS, byly zkoumány 4 různé modely dědičnosti:
alelový aditivní (jedna alela proti ostatním), genotypový dominantní (častější
homozygot proti nosiči vzácnější alely), recesivní (vzácnější homozygot proti nosiči
obvyklejší alely) a kodominantní model (oba homozygoti pro heterozygotům). Kodominantní
model je charakterizován výhodou heterozygotů proti homozygotům [1,2].
U polymorfismů 67 G>A a −426 C>T nebyl použit recesivní model z důvodu nízkého
počtu vzácných homozygotů v každé skupině, stejný přístup byl použit v případě
hodnocení vlivu repetitivních sekvencí. Bonferroniho test byl použit pro mnohočetné
testování korekcí v případě hodnocení vlivu různých polymorfismů.
2.3.2. Výsledky
Charakteristika souboru pacientů je popsána v Tabulce 1. Dva ze zkoumaných SNP
(-426C>T a 67G>A) byly v Hardyho-Weinbergově rovnováze. Mezi genotypy byla
významná vazebná nerovnováha (p<0.005). Frekvence -384A>G nebyly v HardyhoWeinbergově
rovnováze.
45
Pacienti s ICHS Kontroly
Celkem (muži) 760 (562) 173 (88)
Kuřáci 107 (14,1%) 18 (10,4%)
Věk (roky) 66 (59-74) 61 (54-67)
Systolický krevní tlak
(mmHg)
140 (130-150) 135 (120-140)
Cholesterol (mmol/l) 4,30 (3,12-5,70) 4,73 (4,09-5,46)
HDL (mmol/l) 1,08 (0,93–1,26) 1,27 (1,07–1,60)
LDL (mmol/l) 2,35 (1,92–3,09) 2,75 (2,20–3,21)
Triacylglyceroly (mmol/l) 1,52 (1,19–2,08) 1,27 (0,86–1,89)
Diabetes mellitus (%
z celkového počtu)
259 (34,1%) 23 (13,3%)
C-reaktivní protein 4,2 (1,9-8,3) 2,6 (1,3-4,8)
Tabulka 1. Základní charakteristika souboru. Všechny spojité veličiny s normálním
rozložením jsou prezentovány jako medián (dolní-horní kvartil).
Počet opakování Akutní ICHS Chronická ICHS Kontroly
3 28 (12.4 %) 84 (16.9 %) 34 (15.3 %)
6 30 (13.3 %) 52 (10.5 %) 34 (15.3 %)
7 4 (1.7 %) 8 (1.6 %) 3 (1.4 %)
8 28 (12.4 %) 72 (14.5 %) 24 (10.8 %)
9 51 (22.6 %) 79 (15.9 %) 34 (15.3 %)
10 55 (24.3 %) 119(24.0 %) 57 (25.7 %)
11 30 (13.3 %) 82 (16.5 %) 36 (16.2 %)
celkem 226 496 222
Tabulka 2. Počet (GAAGGA)n hexanucleotidových opakování ve zkoumaném souboru
46
Počet (GAAGGA)n opakování v našem souboru byl v rozsahu 3 až 12. Žádný pacient
neměl 4 nebo 5 opakování. Frekvence rozdílných alel je uvedena v Tabulce 2.
Distribuce tří SNP a krátké/dlouhé varianty (GAAGGA)n je uvedena v Tabulce 3.
Rozdíly mezi pacienty s ICHS a kontrolami nebyly významné, p hodnoty jsou
prezentovány v Tabulce 4. Hodnoty p ukazující rozdíly mezi akutní a chronickou
ICHS (CHICHS) jsou uvedeny v Tabulce 5. Exonový polymorfismus 67 G>A byl
významně spojen s formou ICHS, pacienti s GG genotypem byli významně častěji
zastoupeni ve skupině akutních koronárních syndromů ve srovnání se skupinou se
stabilní ICHS (p=0.0011, pcorr=0.0044, OR=1.86, 95 % CI 1.28-2.69), a také ve
srovnání s kontrolní skupinou (p=0.0075, pcorr= 0.03, OR=1.87, 95 % CI 1.19-2.95).
Závislost byla významnější při použití kodominantního modelu (AKS vs. CHICHS:
p=0.0004, pcorr=0.0016, OR=1.97, 95 % CI 1.34-2.90, AKS vs. kontroly: p=0.0029,
pcorr=0.0116, OR= 2.05, 95 % CI 1.28-3.27) (Graf 1). U žádných dalších
zkoumaných alel nebyl zaznamenán významný rozdíl. Počet postižených tepen u
různých genotypů je uveden v Tabulce 6. Hodnoty p popisující rozdíly mezi pacienty
s postižením jedné koronární tepny a tří tepen prezentuje Tabulka 7.
SNP
skupina
(GAAGGA)n
long/short*
67 G>A −426 C>T −384 A>G Celkem
S/S S/L L/L GG GA AA CC CT TT AA AG GG
AKS 17 55 39 185 41 5 206 24 1 62 124 45 231
CHICHS 47 114 79 362 158 9 449 74 6 119 292 118 529
Kontroly 13 34 22 118 53 2 150 21 2 42 97 34 173
Celkem 77 203 140 665 252 16 805 119 9 223 513 197 933
Tabulka 3. Distribuce 3 SNP a dlouhé/krátké varianty (GAAGGA)n
hexanukleotidového opakování u pacientů s akutním koronárním syndromem,
chronickou ICHS a kontrolami (* počet (GAAGGA)n byl stanoven jen u části souboru)
47
Model
dědičnosti
(GAAGGA)n
long/short*
-426C>T −384 A>G 67 G>A
Dominantní 0.8890 0.9032 0.9214 0.3519
Aditivní 0.8507 1.0000 0.7209 0.4568
Recesivní 0.8663 - 0.6799 Kodominantní
0.8957 0.8012 0.7996 0.2550
Tabulka 4. Hodnoty p ve vztahující se k frekvencím 3 SNP a počtu (GAAGGA)n
opakování, ICHS pacienti vs. kontroly. Nebyl nalezen žádný rozdíl mezi ICHS
pacienty (n=760) a kontrolami (n=173).
Model
dědičnosti
(GAAGGA)n
long/short*
-426C>T −384 A>G 67 G>A
Dominantní 0.7161 0.1371 0.1965 0.0011
Aditivní 0.4598 0.0887 0.2001 0.0048
Recesivní 0.3749 - 0.4422 Kodominantní
0.7318 0.1961 0.7514 0.0004
Tabulka 5. Hodnoty p ve vztahující se k frekvencím 3 SNP a počtu (GAAGGA)n
opakování, pacienti s AKS (n=231) vs. CHICHS (n=529). Byl nalezen významný
rozdíl v četnosti 67 G>A genotypů mezi pacienti s AKS a CHICHS. Skupina s AKS se
rovněž významně lišila od kontrolních subjektů bez ICHS.
48
SNP (GAAGGA)n
long/short*
67 G>A −426 C>T −384 A>G Celkem
Počet
postižených
tepen
S/S S/L L/L GG GA AA CC CT TT AA AG GG
1 12 53 44 154 72 3 199 28 2 53 128 48 229
2 22 61 41 174 59 5 207 30 1 55 129 54 238
3 30 55 33 219 68 6 249 40 4 73 159 61 293
Celkem 64 169 118 547 199 14 655 98 7 181 416 163 760
Tabulka 6. Distribuce tří SNP a dlouhé/krátké varianty (GAAGGA)n
hexanukleotidového opakování u pacientů s postižením 1, 2 nebo 3 koronárních
tepen.
Model
dědičnosti
(GAAGGA)n
long/short*
-426C>T −384 A>G 67 G>A
Dominantní 0.0512 0.6133 0.6807 0.0640
Aditivní 0.0043 0.4120 0.8029 0.1394
Recesivní 0.0060 - 1.0000 Kodominantní
0.7912 0.6949 0.7237 0.0370
Tabulka 7. Hodnoty p vztahující se k třem SNP a počtu (GAAGGA)n opakování,
pacienti s onemocněním 1 koronární tepny vs pacienti s onemocněním 3 tepen.
Krátká varianta (GAAGGA)n byla spojena s postižením 3 tepen. U 67 G>A byl rovněž
zachycen trend, který byl po korekci nevýznamný. Frekvekce genotypů u postižení 2
tepen byla v obou případech mezi hodnotami pro 1 a 3 tepny.
49
Graf 1. Četnosti 67 G>A genotypů a klinické formy ICHS. Graf ukazuje vyšší
frekvenci GG homozygotů u pacientů s akutním koronárním syndromem ve srovnání
s kontrolami [p=0.0075, p(corr) = 0.03] a skupinou s chronickou ICHS [p=0.0011,
p(corr) = 0.0044]. V kodominantním modelu, byl GA heterozygotní genotyp méně
častý u pacientů s AKS ve srovnání jak s kontrolní skupinou [p=0.0029], pcorr =
0.0116 tak se skupinou s CHICHS [p=0.0004, p(corr) = 0.0016].
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
CHICHS AKS Kontroly
Graf 1
GG GA AA
50
Frekvence krátkých variant (GAAGGA)n opakování vzrůstal s počtem postižených
tepen. Nosiči obou krátkých alel měli častěji postižení 3 koronárních tepen ve
srovnání s nosiči s alespoň jednou dlouhou alelou (1 vs. 3 postižené tepny: p=0.006,
pcorr=0.024, OR=2.76, 95 % CI 1.33-5.71). A naopak zde byl trend pro méně
postižených tepen u nosičů 2 dlouhých variant. Alelově závislý efekt (předpokládající
aditivní efekt 2 krátkých/dlouhých variant na fenotyp) byl ještě více významný
(pcorr=0.017) (Graf 2). Rovněž byl zachycen trend u nosičů 67 GG genotypu pro
postižení více tepen (1 vs. 3 postižené tepny: p= 0.064), tento trend byl více zjevný
při použití kodominantního modelu, i když hodnota p=0,037 nebyla po Bonferroniho
korekci významná. Četnost genotypů u postižení 2 tepen byla mezi ostatními 2
skupinami. Žádný ze dvou promotorových SNP (−426 C>T nebo −384 A>G) neměl
významný vztah k typu ICHS nebo počtu postižených tepen. Hlavním výsledkem je
tedy efekt (GAAGGA)n opakování na počet postižených tepen a vztah 67 G>A
polymorfismu k výskytu akutního koronárního syndromu. Žádný vztah k ICHS nebyl
nalezen pro polymorfismy −426 C>T nebo −384 A>G.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1 tepna 2 tepny 3 tepny
Graf 2 - frekvence genotypů (GAAGGA)n podle počtu
postižených koronárních tepen
2 krátké 1krátká/1 dlouhá 2 dlouhé
51
2.3.3. Diskuze
Vztah hladiny eotaxinu, různých variant jeho genu a zánětlivého procesu v cévní
stěně byl zkoumán od první dekády 21. století. V mnoha studiích byla zvýšená
hladina eotaxinu spojena s přítomností a rozsahem ischemické choroby srdeční [3-7],
ale jiné práce tuto souvislost nepotvrdily [8,9]. Exprese eotaxinu je lokálně zvýšena
v místech zánětu cévní stěny [10], a jeho hladina je rovněž zvýšena v krvi u pacientů
s akutním koronárním syndromem [11]. Kromě svého atrakčního účinku na leukocyty
stimuluje tento protein i migraci buněk hladkého svalstva z medie do intimy u
narušené arteriální stěny [12]. Tento proces je považován za jeden z hlavních kroků
v progresi aterosklerozy a restenozy [13,14]. Také 67 G>A polymorfismus byl
zkoumán ve vztahu k ICHS s různými výsledky. V prospektivní studii Zee a kol. [15]
popsali vliv AA genotypu na riziko infarktu myokardu, což není v souladu s našimi
výsledky. Avšak tato studie použila recesivní model dědičnosti, četnost A alely byla
nevýznamně častější u kontrol ve srovnání s pacienty s AKS pokud byl použit
dominantní model. V naší studii nízký počet AA homozygotů nedovolil použití
validního recesivního modelu. Nejvýznamnější spojitost byla nalezena při použití
kodominantního modelu, tj. že heterozygotní populace má nižší výskyt AKS než AA i
GG homozygoti dohromady. Tento model dědičnosti měl nejlepší výsledky, když byli
pacienti s AKS srovnáváni s pacienty s CHICHS (p=0.0004, pcorr=0.0016, OR=1.97,
95 % CI 1.34-2.90) i s kontrolami (p=0.0029, pcorr=0.0116, OR=2.05, 95 % CI 1.28-
3.27). Dominantní model (A alela vs GG homozygoti) ukazoval jen mírně slabší
významnost. Vzhledem k tomu, že nebyl nalezen významný rozdíl mezi pacienty
s chronickou ICHS a kontrolami, tato práce ukazuje větší náchylnost pacientů
s genotypem 67 GG ke vzniku AKS. Akutní koronární syndrom je, na rozdíl od
chronické ICHS, většinou spojen s rupturou aterosklerotického plátu [16], a ruptura
52
plátu je zase spojena s větší zánětlivou reakcí [17,18], proto se dá očekávat větší vliv
genetických variant ovlivňujích zánětlivou odpověď organismu. Další studie ovšem
nepotvrdily závislost 67 G>A polymorfismem a ICHS, i když genetické varianty
ovlivňovaly hladinu cirkulujícího eotaxinu [19,20]. Tyto práce se ale nezabývaly
klinickou formou ICHS, pouze její přítomností či rozsahem. Když jsme v této práci
zkoumali souvislost mezi rozsahem ICHS ve smyslu postižených tepen, poskytoval
kodominantní model nejlepší výsledky – ve srovnání s heterozygoty měli pacienti
s ICHS s genotypy AA a GG častější výskyt postižení 3 tepen proti pacientů
s postižením jedné tepny (p=0.037). Toto dále podporuje hypotézu, že GA
kombinace je výhodnější ve smyslu rozvoje ICHS. Promotorové polymorfismy -426
C>T a −384 A>G, nebyly do publikace této práce blíže zkoumány ve vztahu k ICHS.
V naší studii jsme souvislost mezi těmito polymorfismy a ICHS nepotvrdili, ale byl
nalezen významný vztah mezi -426 C>T polymorfismem a laboratorními markery
metabolického syndromu u pacientů s ICHS, CC homozygoti měli významně vyšší
plazmatické hladiny kyseliny močové (p<0.001), fibrinogenu, triglyceridů, a CRP
(p<0.05), měli vyšší tělesnou hmotnost (p<0.01) a body mass index (p<0.05). Tyto
abnormality jsou obecně považovány za prozánětlivé [21]. Rovněž studie zkoumající
vztah hexanukleotidového opakování (GAAGGA)n nebyla do publikace této práce
zveřejněna. Výsledek této práce ukazuje na možný vliv počtu opakování na počet
postižených koronárních tepen. Podle některých údajů z literatury může mít počet
opakování vliv na sekundární strukturu DNA [22] a lze tedy spekulovat, že různá
délka opakování má různý vliv na expresi DNA.
2.3.4. Závěr
V této práci byla nalezena významná souvislost mezi počtem (GAAGGA)n
hexanukleotidových opakování a rozsahem ICHS ve smyslu počtu postižených
53
tepen. Možné mechanismy zahrnují změny v sekundární struktuře DNA ovlivňující
expresi eotaxinu a zánětlivé procesy v cévní stěně. Další dva promotorové SNP
neměly vztah k ICHS, genotyp GG v exonovém polymorfismu 67 G>A byl spojen
s akutními formami ICHS.
54
Literatura k práci: Vztah mezi třemi jednonukleotidovými polymorfismy v genu
pro eotaxin (CCL 11), hexanukleotidovým opakujícím řetězcem a závažností
ICHS
1) Kojima K, Role of epistasis and overdominance in stability of equilibria with
selection. Proc Natl Acad Sci U S A 1959;45:984–989
2) Buzbas EO, Joyce P, Abdo Z. Estimation of selection intensity under
overdominance by Bayesian methods. Stat Appl Genet Mol Biol 2009;8:Article32
3) Emanuele E, Falcone C, D'Angelo A, Minoretti P, Buzzi MP, Bertona M, Geroldi D.
Association of plasma eotaxin levels with the presence and extent of angiographic
coronary artery disease. Atherosclerosis 2006;186:140–145
4) Raaz-Schrauder D, Klinghammer L, Baum C, Frank T, Lewczuk P, Achenbach S,
Cicha I, Stumpf C, Wiltfang J, Kornhuber J, Daniel WG, Garlichs CD. Association of
systemic inflammation markers with the presence and extent of coronary artery
calcification. Cytokine 2012;57:251–257
5) Kaehler J, Tuleweit A, Steven D, Krempl T, Haar A, Carstensen M, Koester R,
Terres W, Meinertz T. Association between eotaxin (CCL11), C-reactive protein, and
antimicrobial antibodies in patients undergoing coronary angioplasty. J Investig Med
2006;54:446–454
6) Ardigo D, Assimes TL, Fortmann SP, Go AS, Hlatky M, Hytopoulos E, Iribarren C,
Tsao PS, Tabibiazar R, Quertermous T, Investigators A. Circulating chemokines
accurately identify individuals with clinically significant atherosclerotic heart disease.
Physiol Genomics 2007;31:402–409
55
7) Economou E, Tousoulis D, Katinioti A, Stefanadis C, Trikas A, Pitsavos
C,Tentolouris C,Toutouza MG,Toutouzas P. Chemokines in patients with ischaemic
heart disease and the effect of coronary angioplasty. Int J Cardiol 2001;80:55–60
8) Mosedale DE, Smith DJ, Aitken S, Schofield PM, Clarke SC, McNab D, Goddard
H, Gale CR, Martyn CN, Bethell HW, Barnard C, Hayns S, Nugent C, Panicker A,
Grainger DJ. Circulating levels of MCP-1 and eotaxin are not associated with
presence of atherosclerosis or previous myocardial infarction. Atherosclerosis
2005;183:268–274
9) Canouï-Poitrine F, Luc G, Mallat Z, Machez E, Bingham A, Ferrieres J, Ruidavets
JB, Montaye M, Yarnell J, Haas B, Arveiler D, Morange P, Kee F, Evans A, Amouyel
P, Ducimetiere P, Empana JP, P. S. Group. Systemic chemokine levels, coronary
heart disease, and ischemic stroke events: the PRIME study. Neurology
2011;77:1165–1173
10) Haley KJ, Lilly CM, Yang JH, Feng Y, Kennedy SP, Turi TG, Thompson JF,
Sukhova GH, Libby P, Lee RT. Overexpression of eotaxin and the CCR3 receptor in
human atherosclerosis: using genomic technology to identify a potential novel
pathway of vascular inflammation. Circulation 2000;102:2185–2189
11) Wyss CA, Neidhart M, Altwegg L, Spanaus KS, Yonekawa K, Wischnewsky MB,
Corti R, Kucher N, Roffi M, Eberli FR, Amann-Vesti B, Gay S, von Eckardstein A,
Lüscher TF, Maier W. Cellular actors, Toll-like receptors, and local cytokine profile in
acute coronary syndromes. Eur Heart J 2010;31:1457–1469
12) Kodali RB, Kim WJ, Galaria II, Miller C, Schecter AD, Lira SA, Taubman MB.
CCL11 (Eotaxin) induces CCR3dependent smooth muscle cell migration. Arterioscler
Thromb Vasc Biol 2004;24:1211–1216
56
13) Hao H, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML. Arterial smooth muscle cell
heterogeneity: implications for atherosclerosis and restenosis development.
Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003;23:1510–1520
14) Schwartz SM, deBlois D, O'Brien ER. The intima. Soil for atherosclerosis and
restenosis. Circ Res 1995;77:445–465
15) Zee RY, Cook NR, Cheng S, Erlich HA, Lindpaintner K, Lee RT, Ridker PM.
Threonine for alanine substitution in the eotaxin (CCL11) gene and the risk of
incident myocardial infarction. Atherosclerosis 2004;175:91–94
16) Hong MK, Mintz GS, Lee CW, Kim YH, Lee SW, Song JM, Han KH, Kang DH,
Song JK, Kim JJ, Park SW, Park SJ. Comparison of coronary plaque rupture
between stable angina and acute myocardial infarction: a three-vessel intravascular
ultrasound study in 235 patients. Circulation 2004;110:928–933
17) Choi SY, Mintz GS. What have we learned about plaque rupture in acute
coronary syndromes? Curr Cardiol Rep 2010;12:338–343
18) Tedgui A, Mallat Z. Cytokines in atherosclerosis: pathogenic and regulatory
pathways. Physiol Rev 2006;86:515–581
19) Sheikine Y, Olsen B, Gharizadeh B, Jatta K, Tornvall P, Ghaderi M. Influence of
eotaxin 67G>A polymorphism on plasma eotaxin concentrations in myocardial
infarction survivors and healthy controls. Atherosclerosis 2006;189:458–463
20) Rosner SA, Ridker PM, Zee RY, Cook NR. Interaction between inflammationrelated
gene polymorphisms and cigarette smoking on the risk of myocardial
infarction in the Physician's Health Study. Hum Genet 2005;118:287–294
57
21) Fulop T, Tessier D, Carpentier A. The metabolic syndrome. Pathol Biol (Paris)
2006;54:375–386
22) Rippe K, Fritsch V, Westhof E, Jovin TM. Alternating d(G-A) sequences form a
parallel-stranded DNA homoduplex. EMBO J 1992;11:3777–3786
58
2.4. Laboratorní markery u pacientů s ICHS
Cílem práce bylo popsat vztah mezi některými základními laboratorními parametry
jako je počet leukocytů, vysoce senzitivní C- reaktivní protein (hs-CRP), fibrinogen,
kreatinin a kyselina močová u pacientů s akutními koronárními syndromy a stabilní
ICHS a s postižením jedné nebo více tepen u stabilní ICHS.
2.4.1. Soubor a metodika
Studie zahrnula 1254 pacientů přijatých se známou či suspektní ICHS k provedení
koronarografie. Skupina pacientů s ICHS byla tvořena pacienty jak s chronickou
ICHS, tak s akutními formami jako nestabilní angina pectoris či akutní infarkt
myokardu. Pacienti podstoupili kardiologické vyšetření včetně anamnezy, fyzikálního
vyšetření, EKG, laboratorních odběrů, koronarografie a u nejasných diagnoz
echokardiografie. Všechny laboratorní odběry byly odebrány ráno po celonočním
lačnění. Analýza krevního obrazu byla provedena na přístroji SysMed XE 2100,
Japonsko, fibrinogen byl stanoven podle Clauseho metody systémem BCS XP,
Siemens, Německo. Hodnoty CRP, kreatininu, lipidového spektra a kyseliny močové
byly měřeny na analyzátoru Advia 1650, Siemens, Německo, s použitím kitů BLW a
BioVendor. Pacienti s těžkou renální (hodnota kreatininu nad 200 µmol/l), jaterní
nedostatečností, anemií, endokrinními nebo neurologickými poruchami nebo
malignitami byli vyřazeni. Rovněž jsme vyřadili pacienty s anamnézou infarktu
myokardu a hladkostěnnými koronárními tepnami, pacienty se spastickou anginou
pectoris nebo pacienty s nekompletními laboratorními nebo jinými vyšetřeními.
Anamneza infarktu myokardu nebo nestabilní anginy pectoris do 1 měsíce byla
hodnocena jako akutní koronární syndrom. Hyperlipoproteinemie byla definována
jako známá diagnoza hyperlipoproteinemie z dokumentace pacienta a/nebo terapie
59
hypolipidemiky nebo hodnota celkového cholesterolu nad 5 mmol/l, diabetes mellitus
jako současná terapie perorálními antidiabetiky nebo inzulinem nebo opakovaná
lačná glykemie nad 7,0 mmol/l za hospitalizace, hypertenze jako léčba
antihypertenzivy nebo opakovaný klidový krevní tlak nad 140/90 mmHg za
hospitalizace. Všichni pacienti zahrnuti do této studie poskytli informovaný souhlas a
studie byla schválena místní etickou komisí.
Koronarografie
Koronarografie byla provedena z femorálního nebo radiálního přístupu na přístroji
Philips Allura Xper FD 10 (Philips, The Netherlands)a vyšetření byla hodnocena
dvěma zkušenými intervenčními kardiology. Významná ICHS byla definována jako
>50% stenóza lumina alespoň 1 koronární tepny. Pacienti s ICHS byli rozděleni do
skupin s akutní a chronickou ICHS, pacienti ve skupině stabilní ICHS dále na
podskupiny se stenózou 1 nebo více koronárních tepen. Pacienti s nevýznamnou
aterosklerózou (zúžení lumen <50%) byli hodnoceni jako oddělená skupina. Pacienti
s hladkostěnnými koronárními tepnami byli použiti jako kontroly.
Validace dat a statistická analýza
Do studie bylo zahrnuto celkem 1254 pacientů. Po zhodnocení všech údajů bylo 133
pacientů vyřazeno pro nekompletní údaje nebo nevyhovující laboratorní hodnoty. Při
hodnocení dat byly hlavní parametry věk, pohlaví, body mass index, údaje
z anamnézy (hypertenze, hyperlipoproteinemie, diabetes mellitus, cévní mozková
příhoda, onemocnění periferních tepen, renální insuficience a kouření) a laboratorní
hodnoty (hemoglobin, leukocyty, trombocyty, fibrinogen, protrombinový test, celkový
cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol, triacylglyceroly, kyselina močová,
kreatinin, glykemie, CRP. Pacienti u nichž nebyla k dispozici hodnota ejekční frakce
60
z ventrikulografie při koronarografii nebo z echokardiografie byli rovněž vyřazeni.
Počty pacientů v jednotlivých skupinách udává Tabulka 1a.
Skupina Podskupina Před validací Po validaci Počet
vyřazených
pacientů
počet % počet %
Akutní ICHS 270 21,5 249 22,2 21
Chronická
ICHS
642 51,2 568 50,7 74
Postižení 1
tepny
206 16,4 177 15,8 29
Postižení
více tepen
436 34,8 391 34,9 45
Nevýznamná
ateroskleroza
126 10 109 9,7 17
Kontrolní
skupina
216 17,2 195 17,4 21
Celkem 1254 100 1121 100 133
Tabulka 1a – počty pacientů v jednotlivých skupinách, před a po validaci dat
Kategorické veličiny jsou v analýze uvedeny jako procentuální hodnoty, spojité
veličiny jako průměr a 95% interval spolehlivosti nebo medián a percentilový rozsah.
Významné rozdíly mezi skupinami byly hodnoceny pomocí ANOVA a Bonferroniho
testu pro spojité veličiny a chi-square testu pro kategorické veličiny. Bonferroniho
post-hoc test byl použit jako řešení pro problematiku mnohočetného testování.
Prediktory v logistické regresi byly určeny pomocí jejich odds ratio a intervalu
61
spolehlivosti, jejich statistická významnost byla určena pomocí Wald testu, což je
standardní test k určení statisticky významného vztahu mezi závisle a nezávisle
proměnnou veličinou. Statistická významnost celého modelu byla testována pomocí
Hosmer-Lemeshow testu, p<0,05 bylo hodnoceno jako statisticky významné. Analýza
byla provedena pomocí programu SPSS 12.0 a Statistica 8.0.
2.4.2. Výsledky
Počty pacientů podle přítomnosti nebo nepřítomnosti ICHS a její závažnosti ukazuje
tabulka 1a. Pacienti jak s akutní tak chronickou ICHS měli významně častěji
hypertenzi, hyperlipoproteinemii, diabetes, cévní mozkovou příhodu, onemocnění
periferních tepen, kouření cigaret v anamneze a byli významně starší. Rovněž
ejekční frakce levé komory byla významně nižší u pacientů s ICHS (Tabulka 1b).
Základní rozdíly v laboratorních parametrech udává Tabulka 2. Pacienti s akutními
formami ICHS měli významně vyšší hladinu leukocytů, C- reaktivního proteinu,
fibrinogenu a rovněž glukózy. Toto je zřejmé, neboť zánětlivé procesy jsou
fyziologické v případě ruptury aterosklerotického plátu nebo nekrózy myokardu.
V těchto zánětlivých parametrech byl rovněž nalezen rozdíl mezi pacienty
s chronickou ICHS a kontrolami, což demonstruje zánětlivé pozadí vzniku a rozvoje
aterosklerozy. Z ostatních parametrů, pacienti s chronickou ICHS měli vyšší hladiny
kyseliny močové, kreatininu a nižší HDL cholesterol. Ostatní hodnoty lipidového
spektra mohou působit paradoxně, neboť pacienti s ICHS měli nižší celkový a LDL
cholesterol, to je ale způsobeno vlivem hypolipidemické léčby, která byla u nich
významně častější. Prevalence hypolipidemické terapie byla následující: ve skupině
chronické ICHS mělo 548 pacientů (96,5%) hypolipidemickou léčbu (530 pacientů
užívalo statin, 1 fibrát a 17 kombinaci statin + fibrát). Ve skupině s akutní ICHS bylo
na terapii 243 pacientů (97,6%, 239 statin, 1 fibrát, 3 kombinaci).
62
Všichni
pacienti
Akutní ICHS Chronická
ICHS
Nevýznamná
ateroskleroza
Kontrolní
skupina
(N = 1121) (N = 249) (N = 568) (N = 109) (N = 195)
Muži # 70.0 70.7 77.5 64.2 50.8
Věk (roky) # 64.8
(64.2;65.4)
65.9
(64.6;67.2)*
65.7
(64.9;66.5)*
65.7 (64;67,3)* 60
(58,6;61.4)
Výška (cm) 171.3
(170.8;171,8)
171.3
(170.2;172.4)
171.9
(171.2;172.6)
170.7 (168.9;172.5) 170
(168.7;171.2)
Váha (kg) 84.2
(83.4;85.1)
84.2
(82.4;86)
84.7
(83.5;85.9)
83.7 (81;86.3) 83.2
(81.2;85.3)
EF (%) 53.4
(52.6;54.2)
48.8
(47.3;50.4)*§+
52.7 (51.6 ;
53.8)*+
58.9 (56.7 ; 61.1) 58.2 (56.5;
59.9)
BMI (kg/m2
) 28.7
(28.4;28.9)
28.6 (28.1;29.2) 28.6
(28.3;28.9)
28.7 (27.9 ; 29.5) 28.8
(28.1;29.4)
Hypertenze # 78.1 79.1 79.8 81.7 69.7
Diabetes mellitus # 28.4 34.5 31.5 22.9 14.4
Hyperlipoproteinemie # 78.5 79.9 84.3 67.0 66.2
Onemocnění perif. tepen
#
8.1 15.3 8.6 0.9 1.5
Anamnéza CMP # 9.6 14.1 10.7 5.5 3.1
Kouření (i stopkuřáci) # 47.1 52.6 50.7 36.7 35.4
Tabulka 1b. Popis pacientů ve studii podle skupin s akutní a chronickou ICHS
Kategorické veličiny jsou uvedeny v % spojité veličiny jako průměr (95% interval
spolehlivosti). EF – ejekční frakce LK, CMP – cévní mozková příhoda. # významný
rozdíl mezi skupinami p<0.05, * významý rozdíl proti kontrolní skupině p<0.001, §významný
rozdíl proti chronické ICHS p<0.001, + významný rozdíl proti ateroskleroze
p<0.001
63
Ve skupině pacientů s nevýznamnou aterosklerózou užívalo hypolipidemika 83
pacientů (76,1%, všichni statin) a kontrolní skupině 49 pacientů ( 25,2%, 47 statin, 1
fibrát, 1 kombinaci). Významné rozdíly mezi skupinou aterosklerozy a kontrolní byly
pouze v hodnotách kreatininu a fibrinogenu. Detailní rozdělení na skupiny
s postižením jedné nebo více tepen u chronické ICHS je uvedeno v Tabulce 3.
Zánětlivé markery, kyselina močová a glukóza byly rovněž významně vyšší u
pacientů jak s onemocněním jedné tak i více tepen proti kontrolám, a HDL
cholesterol byl u těchto dvou skupin také nižší. U podskupin s onemocněním jedné
nebo více tepen navzájem nebyly významné rozdíly v biochemických nebo
zánětlivých markerech. Lineární logistická regrese ukazuje vztah biochemických
markerů u pacientů k přítomnosti ICHS (Tabulka 4). Jak akutní tak chronická ICHS
byly spojeny s hladinou leukocytů CRP, fibrinogenu, kyseliny močové, kreatininu,
HDL cholesterolu, triglyceridů a glukózy. Naproti tomu, u pacientů s nevýznamnou
aterosklerózou byla nalezena závislost pouze na fibrinogenu, kreatininu, HDL
cholesterolu a glukóze. Z klinických faktorů byl významný vztah nalezen u věku,
mužského pohlaví, hypertenze, diabetu, hyperlipidemie, anamnézou CMP,
onemocněním periferních tepen a anamnézou kuřáctví vzhledem k akutní i chronické
ICHS, u chronické jak s postižením jedné tak i více tepen. U nevýznamné
aterosklerozy byl nalezen vztah pouze k věku, mužskému pohlaví a hypertenzi.
64
Všichni
pacienti
Akutní ICHS Chronická
ICHS
Nevýznamná
ateroskleroza
Kontroly
(N = 1121) (N = 249) (N = 568) (N = 109) (N = 195)
Leukocyty† [x
109/l]
7.5 (7.3 ; 7.6) 8.2 (7.9 ; 8.5)§
++**
7.5 (7.3 ; 7.6)** 7 (6.7 ; 7.3) 6.7 (6.5 ; 7)
C-reaktivní
protein†
[mg/l]
4.3 (4 ; 4.6) 7.9 (6.8 ; 9.3)§
++**
3.8 (3.5 ; 4.1)* 3.5 (2.9 ; 4.2) 2.8 (2.5 ; 3.2)
Fibrinogen††
[g/l]
4 (4 ; 4.1) 4.4 (4.3 ;
4.5)§+*
4 (3.9 ; 4)** 3.9 (3.8 ; 4)* 3.7 (3.6 ; 3.8)
Kys.močová†
[umol/l]
355.2 (349.6 ;
361)
356.2
(343.5;369.3)
362.5
(354.7;370.6)*
352.7
(336.7;369.4)
335.1
(322.4;348.3)
Kreatinin†
[umol/l]
100.3 (99.3
;101.2)
102.4
(100.3;104.5)*
102.1
(100.7;103.5)*
98.7 (95.9 ;
101.7)*
93.3
(91.3;95.3)
Cholesterol†
[mmol/l]
4.5 (4.4 ; 4.6) 4.4 (4.3 ; 4.6)* 4.4 (4.4 ; 4.5)* 4.6 (4.4 ; 4.8) 4.7 (4.6;4.8)
LDL [mmol/l] 2.5 (2.4 ; 2.5) 2.5 (2.4 ; 2.6) 2.4 (2.4 ; 2.5)* 2.5 (2.4 ; 2.7) 2.6 (2.5;2.7)
HDL† [mmol/l] 1.1 (1.1 ; 1.2) 1.1 (1 ; 1.1) +* 1.1 (1.1 ; 1.1)
+*
1.2 (1.2 ; 1.3) 1.3 (1.3;1.4)
Triglyceridy†
[mmol/l]
1.5 (1.5 ; 1.6) 1.6 (1.5 ; 1.6)* 1.6 (1.5 ; 1.7)* 1.5 (1.3 ; 1.6) 1.4 (1.3;1.5)
Glukóza†
[mmol/l]
5.7 (5.6 ; 5.8) 6.1 (5.9 ; 6.4)§
+ *
5.7 (5.6 ; 5.8)* 5.5 (5.2 ; 5.7) 5.2 (5;5.3)
Trombocyty†
[x 109/l]
202.1
(198.7;205.4)
214.7 (206.6 ;
223)§
196.4 (191.9 ;
201)
199.5 (189 ;
210.5)
204.7
(197.7;211.9)
Tabulka 2. Laboratorní markery ve skupinách akutní a chronické ICHS. † významné rozdíly mezi
skupinami (ANOVA/Chi-square test, p<0.05),* výzamný rozdíl proti kontrolní skupině (Bonferroni test,
p<0.05), + významný rozdíl proti nevýznamné ateroskleroze (Bonferroni test, p<0.05), § významný
rozdíl mezi akutní a chron.ICHS (Bonferroni test, p<0.05)
65
Všichni pacienti Chron. ICHS – 1
tepna
Chron. ICHS –
více tepen
Kontrolní skupina
(N=763) (N=177) (N=391) (N=195)
Leukocyty† [x
109/l]
7.3 (7.2 ; 7.4) 7.6 (7.3 ; 7.9)§ 7.4 (7.2 ; 7.6)§ 6.7 (6.5 ; 7)
C-reaktivní
protein† [mg/l]
3.5 (3.3 ; 3.8) 3.8 (3.3 ; 4.5)§ 3.8 (3.4 ; 4.2)§ 2.8 (2.5;3.2)
Fibrinogen† [g/l] 3.9 (3.9 ; 3.9) 3.9 (3.8 ; 4)§ 4 (3.9 ; 4.1)§ 3.7 (3.6;3.8)
Kys. Močová †
[umol/l]
355.3 (348.5 ;
362.2)
369 (353.9 ;
384.7)§
359.6 (350.5 ;
369)§
335.1
(322.4;348.3)
Kreatinin† [umol/l] 99.8 (98.6 ; 101) 100.9 (98.6 ;
103.2)§
102.7 (101 ;
104.5)§
93.3. (91.3;95.3)
Celk. cholesterol†
[mmol/l]
4.5 (4.4 ; 4.6) 4.5 (4.3 ; 4.6) 4.4 (4.3 ; 4.5)§ 4.7 (4.6;4.8)
LDL [mmol/l] 2.5 (2.4 ; 2.5) 2.5 (2.3 ; 2.6) 2.4 (2.3 ; 2.5) 2.6 (2.5;2.7)
HDL† [mmol/l] 1.2 (1.1 ; 1.2) 1.2 (1.1 ; 1.2)§ 1.1 (1.1 ; 1.1)§ 1.3 (1.3;1.4)
Triglyceridy †
[mmol/l]
1.6 (1.5 ; 1.6) 1.5 (1.5 ; 1.6) 1.6 (1.6 ; 1.7)§ 1.4 (1.3;1.5)
Glukóza †
[mmol/l]
5.6 (5.5 ; 5.6) 5.5 (5.4 ; 5.7)§ 5.8 (5.6 ; 5.9)§ 5.2 (5;5.3)
Tabulka 3. Laboratorní markery v podskupinách chronické ICHS s onem. 1 nebo více tepen. †
významné rozdíly mezi skupinami (ANOVA/Chi-square test p<0.05), * významný rozdíl mezi chron.
ICHS s onem. 1 tepny a s onem. více tepen (Bonferroni test, p<0.05), § významný rozdíl proti
kontrolní skupině (Bonferroni test, p<0.05)
66
Akutní ICHS Chronická
ICHS
Nevýznamná
ateroskleroza
Chron. ICHS –
1 tepna
Chron. ICHS –
více tepen
(N = 249) (N = 568) (N = 109) (N = 177) (N = 391)
Leukocyty 1.45 (1.30;
1.61) ††
1.26 (1.14;
1.39) ††
1.08 (0.95;
1.24)
1.29 (1.15;
1.45) ††
1.24 (1.12;
1.38) ††
C-reaktivní
protein
1.13 (1.08;
1.17) ††
1.05 (1.01;
1.08) †
1.03 (0.99;
1.07)
1.04 (1.00;
1.07) †
1.05 (1.01;
1.09) †
Fibrinogen 4.23 (3.06;
5.86) ††
1.95 (1.50;
2.54) ††
1.73 (1.2;
2.51) †
1.65 (1.21;
2.26) †
2.16 (1.62;
2.88) ††
Kys.močová
(100 µmol)
1.27 (1.05 ;
1.54) †
1.38 (1.15 ;
1.65)†
1.21 (0.94 ;
1.56)
1.46 (1.18 ;
1.82)††
1.34 (1.1 ;
1.62)†
Kreatinin 1.04 (1.02;
1.05) ††
1.04 (1.03;
1.05) ††
1.02 (1.01;
1.04) †
1.03 (1.02;
1.05) ††
1.04 (1.03;
1.05) ††
Celk.cholesterol 0.79 (0.66;
0.95) †
0.78 (0.67;
0.91) †
0.88 (0.69;
1.12)
0.78 (0.64;
0.97) †
0.77 (0.65;
0.91) †
LDL 0.89 (0.72;
1.09)
0.79 (0.66;
0.96) †
0.89 (0.66;
1.2)
0.78 (0.60;
1.02)
0.79 (0.65;
0.96) †
HDL 0.07 (0.04;
0.15) ††
0.12 (0.07;
0.20) ††
0.50 (0.26;
0.98) †
0.23 (0.12;
0.43) ††
0.08 (0.04;
0.15) ††
Triglyceridy 1.4 (1.06;
1.84) †
1.52 (1.19;
1.94) ††
1.09 (0.78;
1.53)
1.33 (0.99;
1.79)
1.57 (1.22;
2.02) ††
Glukóza 1.56 (1.33;
1.82) ††
1.39 (1.20;
1.61) ††
1.23 (1.02;
1.48) †
1.30 (1.09;
1.55) †
1.42 (1.22;
1.65) ††
Tabulka 4. Vliv biochemických parametrů na přítomnost onemocnění podle linární logistické regrese.
Data jsou prezentována jako odds ratio s 95% intervalem spolehlivosti † významnost p<0.05 Wald
test, †† významnost p<0.001 Wald test
67
2.4.3.Diskuze
V této naší studii jsme zkoumali vztah některých laboratorních parametrů
k přítomnosti a závažnosti aterosklerozy koronárních tepen. Potvrdili jsme, že
zánětlivé parametry jako je hladina leukocytů, C-reaktivního proteinu a fibrinogenu
jsou primárně spojeny s akutními formami ICHS a rovněž s přítomností chronické
ICHS, avšak ne s počtem postižených tepen. Rovněž další parametry jako kreatinin,
kyselina močová, lipidy a glukóza nebyly významně spojeny s počtem postižených
tepen. Všechny zmíněné parametry se významně lišily u pacientů s ICHS a
kontrolami, pouze fibrinogen a kreatinin i mezi osobami s nevýznamnou ICHS a
kontrolami. Naše práce tedy nepotvrzuje předchozí výsledky (Cavusoglu et al.,
Sabatine et al. [1,2], kde byl popsán vztah mezi hladinou leukocytů a počtem
postižených tepen. Naopak závislost mezi nevýznamnými aterosklerotickými
změnami a hladinou fibrinogenu a kreatininu je v souladu s předchozími studiemi.
Levenson et al. [3,4] popsali, že přítomnost aterosklerotických plaků je silnější se
vzrůstajícím tercilem hladiny fibrinogenu. Autoři rovněž popsali synergický efekt mezi
hladinou fibrinogenu a poměrem celkový/HDL cholesterol ve vzniku subklinické
extrakoronární a koronární aterosklerozy. Role renálních funkcí byla popsána
v několika studiích, Bartnicky et al. [5] popsali vzrůstající riziko ICHS u pacientů
s klesající glomerulární filtrací. Cerne et al. [6] popsali, že mírně zvýšená hladina
kreatininu je spojena s koronární aterosklerózou, bez ohledu na tradiční rizikové
faktory. Mírná renální insuficience je rovněž spojena se sníženým koronárním
průtokem u pacientů s neobstruktivní formou koronární aterosklerozy. Toto může být
způsobeno podobnými změnami v renální a koronární mikrocirkulaci [7]. Závěrem,
laboratorní parametry jako hladina leukocytů, C-reaktivní protein a kyselina močová
jsou spojeny s přítomnosti jak akutní, tak chronické ICHS ale ne s počtem
68
postižených tepen. Fibrinogen a kreatinin mají dále navíc souvislost i s nevýznamnou
aterosklerózou.
69
2.4.4. Literatura k práci Laboratorní markery u pacientů s ICHS
1) Cavusoglu E, Chopra V, Gupta A, Ruwende C, Yanamadala S, Eng C, Clark LT,
Pinsky DJ, Marmur JD. Usefullness of the white blood cell count as a predictor of
angiographic findings in an unselected population referred for coronary angiography.
Am J Cardiol 2006; 98:1189–1193.
2) Sabatine MS, Morrow DA, Cannon CP, Murphy SA, Demopoulos LA, DiBattiste
PM, McCabe CH, Braunwald E, Gibson CM. Relationship between baseline white
blood cell count and degree of coronary artery disease and mortality in patients with
acute coronary syndromes: a TACTICS-TIMI 18 (Treat Angina with Aggrastat and
determine Cost of Therapy with an Invasive or Conservative strategy-Thrombolysis In
Myocardial Infarction 18 trial) substudy. J Am Coll Cardiol 2002; 40:1761–1768.
3) Levenson J, Giral P, Megnien JL, Gariepy J, Plainfosse MC, Simon A. Fibrinogen
and its relations to subclinical extracoronary and coronary atherosclerosis in
hypercholesterolemic men. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997; 17(1):45–50.
4) Levenson J, Giral P, Razavian M, Gariepy J, Simon A. Fibrinogen and silent
atherosclerosis in subject with cardiovascular risk factors. Arterioscler Thromb Vasc
Biol 1995; 15(9):1263–1268.
5) Bartnicky P, Stolarek R, Rysz J. Coronary artery atherosclerosis in patients with
the initial and the early stage of chronic renal failure. Centr Eur J Med 2009; 4(1):32–
36.
6) Cerne D, Kaplan-Pavlovic S, Kranjec I, Jurgens G. Mildly elevated serum
creatinine concentration correlates with the extent of coronary atherosclerosis. Renal
Failure 2000; 22(6):799–808.
70
7) Chade AR, Brosh D, Higano ST, Lennon RJ, Lerman LO, Lerman A. Mild renal
insufficiency is associated with reduced coronary flow in patients with non-obstructive
coronary artery disease. Kidney Int 2006; 69(2):266–271.
71
2.5 Vztah mezi dlouhodobými klinickými výsledky pacientů a eNOS −786 C/T, 4
a/b, MMP-13 rs640198 G/T, Eotaxin 426 C/T, −384 A/G, and 67 G/A polymorfismy
Cílem práce bylo zhodnotit vztah mezi polymorfismy v genu pro eotaxin (67 G/A,
−384 A/G, and −426 C/T), matrix metaloproteinázu 13 (rs640198) a endoteliální NOsyntázu
(−786C/Tand4a/b) a dlouhodobými klinickými výsledky u pacientů
s ischemickou chorobou srdeční.
2.5.1 Soubor a metodika
Studie zahrnula 532 pacientů s ICHS, kteří byli získáni ze souboru 1161
konsekutivních pacientů přijatých k provedení koronarografie po aplikaci
následujících vyřazovacích kriterií: známá malignita, pokročilá renální insuficience
(hladina kreatininu nad 200µmol/l), hladkostěnné koronární tepny nebo nevýznamná
ateroskleróza nebo očekávaná délka života pod 1 rok. Od všech pacientů byla
získána osobní a rodinná anamnéza, a podstoupili fyzikální vyšetření, laboratorní
odběry, EKG a koronarografii. Ischemická choroba srdeční byla definována jako
>50% zůžení lumen alespoň jedné koronární tepny. Krevní vzorky pro DNA analýzu
byly rovněž odebrány. Výběr DNA polymorfismů, analýza, výsledky a vliv na výskyt a
závažnost ICHS byly publikovány v předhozích studiích [1,2,3].
Sledování
Klinický osud pacientů byl vyhodnocen v roce 2014 pomocí nemocniční databáze.
Byly zaznamenávány následující příhody: akutní infarkt myokardu, nestabilní angina
pectoris, nutnost revaskularizace myokardu (perkutánní intervence nebo
aortokoronární bypass), hospitalizace pro srdeční selhání a implantace
kardioverteru/defibrilátoru. Pacienti, kteří nebyli ve sledování v naší nemocnici,
72
pacienti bez angiograficky potvrzené ICHS a pacienti u kterých nebyla provedena
DNA analýza byly vyřazeni z hodnocení.
Statistická analýza
Byl použit multivariantní Coxův regresní model pro stanovení podílu genových
polymorfismů a ostatních faktorů na přežití. Genové varianty byly předselektovány
z 8 polymorfismů v kandidátních genech s použitím Kaplan-Meierovy metody a lograng
testu v dominantním, recesivním a kodominantním modelu exprese alel.
Hodnota p 0.05 byla uznána jako statisticky významná pro zahrnutí do Coxovy
analýzy. Hardy-Weinbergova rovnováha byla vypočítána pro každý polymorfismus
s použitím χ2 testu. Negenetické veličiny zahrnuté do analýzy byly následující: věk
při vstupu do studie, pohlaví, diagnóza akutního koronárního syndromu při zařazení
do studie, infarkt myokardu v osobní anamnéze, ejekční frakce, počet postižených
tepen, obezita, hypertenze, hyperlipoproteinemie, diabetes mellitus, současná
diagnóza dilatační kardiomyopatie, významná chlopenní vada a kuřáctví. Byly
sledovány dva end-pointy: úmrtí, a složený kardiovaskulární end-point (infarkt
myokardu, nestabilní angina pectoris, koronární revaskularizace a hospitalizace pro
srdeční selhání). Byly použity 3 modely dominance alel: dominantní, recesivní a
aditivní. Postupná konstrukce Coxova modelu s hraniční hodnotou p=0.05 byla
finálně použita pro určení všech nezávislých faktorů podílejících se na přežití nebo
na výskytu kardiálních příhod. Software STATISTICA (StatSoft, verze 12) byla
použita pro statistickou analýzu.
73
2.5.2. Výsledky
Celkem 532 pacientů s významnou ICHS bylo nakonec zahrnuto do analýzy.
Základní charakteristika souboru je uvedena v Tabulce 1. Dvacet devět pacientů
zemřelo, zaznamenáno dále bylo 271 kardiálních příhod (26 pacientů s nestabilní
anginou pectoris, 44 akutních infarktů myokardu, 154 revaskularizací myokardu, 26
hospitalizací pro srdeční selhání a 21 implantací ICD). Průměrná doba sledování byla
77 měsíců. Kaplan-Meierovy křivky ukazující podíl přežití a přežití bez kardiální
příhody jsou uvedeny na Grafu 1 a 2.
Celkem/muži [n] 532/407
Věk [roky] 65.4 ± 9.6
BMI [kg/m2
] 28.7 ± 4.0
Kuřáci (%) 52 %
Hypertenze (%) 80 %
Diabetes (%) 34%
EF (%) 55 % (45 % – 60 %)
Tabulka 1. Základní charakteristika souboru pacientů. Data jsou prezentována jako průměr ± SD
BMI- body mass index, EF – ejekční frakce levé komory
Seznam zkoumaných polymomorfismů je na uveden v Tabulce 2. Preselekce
kandidátních polymorfismů byla provedena na základě p-hodnot log-rank testu.
Polymorfismy eNOS 4 a/b, eotaxin−426 C/T, eotaxin −384 A/G, a eotaxin 67 G/A byly
významně spojeny s úmrtím, eotaxin −384 A/G s kardiálními příhodami. Byl rovněž
zaznamenán nevýznamný trend pro eotaxin 67 G/A a kardiální příhody. Kompletní
data jsou uvedeny v tabulkách 3 a 4. Následně byl použit Coxův regresní model pro
stanovení vlivu konkrétních genových variant na přežití a přežití bez kardiální
příhody. Eotaxin 67 G/A a eotaxin -384 A/G byly hodnoceny jako významné pro
přežití, respektive přežití bez kardiální příhody (Tabulka 5 a 6). Multivariantní Coxův
postupný regresní model identifikoval věk, kouření a onemocnění 3 koronárních
tepen (v porovnání s postižením jen jedné tepny) jako nezávislé prediktory úmrtí z
74
jakékoliv příčiny. Spolu s těmito factory byl eotaxin 67 G/A významný prognostický
faktor po přidání do tohoto modelu (Tabulka 7, Graf 3). Pokud byl použit místo
eotaxinu 67 G/A eotaxin -384 A/G, model poskytl podobné výsledky se stejnými
prognostickými factory, avšak hazard ratio bylo poněkud nižší (GG versus GA+AA;
HR = 2.63; 95%CI = 1.19–5.83; 푝 = 0.017)..
0 20 40 60 80 100 120
Survival Time [months]
0,88
0,89
0,90
0,91
0,92
0,93
0,94
0,95
0,96
0,97
0,98
0,99
1,00
CumulativeProportionSurviving[%]
Graf 1: Kaplan-Meierova analýza přežití v souboru pacientů
75
0 20 40 60 80 100 120
Time to Cardiac Event [months]
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
CumulativeProportionSurviving[%]
Graf 2: Kaplan-Meierova analýza přežití bez kardiální příhody
Polymorfismus rs MAF (%) n Distribuce
genotypů
HWE
MMP 13 G/T rs640198 G>T; 0.32 470 220/198/52 Ano
eNOS -786 C/T rs2070744 T>C; 0.37 317 126/148/43 Ano
eNOS 4 a/b VNTR * b>a; 0.19 520 342/159/19 Ano
Eotaxin -426 C/T rs16969415 C>T; 0.07 445 384/56/5 Ano
Eotaxin -384 A/G rs17809012 A>G; 0.48 518 127/281/110 Ano
Eotaxin 67 G/A rs1129844 G>A; 0.15 532 391/125/16 Ano
Tabulka 2. Preselekce kandidátních polymorfismů pro úmrtí, dle log-rank p-hodnot,
polymorfismy zahrnuté v Coxově regresním modelu jsou tučnou kurzívou * VNTR =
variabilní počet tandemových repetic, distribuce genotypů vyjádřena jako dominantní
homozygot, heterozygote, recesivní homozygot, HWE – Hardy-Weinberg equilibrium
76
Polymorfismus n Log rank p
(celkem)
Log rank p
(dominantní)
Log rank p
(recesivní)
MMP 13 G/T 470 0.941 0.811 0.909
eNOS -786 C/T 317 0.200 0.129 0.720
eNOS 4 a/b 520 0.458 0.025 0.419
Eotaxin -426 C/T 445 0.033 0.152 0.175
Eotaxin -384 A/G 518 0.084 0.533 0.050
Eotaxin 67 G/A 532 0.020 0.013 0.210
Tabulka 3. Preselekce kandidátních polymorfismů pro úmrtí podle log-rank p-hodnot. Polymorfismy
zahrnuté v Coxově regresním modelu jsou tučnou kurzívou.
Polymorfismus n Log-rank p
(celkem)
Log-rank p
(dominantní)
Log-rank p
(recesivní)
MMP 13 G/T 470 0.677 0.710 0.526
eNOS -786 C/T 317 0.603 0.959 0.711
eNOS 4 a/b 520 0.937 0.910 0.642
Eotaxin -426 C/T 445 0.922 0.882 0.874
Eotaxin -384 A/G 518 0.009 0.548 0.002
Eotaxin 67 G/A 532 0.098 0.496 0.343
Tabulka 4. Preselekce kandidátních polymorfismů pro kardiální příhody podle log-rank p-hodnot.
Polymorfismy zahrnuté v Coxově regresním modelu jsou tučnou kurzívou.
Model dominantní recesivní aditivní
Polymorphism HR (95%
CI)
p-
value
HR (95%
CI)
p-
value
HR (95%
CI)
p-
value
eNOS 4 a/b NS NS NS NS NS NS
Eotaxin -426
C/T
NS NS NS NS NS NS
Eotaxin -384
A/G
NS NS 2.60
(1.15–
5.87)
0.022 NS NS
Eotaxin 67
G/A
3.36
(1.57–
7.19)
0.0017 NS NS 2.43
(1.39–
4.26)
0.0019
Tabulka 5. Predikce úmrtí pomocí různých modelů dědičnosti, multivariantní Coxova regrese
77
Model dominantní recesivní aditivní
Polymorfismus HR (95%
CI)
p-
value
HR (95%
CI)
p-
value
HR (95%
CI)
p-
value
Eotaxin -384
A/G
NS NS 1.59 (1.20–
2.10)
0.001 1.28
(1.07–
1.54)
0.006
Eotaxin 67
G/A
NS NS NS NS NS NS
Tabulka 6. Predikce kardiální příhody pomocí různých modelů dědičnosti, multivariantní Coxova regrese
Faktor HR (95% CI) P-value
Věk (na 10 let) 2.32 (1.44–3.84) 0.0007
Kouření 3.84 (1.66–8.87) 0.002
Onemocnění 3 tepen vs.
onem. 1 koronární tepny
3.89 (1.15–13.18) 0.029
Onemocnění 2 tepen vs.
onem. 1 koronární tepny
1.32 (0.32–5.55) 0.701 (NS)
Eotaxin 67 G/A (GA+AA vs.
GG)
2.81 (1.35–5.85) 0.006
Tabulka 7. Postupný multivariantní Coxův regresní model pro přežití
Graf 3. Kaplan-Meierova analýza přežití podle 67 G/A genotypu.
78
Oba polymorfismy byly ve významné vazebné nerovnováze, a rizikové alely byly
často děděny společně. V multivariantní postupné regresní analýze kardiálních
příhod byl počet postižených koronárních tepen (dvě vs. jedna : HR=1.86 ; 95% CI =
1.23–2.79; 푝 = 0.003, tři vs. jedna: HR = 4.80; 95% CI = 3.32–6.94; 푝 < 0.001)
jediným nezávislým prognostickým faktorem, přidání polymorfismu -384 A/G
nezměnilo výsledky i když byl tento polymorfismus spojen s vyšším rizikem
kardiálních příhod, neposkytoval lepší prognostickou informaci než počet postižených
tepen. Dále byl u sledovaných polymorfismů hodnocen výskyt vazebné rovnováhy.
Byla zjištěna vazebná nerovnováha mezi polymorfismy −426 C/T and −384 A/G
v promotoru genu pro eotaxin stejně jako −384 A/G a 67 G/A v tom samém genu.
Riziková alela A z 67 G/A byla často děděna společně s rizikovou alelou G z -384
G/A. Naopak polymorfismy – 426 C/T a 367 G/A byly ve vazebné rovnováze.
2.5.3. Diskuse
Bylo publikováno mnoho studií zabývajících se vlivem plasmatických hladin eotaxinu
a variant v genu pro eotaxin na výskyt a závažnost aterosklerozy, ale výsledky jsou
rozporné. Někteří autoři popsali vztah vyšší hladiny eotaxinu k aterosklerotickému
postižení [4-6], další studie ale toto nepotvrdily [7,8]. Vyšší koncentrace eotaxinu byla
zjištěna v krevních vzorcích pacientů s akutním koronárním syndromem [9]. Byl
popsán vliv polymorfismů v genu pro eotaxin u čínských diabetických pacientů [10],
hlavní výsledek byla zvýšená morbidita u pacientů homozygotních pro G alelu v 67
G/A polymorfismu, tato alela je spojena s vyšší produkcí a koncentrací eotaxinu
[11,12 ]. Podobně v naší předchozí studii [2] byla nalezena souvislost GG genotypu a
akutního koronárního syndromu. To je zdánlivě v rozporu se zde prezentovanými
výsledky, kde alela G má spíše protektivní efekt. Avšak v této práci jsou zkoumáni
pouze pacienti s ICHS, kteří podstuoupili koronarografické vyšetření, tedy vysoce
79
selektovaná skupina, a jejich terapie, zvláště farmakoterapie statiny, mohla ovlivnit
výsledky. Byly publikovány práce popisující významnou redukci hladin chemokinů
včetně eotaxinu, a to jak u lidí, tak na zvířecích modelech [13-15]. Protože nosiči
alely A mají nižší hladiny eotaxinu [16], protektivní efekt terapie statiny může být
snížený ve srovnání s GG homozygoty. Tento mechanismus se jeví jako
pravděpodobná příčina i u našich pacientů s ICHS, kde prevalence terapie statiny
byla velmi vysoká (514/532,96.6%).
Na velké studii s 14 916 amerických mužů Zee a kol. [17] zkoumal tento
polymorfismus s odlišnými výsledky. Autoři srovnali údaje od 523 pacientů po infarktu
myokardu a 2092 osob bez kardiovaskulárního onemocnění během sledovacího
období (průměrně 13,2 roku). Popsali, že homozygoti 67AA měli významně vyšší
riziko infarktu myokardu ( OR 1.86; 95% CI 1.15–3.01; p = 0.012), a tento efekt zůstal
i po úpravě na body mass index, hypertenzi, přítomnost diabetu. Nebyly významné
rozdíly mezi GG homozygoty a heterozygoty. I když nebyla popsána léčba pacientů
v této studii, její vliv nelze vyloučit. Recesivní model (AA versus GA+GG) v naší studii
měl relativně nízkou sílu, bylo pouze 16 AA homozygotů. Vazebná nerovnováha mezi
67G/A a −384 A/G musí být rovněž brána v potaz, neboť protektivní a „rizikové“ alely
jsou často děděny současně. Vliv genových variant v genech pro matrix
metaloproteinázu např. MMP-9 [18,19] a MMP-3 [20] na klinické výsledky pacientů
s ICHS byl popsán v předchozích studiích. V naší současné studii nebyl zjištěn vliv
polymorfismu rs640198 v genu pro matrix metaloproteinázu 13 na výskyt
kardiovaskulárních příhod nebo celkovou mortalitu. Podle těchto našich výsledků
můžeme tedy usoudit, že rs640198 polymorfismus pro MMP-13 neovlivňuje celkovou
prognózu pacientů, i když jsme v naší předchozí práci nalezli významnou souvislost
mezi tímto polymorfismem a onemocněním 3 tepen [1]. Postižení 3 koronárních
80
tepen je ale samo o sobě významným prediktorem jak kardiálních příhod, tak
mortality, a vztah gen-prognóza může být ovlivněn taktéž poskytnutou terapií, stejně
jako u eotaxinu. Vztah eNOS polymorfismu a ICHS byl popisován v mnoha studiích.
Velká metaanalýza zahrnující celkem 69 235 subjektů [21] potvrdila souvislost tří
NOS3 polymorfismů (Glu298Asp, −786 T/C, a 4 a/b) s přítomností ICHS, ale žádná
souvislost nebyla nalezena u 4 a/b polymorfismu v subanalýze evropské populace.
Naše studie nenalezla žádnou souvislost mezi −786 T/C a 4 a/b polymorfismy a
prognózou pacientů s ICHS.
Závěrem lze říci, že v této naší práci jsme potvrdili významný vztah mezi alelou A
v 67 G/A polymorfismu v genu pro eotaxin a vyšší mortalitou u pacientů s ICHS i po
korekci na další rizikové faktory. Podobné vliv byl pozorován i u r −384A/G
polymorfismu, který byl spojen i s vyšším výskytem kardiovaskulárních příhod. Jsou
však potřebné další rozsáhlé studie k objasnění této problematiky.
81
2.5.4. Literatura
1) Vasku A., Meluzin J.,Blahak J. et al. Matrix metallo proteinase 13 genotype in
rs640198 polymorphism is associated with severe coronary artery disease, Disease
Markers 2012;33(1):43– 49.
2) Machal J.,Vasku A, Kincl V et al. Association between three single nucleotide
polymorphisms in eotaxin (CCL 11) gene, hexanucleotide repetition upstream,
severity and course of coronary atherosclerosis, Journal of Applied Genetics
2012;53(3):271–278.
3) Kincl V., Vasku A., Meluzin J., Panovsky R, Semenka J, Groch L., Association of
the eNOS 4a/b and -786T/C polymormphisms with coronary artery disease, obesity
and diabetesmellitus, Folia Biologica 2009;55:187–191.
4) E. Emanuele, C. Falcone, A. D’Angelo et al., “Association of plasma eotaxin levels
with the presence and extent of angiographic coronary artery disease,
Atherosclerosis, 2006;186:140–145.
5) D. Raaz-Schrauder, L. Klinghammer, C. Baum et al., “Association of systemic
inflammation markers with the presence and extent of coronary artery calcification.
Cytokine 2012;57:251–257.
6) D. Ardigo, T. L. Assimes, S. P. Fortmann et al., “Circulating chemokines accurately
identify individuals with clinically significant atherosclerotic heart disease.
Physiological Genomics 2007;31:402–409.
7) D.E.Mosedale, D.J.Smith,S.Aitkenetal.,“Circulatinglevels of MCP-1 and eotaxin are
not associated with presence of atherosclerosis or previous myocardial infarction,”
Atherosclerosis 2005;183:268–274.
82
8) F.Canou¨ı-Poitrine,G.Luc,Z.Mallatetal. Systemic chemokine levels, coronary heart
disease, and ischemic stroke events: the PRIME study. Neurology 2011;77:1165–
1173.
9) C. A. Wyss, M. Neidhart, L. Altwegg et al., “Cellular actors, Toll-like receptors,and
local cytokine profile in acute coronary syndromes. European Heart Journal
2010;31:1457–1469.
10) Y. Wang, A. O. Y. Luk, R. C. W. Ma et al. Independent predictive roles of eotaxin
Ala23Thr, paraoxonase 2 Ser311Cys and 훽3-adrenergic receptor Trp64Arg
polymorphisms on cardiac disease in type 2 diabetes—an 8-year prospective cohort
analysis of 1297 patients. Diabetic Medicine 2010;27:376–383
11) H. Nakamura, A.D. Luster, T. Nakamura et al.,“Variant eotaxin: its effects on the
asthma phenotype. Journal of Allergy and Clinical Immunology 2001;108:946–953.
12) T.- N. Wang, W.Chiang, H.-I.Tseng et al. The polymorphisms of Eotaxin 1 and
CCR3 genes influence on serum IgE,Eotaxin levels and mild asthmatic children in
Taiwan. Allergy 2007;62:1125–1130.
13) B. V. Loughrey, A. McGinty, I. S. Young, D. R. McCance, and
L.A.Powell,“Increased circulating CC chemokine levels in the metabolic syndrome
are reduced by low-dose atorvastatin treatment: evidence from a randomized
controlled trial. Clinical Endocrinology 2013;79:800–806
14) W. Wang, W. Le, R. Ahuja, D.Y. Cho, P.H. Hwang, D. Upadhyay. Inhibition of
inflammatory mediators: role of statins in airway inflammation.
Otolaryngology:HeadandNeck Surgery 2011;144:982–987.
83
15) A.A. Zeki, P.Thai, N.J.Kenyon, R.Wu. Differential effects of simvastatin on IL-13induced
cytokine gene expression in primary mouse tracheal epithelial cells.
Respiratory Research 2012;13:article 38.
16) Y. Sheikine, B. Olsen, B. Gharizadeh, K. Jatta, P. Tornvall, M. Ghaderi. Influence
of eotaxin 67G>A polymorphism on plasma eotaxin concentrations in myocardial
infarction survivors and healthy controls. Atherosclerosis 2006;189:458–463.
17) R.Y.L. Zee, N.R.Cook, S.Cheng et al. Threonine for alanine substitution in the
eotaxin(CCL11) gene and the risk of incident myocardial infarction. Atherosclerosis
2004;175:91–94.
18) T.B. Opstad,H.Arnesen, A. A.Pettersen, and I.Seljeflot,“The MMP-9-1562C/T
polymorphism in the presence of metabolic syndrome increases the risk of clinical
events in patients with coronary artery disease. PLoS ONE, vol. 9, no. 9, Article ID
e106816,2014.
19) T. B. Opstad, A. ˚A. Pettersen, H. Arnesen, I. Seljeflot, “The co-existence of the
IL-18 +183 A/G and MMP-9 -1562C/T polymorphisms is associated with clinical
events in coronary artery disease patients. PLoS ONE, vol. 8, no. 9, Article ID
e74498,2013.
20) S. Humphries, C. Bauters, A. Meirhaeghe, L. Luong, M. Bertrand, P. Amouyel.
The 5A 6A polymorphism in the promoter of the stromelysin-1 (MMP3) gene as a risk
factor for restenosis. European Heart Journal 2002;23:721–725.
21) H.Rai,F.Parveen,S.Kumar,A.Kapoor, N.Sinha. Association of endothelial nitric
oxide synthase gene polymorphisms with coronary artery disease: an updated metaanalysis
and systematic review. PLoSONE 2014;vol.9, no.11, Article ID e113363.
84
3. Abstrakt/shrnutí
Tato klinicky-experimentální práce přináší souhrn analýz vybraných genových
polymorfismů a jejich vztahu k ICHS u relativně rozsáhlého souboru subjektů, kde byl
zkoumán vztah genotypů a klinického nálezu. U zkoumaných polymorfismů pro
endoteliální NO syntázu se nepotvrdil jejich vztah k výskytu nebo závažnosti ICHS.
S rozsahem ICHS ve smyslu počtu postižených tepen souvisí polymorfismy
(GAAGGA)n hexanukleotidové opakování v genu pro eotaxin a rs640198
polymorfismus v genu pro MMP-13. U polymorfismu 67 G>A genotypu GG
eotaxinového genu byl prokázán významný vztah k výskytu akutních koronárních
syndromů. Na popisné studie navázala studie se sledováním vztahu klinických příhod
a genotypů u stejných pacientů, což představuje relativně ojedinělou koncepci a
možnou další perspektivu geneticko-klinických studií. V této následné studii byl u
pacientů s ICHS prokázán vliv na mortalitní prognózu u 67 G/A polymorfismu v genu
pro eotaxin.
Tato práce potvrzuje teorii, že ischemická choroba srdeční je multifaktoriální
onemocnění, kde se vliv genetických predispozic vzájemně doplňuje s dalšími
rizikovými faktory a může být i významným faktorem podporujícím rozvoj
aterosklerozy což v konečném důsledku vede k progresi aterosklerotických lézí až do
stadia hemodynamicky významných stenoz v koronárním řečišti.
85
4. Abstract
Background: this work is summary of several studies of selected genetic
polymorphisms and laboratory markers and their relation to coronary artery disease.
Patients and methods: Over 1200 patients referred to coronary angiography (final
numbers are different in each study) were comprised into studies. The blood samples
were colected, and analysis of selected DNA polymorphisms (eNOS -786 C/T, 4 a/b;
MMP 13 G/T; eotaxin -426C/T, -384 A/G, 67 G/A, (GAAGGA)n hexanucleotide
repetition) was performed.
Results: There was not significant association of tested eNOS polymorphisms to
presence or extend of CAD. The extend od CAD by means of number of affected
coronary arterie sis related with GAAGGA)n hexanucleotide repetition in eotaxin
gene and MMP 13 G/T in matrix metalloproteinase gene. There was found significant
association of acute coronary syndromes and GG genotype of eotaxin 67 G/A
polymorphisms. The descriptive studies were replenished by one follow-up study with
assessment of the relation of clinical events and genotypes in same patients. In this
study was found significant relation of 67 G/A eotaxine polymorphism and mortality.
Conclusion: This work confirms a multi-factorial origin of coronary artery disease, the
influence of genetic predispositions is mutual with traditional risk factors and also
may be a significant factors supporting occurence of atherosclerotic lesions.
86
5. Originály publikovaných prací