MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ LÉKAŘSKÁ FAKULTA Vývoj a podíl klinické embryologie v programu asistované reprodukce HABILITAČNÍ PRÁCE komentovaný soubor prací Brno, 2014 RNDr. Jana Žáková, Ph.D. 2 PODĚKOVÁNÍ Práce vznikla na základě mé mnohaleté činnosti v embryologické a andrologické laboratoři Centra asistované reprodukce Gynekologicko - porodnické kliniky LF MU a FN Brno. Upřímně děkuji přednostovi Gynekologicko – porodnické kliniky LF MU a FN Brno a vedoucímu Centra asistované reprodukce prof. MUDr. Pavlu Ventrubovi, DrSc., MBA, za jeho dlouholeté vedení, spolupráci, podporu, důvěru ve výsledky mé laboratorní práce a cenné rady a připomínky k rukopisu této práce. Poděkování patří i celému kolektivu Centra asistované reprodukce. Děkuji také doc. MUDr. Igoru Crhovi, CSc. a doc. MUDr. Martinu Huserovi, Ph.D. za tvůrčí spolupráci. Dále pak bývalým i současným spolupracovnicím z embryologické a andrologické laboratoře, zvláště Ing. Evě Lousové a Bc. Haně Pochopové. Ráda bych poděkovala své rodině za podporu, trpělivost a pochopení pro moji práci. 3 OBSAH ÚVOD…………………………………………………………………………………...……. A. PŘEHLED PROBLEMATIKY PŘED OBDOBÍM INOVAČNÍCH PŘÍSTUPŮ ......... B. CÍLE PRÁCE……………………………………………………………………..………. C. ZPŮSOB ZPRACOVÁNÍ……………………………………………………………........ D. METODY KLINICKÉ EMBRYOLOGIE Z OBDOBÍ INOVAČNÍCH PŘÍSTUPŮ A PŘÍTOMNOSTI ……………………………………………………………………...… 1. Kultivace gamet a embryí……………………………………………………………….… 1.1. Kultivační podmínky………………………………………………………………….….. 1.2. Prodloužená kultivace embryí metodou kokultivace…………………………………….. 1.3. Média pro prodlouženou kultivaci embryí……………………………………….………. 2. Mikromanipulační techniky………………………………………………………….….. 2.1. Fertilizační techniky…………………………………………………………………........ 2.1.1. Techniky získání spermií z nadvarlete a varlete………………………………….……. 2.1.2. Zpracování spermií při retrográdní ejakulaci …………………………………………. 2.2. Asistovaný hatching u embryí …………………………………………………………... 2.3. Biopsie buněk ………………………………………………………………………….... 3. Kryokonzervace gamet, embryí a tkání……………………………………………….... 3.1. Kryokonzervace spermatu a testikulární tkáně………………………………………….. 3.1.1. Kryokonzervace spermatu u partnerů IVF pacientek a zdravých mužů………………. 3.1.2. Kryokonzervace spermatu dárců a spermabanka…………………………………….... 3.1.3. Kryokonzervace spermatu u onkologických pacientů………………………………… 3.2. Kryokonzervace embryí…………………………………………………………………. 3.3. Kryokonzervace oocytů…………………………………………………………………. 3.4. Kryokonzervace ovariální tkáně jako ochrana fertility………………………………….. 4. Hodnocení kvality gamet a embryí…………………………………………………….... 4.1. Hodnocení kvality oocytů a spermií……………………………………………………... 4.2. Hodnocení kvality embryí……………………………………………………………….. 4.2.1. Kontinuální monitoring vývoje embryí………………………………………………... 5. Perspektivy klinické embryologie a vývoj moderních metod………………………….. 6. Data z evropského a českého registru………………………………………………….... 5 8 10 11 12 13 13 17 21 45 45 50 53 54 56 86 89 90 91 93 95 98 100 172 172 180 185 203 205 4 E. DISKUSE………………………………………………………………………...…..….... F. ZÁVĚR …………………………………………………………………………...…….… G. PUBLIKACE AUTORKY ZAŘAZENÉ V TEXTU …………………………...….…. H. SEZNAMY…………………….………………………………………………….......…. 1. Seznam řešených grantů …………………………………….…………………………. 2. Seznam zkratek……………………………….……………………………….…………. 3. Seznam obrázků………………………………………….………………………...……. 4. Seznam tabulek.…………………………………………….………………………..….. I. LITERATURA……………………………………………………..……….……….....…. J. SOUHRN……………………………………………………………..……………..….…. K. SUMMARY…………………………………………………………..…………..…….... 206 209 212 215 215 216 218 220 221 232 234 5 ÚVOD V posledních třiceti letech přinesla reprodukční medicína řadu úspěchů v léčbě neplodných párů. Jejich počet stále narůstá a ve společnosti je jich v současné době 15 až 20 %. Z dříve téměř tabuizovaného tématu se poruchy plodnosti staly celospolečenskou a často diskutovanou záležitostí, neboť nejsou jen problémem zdravotním, ale i socioekonomickým. Veřejnost se stále častěji setkává s pojmy reprodukční medicína a asistovaná reprodukce (AR). Narození Luise Brownové v roce 1978 v Anglii, prvního dítěte po technice in vitro fertilizace a embryotransferu (IVF/ET), bylo průlomovým bodem v léčbě neplodnosti a výsledkem mnohaletého výzkumu, úsilí a píle, v jehož čele stáli embryolog Robert Edwards (obr. 1) a gynekolog Patric Steptoe [90]. Mimotělní oplození vajíčka a přenos embrya do dělohy se tak dostaly z výzkumných laboratoří do klinické praxe. Postupem doby následoval rozvoj v celosvětovém měřítku a byla vyvinuta řada dalších technik a metod, které jsou souhrnně nazývány metodami nebo technikami asistovaná reprodukce (ART). V roce 2010 byly zásluhy profesora Edwardse oceněny udělením Nobelovy ceny za fyziologii a medicínu. Porodu prvního dítěte za pomoci metod asistované reprodukce v České republice bylo dosaženo již v roce 1982 na I. gynekologicko – porodnické klinice LF MU v Brně ve Fakultní porodnici na Obilním trhu [71]. Šlo o první porod v bývalém Československu i střední a východní Evropě, který byl dosažený metodou transferu vajíček a spermií do vejcovodu během mikrochirurgického výkonu. Tato brněnská modifikace „IVF“ vycházející z improvizovaných podmínek byla v roce 1984 zavedena do literatury pod názvem GIFT (Gamete IntraFallopian Transfer) [3] a o dalších několik roků později uznána světovou prioritou. Našemu pracovišti se dařilo i nadále udržet kontakt se světem. Prvního porodu po klasickém IVF/ET, tedy metodě oplození oocytu mimo organismus ženy, kultivaci in vitro a následném embryotransferu, zde bylo dosaženo v roce 1984 [72]. Pracovníci Gynekologicko – porodnické kliniky v Brně na Obilním trhu (prof. Zdeněk Čupr, prof. Ladislav Pilka a následně prof. Pavel Ventruba) se věnovali diagnostice a léčbě neplodnosti již od 70. let 20. století. S rozšiřováním klinických poznatků a praktickými zkušenostmi s léčbou neplodnosti novými preparáty na ovariální stimulaci a zvláště s rozvojem laboratorních metod od 90. let 20. století, byla od této základní metody odvozena a vyvinuta řada dalších postupů. Tyto techniky, které vyžadují bezprostřední in vitro manipulaci se zárodečnými buňkami a embryi, přispěly k léčbě poruch plodnosti páru téměř ve všech faktorech sterility - tubární, nevysvětlitelné a imunologické, 6 endometriózy, při snížené plodnosti muže či v případech vyžadujících darování gamet. Od roku 1989 pracuje autorka v embryologické laboratoři centra, kde se narodilo „první české dítě ze zkumavky“. Dostala tak příležitost být na pracovišti, které se kromě praktické činnosti zabývalo a trvale zabývá i vědecko-výzkumnou stránkou léčby neplodnosti a vývojem technologií dostupných v tehdejších podmínkách. Právě zde a v této době se ruku v ruce s gynekologickou částí asistované reprodukce začala dynamicky rozvíjet i stránka laboratorní. Autorka se účastnila a přispěla vlastní prací k zavádění nových metod, jako byla optimalizace kultivačních podmínek, prodloužení délky kultivace embryí in vitro za hranici 48 hodin, hodnocení kvality gamet a embryí. Zaváděla mikromanipulační techniky, které primárně sloužily k řešení andrologického faktoru sterility a které se později začaly používat i pro další účely. Díky mikromanipulacím se rozvíjela významná oblast preimplantační genetické diagnostiky. Hledaly se stále efektivnější postupy kryokonzervace a uchování zmrazeného biologického materiálu. Na základě fungující kryokonzervace byla založena vlastní spermabanka pracoviště a byly rozvinuty programy dárcovství gamet a embryí i program ochrany fertility u onkologicky nemocných. Tyto zaváděné postupy a metody jsou národními prioritami a byly postupně zaváděny na nově vznikajících centrech asistované reprodukce v České republice. Veškerá činnost je trvale vedena snahou celého kolektivu Centra asistované reprodukce Gynekologicko – porodnické kliniky LF MU a FN Brno, poskytovat svým pacientům ty nejmodernější postupy a metody, které jsou v danou dobu možné, a být tak svojí kvalitou pracovištěm srovnatelným s předními evropskými a světovými pracovišti. Obor klinická embryologie existuje v České republice prakticky již 30 let. Avšak oficiálně byl zřízen „Nařízením vlády č. 31/2010 Sb. ze dne 11. ledna 2010 o oborech specializačního vzdělávání a označení odbornosti zdravotnických pracovníků se specializovanou způsobilostí“. Klinická embryologie se zabývá diagnostickými a léčebnými výkony s lidskými zárodečnými buňkami a embryi, je náročná na kvalifikaci a na manuální zručnost pracovníků. Úzce spolupracuje s gynekology – reprodukčními specialisty při léčbě poruch plodnosti. Praktické zaměření oboru a praktické kompetence embryologů jsou určeny ve Vyhlášce č. 55/2011 Sb. ze dne 1. března 2011 o činnostech zdravotnických pracovníků a jiných odborných pracovníků. 7 Postupy prováděné v embryologické laboratoři proto nazýváme metodami a technikami klinické embryologie. Obr. 1: Osobní setkání autorky s nositelem Nobelovy ceny, prof. Robertem Edwardsem 8 A. PŘEHLED PROBLEMATIKY PŘED OBDOBÍM INOVAČNÍCH PŘÍSTUPŮ Období 1978 až 1990 můžeme nazvat pionýrským obdobím IVF, kdy zvláště entusiasmus vytvářel realitu ze snů a nemožné dělal možným. První úspěch Edwardse a Steptoa v roce 1978 byl teprve start, přestože byl podpořený již desetiletími intenzivního výzkumu na zvířatech a také na člověku. Vytvořit novou vědu a udělat z IVF oblast humánní medicíny s odpovídající účinností a trvalými výsledky, vyžadovalo vysoce kreativní týmy silných, pracovitých a nezávislých kliniků a embryologů. Před kliniky a embryology stála obrovská výzva nejen ze strany psychologických a morálních bariér. Se zaváděním nových metod byly spojeny také problémy technického rázu, neboť nebyly žádné dostupné přístroje a pomůcky. Pro laboratoř bylo nutno vyvinout kultivační zařízení a zvládnout náročnou přípravu kultivačních médií, o což se velkou měrou zasloužil prof. Trávník [95, 97]. Své místo měla vlastní výroba punkčních souprav pro odběr oocytů a transferových souprav z upravených jehel a teflonových hadiček. V embryologické laboratoři se provádělo několik základních úkonů. Zpracování spermií pro intrauterinní inseminace nebo oplozování oocytů. Vlastní oplozování oocytů se provádělo přidáním vypočteného množství spermií do zkumavky s oocyty v kultivačním médiu [94]. V případech andrologického faktoru neplodnosti, při snížených parametrech spermiogramu partnera, bylo jedinou pomocí použití spermatu dárce. Vzhledem k možnostem kultivačního systému a kvalitě kultivačních médií, která nebyla ještě tak dokonalá, byla kultivace in vitro omezena maximálně na 48 hodin. Po této době byla embrya již transferována do dělohy. Své využití postupně nacházela i kryokonzervace spermií a časných embryí. Techniky kryokonzervace se vyvíjely z kryokonzervačních technik používaných a ověřených u zvířat [100, 116]. Klinický mezník umělého oplození spočíval v hormonální stimulaci ovarií pacientek [19, 47], neboť první dosažená těhotenství pocházela z nestimulovaných cyklů. Rozvoj ultrazvukové technologie umožnil nahradit laparoskopický odběr oocytů [61, 103] jednodušším odběrem transvaginálním, prováděným pod kontrolou ultrazvuku [104]. I v této metodě patří naše centrum ke světovým průkopníkům. Transfer embryí se postupně přestal provádět chirurgickou cestou a byl nahrazen vaginálním přístupem. 9 V roce 1985 byla v Bonnu odborníky zabývajícími se touto problematikou ustavena European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE), která začala pravidelně pořádat sympozia, praktické kurzy, výroční setkání. Od roku 1986 vydává vlastní časopis Human Reproduction. Díky těmto aktivitám došlo k rychlejší aplikaci nových poznatků do praxe. Nové technologie se začaly rozvíjet nejen díky novým praktickým a vědeckým poznatkům, ale také díky vývoji přístrojů, nástrojů, laboratorních pomůcek a médií a jejich komerční dostupnosti. Asistovaná reprodukce se od roku 1990 stala uznávaným mezioborovým odvětvím lidské medicíny, ve kterém spolupracují odborníci z oblasti gynekologie, embryologie, genetiky, urologie, andrologie, endokrinologie, molekulární biologie, psychologie, sociologie i výpočetní techniky. 10 B. CÍLE PRÁCE Cílem habilitační práce je podat přehled o nejvýznamnějších metodách a technikách klinické embryologie, jejichž zavádění, rozvoj a praktické využití autorka sama v embryologické laboratoři prováděla. Autorka si je vědoma, že není možné zahrnout do jedné práce všechny dostupné informace a dosažené výsledky. Neklade si za cíl předložit kompletní a podrobný přehled všech metod a technik klinické embryologie. Práce vychází ze zveřejněných publikací a grantových úkolů řešených na jednotlivá témata na pracovišti asistované reprodukce Gynekologicko – porodnické kliniky LF MU a FN Brno. Cílem práce je rozebrat metody a postupy tak, jak v léčebném procesu na sebe navazují, případně k jakému dalšímu využití jsou vhodné: 1. Kultivace gamet a embryí Popsat způsoby hodnocení kultivačních podmínek (studiem ultrastruktury buněk). Uvést vývoj metod prodloužení délky kultivace embryí in vitro za hranici 48 hodin (společná kultivace embryí s lidskými oviduktálními buňkami, syntetické médium) a jejich zavedení do praxe. 2. Mikromanipulační techniky Podat přehled o zavádění mikromanipulačních technik a jejich využití v asistované reprodukci. Fertilizační techniky, technika asistovaného hatchingu u embryí a biopsie buněk pro preimplantační genetickou diagnostiku. 3. Kryokonzervace gamet, embryí a zárodečných tkání Seznámit se zavedením kryokonzervačních technik. Uvést možnosti využití kryokonzervace buněk a tkání pro léčbu neplodnosti, v programu dárcovství, pro účely ochrany fertility onkologických pacientů a pro využití do budoucna. 4. Hodnocení kvality gamet a embryí Uvést způsoby a možnosti hodnocení kvality oocytů, spermií a embryí. Seznámit s využitím a výhodami kontinuálního monitorování vývoje při hodnocení kvality embryí. 11 C. ZPŮSOB ZPRACOVÁNÍ Členění habilitační práce do jednotlivých kapitol odpovídá příslušným laboratorním technikám. V každé kapitole je kromě teoretického přehledu dané problematiky zahrnuta část, která vychází z praktických výsledků naší práce. Tato část je potom členěna na úvod, materiál a metodiku, výsledky a závěr. Text práce vychází z 23 publikovaných prací autorky, které se k danému tématu vážou a jsou za příslušnou kapitolu zařazeny. Publikace jsou označeny římskými číslicemi I až XXIII. Seznam všech komentovaných publikací autorky zařazených v textu je uveden na str. 212 - 214. „Závěr“ habilitační práce shrnuje nejdůležitější výsledky a poznatky ze všech kapitol. „Literatura“ uvádí citace z jednotlivých kapitol, komentovaných publikací i zásadní citace z přiložených publikací, a to abecedně dle jména prvního autora. Formální úprava citací se řídí ČSN ISO 690. Fotografie zařazené v textu jsou dílem autorky této práce. Autorem fotografií (obr. 4, 5, 6) je doc. MUDr. M. Sedláčková, CSc., Ústav histologie a embryologie LF MU Brno. 12 D. METODY KLINICKÉ EMBRYOLOGIE Z OBDOBÍ INOVAČNÍCH PŘÍSTUPŮ A PŘÍTOMNOSTI Metody asistované reprodukce (AR) jsou prováděny ve vzájemné součinnosti a návaznosti klinické a embryologické části. Klinická část řeší kontrolovanou stimulaci vaječníků, načasování odběru oocytů nebo intrauterinní inseminace, vlastní odběr oocytů a transfer embryí do dělohy. Embryologická část obnáší veškeré manipulace s oocyty a spermiemi od jejich získání, metody oplozování oocytů, dále kultivaci, manipulace a hodnocení embryi in vitro až po předání embrya/í k transferu do dělohy a kryokonzervaci gamet a embryí. V klinické oblasti AR se od 90. let 20. století řešily a vyvíjely postupy pro získání co největšího počtu kvalitních oocytů. Vedle stimulace růstu oocytů bylo nutné zajistit i kontrolu ovulace, prevenci jejího předčasného nástupu a uvolnění vajíček z vaječníku. Úspěšnost léčby byla optimalizována individuálním přístupem k ovariální stimulaci u každé ženy a s ohledem na klíčové momenty, jako je výběr vhodného stimulačního protokolu, správné přizpůsobení dávek gonadotropinů, aby nedošlo k rozvoji hyperstimulačního syndromu a individuální načasování podání hCG. Gonadotropiny pro stimulaci prošly vývojem od urinárních hMG (FSH + LH) přes čištěné po rekombinantní FSH a rekombinantní LH. K zabránění předčasnému peaku LH, a tím mnohdy zrušení celého výkonu, se začaly využívat GnRH analoga. V průběhu vývoje a zavádění nových a modernějších preparátů byly postupně modifikovány stimulační protokoly (ultrakrátký a krátký protokol, dlouhý protokol z folikulární fáze, dlouhý protokol z luteální fáze a protokol s antagonisty GnRH), které mohly být přizpůsobeny pacientkám podle věku, kvality ovariální odpovědi na stimulaci, ovariální rezervě a dalším faktorům. [107, 109]. Samostatnou otázkou je nativní, přirozený cyklus, kdy se nepoužívají žádné hormonální léky k ovariální stimulaci. Využívá se přirozené ovulace. V embryologické laboratoři centra AR se od 90. let 20. století odehrála řada revolučních změn zavedením nových metod a zakoupením moderních přístrojů. Na počátku bylo hledání způsobů, jak zkvalitnit kultivační podmínky pro gamety a embrya. Následoval rozvoj do té doby nepoužívaných mikromanipulačních technik, vázaných na technicky složité a finančně náročné přístroje. Zavedení kryokonzervačních metod a ověření jejich spolehlivosti dalo vzniknout programu dárcovství spermií, embryí a programu ochrany fertility. Trvalý zájem se 13 soustřeďoval také na hledání způsobů jak spolehlivěji a pregnantněji hodnotit kvalitu gamet a zvláště potom vzniklých embryí. 1. KULTIVACE GAMET A EMBRYÍ Při práci s gametami a embryi in vitro je nejdůležitějším předpokladem vhodné kultivační prostředí. Je představováno CO2 inkubátorem, který zajišťuje plynné složení, teplotu a vlhkost. Dále tekutým kultivačním médiem saturovaným plynnou fází, v níž jsou jednotlivé plyny zastoupeny příslušnými parciálními tlaky a nádobkami (zkumavky, misky) v nichž jsou gamety a embrya umístěna. Používaná kultivační média byla připravována na pracovišti. V co nejdokonaleji čisté vodě po chemickém odstranění nečistot a redestilaci [96] byly rozpuštěny jednotlivé chemikálie a další složky média. Základem médií byl hydrogenkarbonátový pufr. Dalšími složkami byly kationty a anionty v koncentraci obdobné jako v krevním séru s dodržením osmotické koncentrace asi 280 mmol/l. Jako zdroj energie pro embryo byl přidáván pyruvát a laktát a pro spermie glukóza. Lidský nebo hovězí sérový albumin sloužil jako zdroj bílkovin. Pro zabránění mikrobiální kontaminace ze vzduchu nebo biologického materiálu se přidával penicilin a streptomycin. Fenolová červeň se používala jako indikátor pH. Sterilizace média byla prováděna přetlakovou filtrací přes miliporový filtr [23]. V 90. letech jsme používali Earlovo médium (Sigma), které bylo dostupné v podobě prášku a rozpouštělo se v redestilované vodě. Postupně byla na trh uváděna média firem MediCult (Dánsko), Scandinavian IVF Science dnešní Vitrolife (Švédsko), COOK (Austrálie), SAGE (USA) a další. Rychlým vývojem procházely CO2 inkubátory. Od nejjednoduššího inkubátoru (fy Labotect), který jsme používali v 90. letech 20. století jsme postupně přecházeli k dokonalejším CO2 inkubátorům s elektronicky nastavitelnými hodnotami teploty a koncentrace CO2 ve vzduchu, firem Heraeus, Binder (obr. 2) a Sanyo (obr. 3). 1.1. Kultivační podmínky V letech 1995 až 1996 jsme se zabývali studiem našich kultivačních podmínek, jejichž kvalitu jsme hodnotili zprostředkovaně přes kvalitu buněk cumulus oophorus z komplexu oocytcumulus oophorus po oplození lidského oocytu in vitro. Řešili jsme grantový úkol I. kategorie IGA MZ ČR č. 2703-2 „Vztahy mezi buňkami cumulus oophorus a časným embryem při 14 kultivaci in vitro“ [123]. Prostředí pro oplození oocytů a vývoj časných embryí se odlišuje od podmínek in vivo zejména v tom, že probíhá vždy při vyšší koncentraci kyslíku. Vývoj za těchto podmínek může vést k vyšší koncentraci kyslíkových radikálů a reaktivních formací kyslíku. Produkce ROS (reactive oxygen species) může být vyvolána kultivačním prostředím nebo mohou být jejich zdrojem buňky cumulus oophorus, oocyty a spermie. Vysoké hladiny ROS, zejména superoxidu Obr. 2: CO2 inkubátor Binder pro kultivaci embryí Obr. 3: CO2 inkubátor Sanyo pro kultivaci embryí 15 a peroxidu vodíku, v kultivačním prostředí mohou být jednou z možných příčin selhání fertilizace in vitro, fragmentace embryí a narušení až zástavy embryonálního vývoje. V letech 1999 až 2001 jsme se věnovali studiu peroxizomů [92], peroxidázové aktivity a detekci zdrojů peroxidu vodíku v kultivačním systému [83, 84, 91]. Řešili jsme grantový úkol IGA MZ ČR č. 5164-3 „Identifikace peroxisomů a jejich úloha v eliminaci poškození lidských zárodečných buněk kyslíkovými radikály při in vitro fertilizaci“ [127]. V průběhu kultivace jsou kumulární buňky obklopující oocyt kultivovány společně s oocytem 20 hodin od inseminace. Poté jsou od oocytu mechanicky odstraňovány, aby bylo možno zjistit, zda jsou přítomna prvojádra a oplození bylo úspěšné. Kumulární buňky se stávají v tuto dobu již odpadním materiálem. Byly použity jako studijní materiál a zpracovány pro elektronovou mikroskopii. Na základě posouzení jejich ultrastruktury i ultrastruktury spermií ve vzorcích obsažených jsme usuzovali na kvalitu kultivačních podmínek. Analýza submikroskopické stavby buněk napomohla rovněž určit pravděpodobné možné příčiny selhání oplození. Výsledky studia kumulárních buněk jsou dokumentovány v Publikaci I a Publikaci II. Materiál a metodika: Odebrané buňky cumulus oophorus byly zpracovány pro elektronově mikroskopické vyšetření. Byly fixovány glutaraldehydem s přídavkem kyseliny tříslové a postfixovány osmiumtetroxidem a uranylacetátem. Po odvodnění vzestupnou řadou alkoholů byly zality do Durcupanu ACM. Kontrastované ultratenké řezy byly krájeny na ultramikrotomu LKB. Pozorování a fotografování bylo prováděno v elektronovém mikroskopu Tesla BS 500 na Ústavu histologie a embryologie LF MU v Brně [126]. Na základě výsledků oplození byl materiál od pacientek rozdělen do 3 skupin na buňky od neoplozených oocytů, buňky od oplozených oocytů (bez těhotenství) a buňky od oplozených oocytů (s těhotenstvím) [121]. Byla hodnocena i kvalita spermií na základě jejich ultrastruktury [124]. Byly vyšetřeny vzorky kumulárních buněk se spermiemi. Počet spermií v jednotlivých vzorcích byl různý, většinou 20 až 50 průřezů hlavičkou a dvojnásobný počet průřezů bičíkem v jednom vzorku. Výsledky: 1. Většina nálezů svědčila pro velmi dobrou kvalitu kultivačního prostředí. Převaha buněk byla aktivních, obsahujících jádro s jemně rozptýleným chromatinem a bohatě zastoupené 16 organely (obr. 4, 5). Obr. 4: Buňka cumulus oophorus preovulačního ooytu, světlé jádro (N), v cytoplazmě bohatá organelová výbava. Lipidové kapky (l), extracelulární matrix (ECM). Foto: Sedláčková, zvětšení: 6 400 x Obr. 5: Část buňky cumulus oophorus od oplozeného oocytu. Mitochondrie s tubulózními kristami (M). Foto: Sedláčková, zvětšení: 23 000 x 17 2. Byly hodnoceny spermie z mezibuněčných prostorů kumulu i spermie, které penetrovaly do folikulárních buněk. Ultrastruktura buněk i spermií byla dobře zachována, což svědčilo o dobré kvalitě kultivačních podmínek (obr. 6). 3. Selhání fertilizace ve skupině neoplozených oocytů bylo patrně v důsledku nepřiměřené zralosti oocytů, značná část selhání byla způsobena sníženou kvalitou spermií. Obr.6: Spermie bez zjevných anomálií. Hlavička s intaktním akrozomem ( →), kondenzovaný jaderný chromatin (N), střední oddíl (SO). Foto: Sedláčková, zvětšení 15 300 x Závěr: Na základě rozsáhlého a podrobného studia ultrastruktury buněk cumulus oophorus a spermií ve vzorcích obsažených, jsme se přesvědčili, že náš kultivační systém má vyhovující podmínky pro úspěšnou kultivaci gamet a embryí. 1.2. Prodloužená kultivace embryí metodou kokultivace Za klasickou kultivaci považujeme dobu 48 až 50 hodin od oplozování oocytů, kdy vyvíjející se embrya dosahují stádia 2 až 4 buněk. V tomto stádiu ještě nejsme schopni rozlišit embrya s lepší nebo horší schopností se dále vyvíjet, neboť aktivace embryonálního genomu nastává ve fázi 6 až 8 buněk. Kultivační média dostupná v 90. letech 20. století svým složením neposkytovala 18 embryím podmínky pro dlouhodobější vývoj, proto byla transferovaná v maximálně 4 buněčném stádiu. Jako první v České republice jsme na našem pracovišti hledali způsob, jak optimalizovat kultivační prostředí, abychom mohli prodloužit délku kultivace. V dosažení embryí vyšších vývojových stádií jsme viděli potenciál, jak zvýšit úspěšnost programu IVF. V letech 1994 až 1995 jsme řešili grantový úkol IGA MZ ČR č. 1820-2 “Optimalizace in vitro fertilizace kokultivací embryí s lidskými tubárními epiteliemi” [108]. Vyšli jsme ze zahraničních prací, kdy embrya kultivovali společné se somatickými buňkami. Tento způsob prodloužení délky kultivace embryí byl nazván jako kokultivace. Kokultivace embryí v klinické IVF byly založeny na přijetí postulátů, že běžně používaná média byla suboptimální pro humánní preimplantační embryogenezi, a že monolayer buněk může vytvářet podobné biochemické a biofyzikální podmínky jaké má embryo ve vejcovodu a v děloze. Kulturou somatických buněk mohou být vytvářeny embryotrofické faktory, které pomáhají embryogenezi in vitro a buňky mohou detoxifikovat médium tím, že odstraňují kationty těžkých kovů nebo metabolické inhibitory. Kokultivace byly nejprve prováděny u zvířat [27, 67, 81]. Pro kokultivace byly testovány různé druhy monovrstev, např. luteinizované granulózové buňky [73], kožní fibroblasty [115], lidské oviduktální buňky [9], opičí Vero buňky [58] a další. Na našem pracovišti jsme pro kokultivaci s embryi zvolili lidské tubární epitelie. Jejich získávání, výběr dárkyň, příprava monovrstvy a první výsledky jsou popsány v pracech Žákové [119] a Ventruby [105, 109]. Vycházeli jsme z předpokladu, že podmínky vývoje embrya při kultivaci na tubárních epiteliích by měly být ze všech systémů nejoptimálnější, neboť buňky budou svým metabolismem a sekrecí příznivě ovlivňovat časná embrya, jako kdyby procházela tubou in vivo. Téma je zpracováno v Publikaci III a Publikaci IV. Materiál a metodika: Příprava tkáňové kultury znamenala samostatnou přídatnou, časově náročnou technologii. S její přípravou jsme začali na podzim 1993 a využívání kokultivací v klinické praxi bylo započato v březnu 1994. V toto období bylo nutné stanovit postup při výběru a vyšetření dárkyň 19 a zvládnout techniku odběru materiálu. Přípravu primokultury tubárních epitelií (obr. 7) z vejcovodů získaných při hysterektomiích, subkultivaci tubárních epitelií a kontrolu kvality pro nás zajišťovali pracovníci Biologického ústavu LF MU Brno. Kritéria pro výběr dárkyň: - preklimakterium - absence zánětu nebo neoprocesu v organismu - negativní serologické vyšetření na HIV I, II, HBsAg, HCV, BWR, ALT - dobrý zdravotní stav - zopakování serologie po 6 měsících od prvního odběru Příprava monolayeru: Tubární epitelie byly z vejcovodu získány mechanickým zpracováním a trypsinizací. Buňky byly nasazeny do kultivačních lahví a kultivovány při 37°C v atmosféře 5 % CO2 ve vzduchu po dobu 4 až 6 dnů do vytvoření primární kultury. Druhá pasáž byla získána trypsinizací primární kultury. Namnožené buňky byly zamrazeny a uchovány do opakovaného serologického vyšetření. Teprve po půl roce od prvního odběru, po negativních serologických výsledcích dárkyň, byly buňky použity k vytvoření monolayerů pro kultivaci. Kultivace gamet a embryí: V embryologické laboratoři jsme na Petriho misky s připravenou monovrstvou a Earlovým médiem (Serva) přenesli zygoty (24 hodin po odběru oocytů). Kokultivace probíhala dále buď 48 hodin (celkem 72 hodin) nebo 72 hodin (celkem 96 hodin). Výsledky: 1. Přípravu buněk na kokultivaci a kokultivace embryí s lidskými oviduktálními buňkami jsme prováděli od konce roku 1993 do února 1996. 2. V roce 1995 jsme publikovali počáteční soubor s kokultivací u 14 pacientek. Více než 8 buněčného stádia dosáhlo 64,6 % embryí, byla dosažena 4 těhotenství, což činilo 28,6 % klinických gravidit/ET, tj. 28,6 % pregnancy rate (PR). 3. Výsledky většího souboru, které jsme publikovali v roce 1996 uvádějí 104 pacientek s embryi po kokultivaci. Ze získaných 482 oocytů se více než polovina (53,1 %) embryí 20 vyvinula do více než 8 buněčného stádia. U 76 žen s provedeným embryotransferem bylo dosaženo 15 klinických těhotenství, tj. 19,4 % PR. 4. Poprvé jsme technikou prodloužené kultivace dosáhli in vitro stádia blastocysty (obr. 8). 5. První porod po transferu tří embryí ve stádiu moruly proběhl v roce 1994. Obr. 7: Monovrstva tubárních epitelií, zvětšení: 400 x Obr. 8: Blastocysta a neoplozený oocyt na na monovrstvě tubárních epitelií, zvětšení: 250 x 21 Závěr: Prokázali jsme příznivý vliv prodloužené kultivace na vývoj embryí in vitro. Embrya dosahovala vývojových stádií 8 a více buněk, moruly a blastocysty s dobrou morfologickou kvalitou. Metoda kokultivace byla v té době prvním možným řešením jak prodloužit dobu kultivace embryí in vitro až do 120 hodin. 1.3. Média pro prodlouženou kultivaci embryí Naše pracoviště bylo jedním z prvních center asistované reprodukce na světě, které začalo využívat v roce 1994 pro prodlouženou kultivaci i plně definovaného syntetického média. Jednalo se o první komerčně dostupné médium M3 – Day 3 medium dánské firmy Medi-Cult [105]. Zavedení do praxe takových médií, která lépe odpovídala potřebám vyvíjejícího se embrya, umožnily studie fyziologických podmínek ženského reprodukčního traktu. Pro optimální fertilizaci jsou doporučena média s vyšším obsahem glukózy, která napomáhají kapacitaci spermií. Avšak časné embryo před dosažením 8 buněk má nízkou metabolickou aktivitu, má omezenou kapacitu využívat glukózu, proto jako zdroj energie slouží pyruvát a laktát. Dělení buněk je stimulováno neesenciálními aminokyselinami. Na rozdíl embryo více než 8 buněčné má vysokou metabolickou aktivitu, využívá glukózu a k proliferaci a diferenciaci buněk vyžaduje neesenciální i esenciální aminokyseliny a vitamíny [28]. Jak se embryo vyvíjí, jeho požadavky na složení média se mění, proto jsou používána tato sekvenční média, která imitují fyzikální a chemické podmínky in vivo prostředí. Kultivace v prvním komerčně dostupném syntetickém médiu pro prodlouženou kultivaci a její výsledky jsou uvedeny v Publikaci IV. Materiál a metodika: Fertilizace oocytů probíhala v klasickém médiu. Za 18 až 20 hodin po přidání spermií k oocytům jsme mechanicky odstranili buňky cumulus oophorus a zjišťovali, zda došlo k oplození. Vzniklé zygoty jsme poté přenesly do čerstvého kultivačního média, ve kterém byly kultivovány dalších 24 hodin. K přeložení rýhujících se embryí do média M3 jsme přistoupili ve stádiu 2 nebo 4 buněk. Dřívější použití nebylo vhodné, neboť M3 médium neobsahovalo látky potřebné pro gamety a vývoj zygot. V M3 médiu, které podpořilo embrya k dalšímu dělení a diferenciaci, se embrya ponechala vyvíjet 24 až 48 hodin do doby transferu. 22 Výsledky: 1. Počáteční soubor publikovaný v roce 1995 zahrnoval 39 pacientek, ve kterém 48,2 % embryí dosáhlo více než 8 buněčného stádia. Bylo dosaženo 11 těhotenství, tj. 28,2 % klinických těhotenství/embryotransfer (PR). 2. Větší soubor z roku 1996 zahrnoval 249 pacientek s prodlouženou kultivací v M3 médiu. Více než 8 buněčného stádia dosáhlo 49,2 % embryí a bylo dosaženo 22,6 % PR. V kontrolním souboru 250 pacientek, u kterých proběhla ve stejném období pouze klasická 48 hodinová kultivace, bylo dosaženo výsledku 16,4 % PR. 3. V současné době je prodloužená kultivace prováděna u 98,5 % klientů našeho programu. 4. Jsou používána syntetická média (Origio, Vitrolife, COOK). 5. V současné době provádíme 90 % embryotransferů 4. den kultivace (12 buněčné stádium až morula). 10 % embryotransferů provádíme 3. den kultivace (6ti až 8-buněčné stádium) nebo 5. den kultivace (ve stádiu blastocysty) – viz. obr. 9. Závěr: Obě metodiky prodloužené kultivace výrazně zvýšily efektivitu programu AR oproti klasické 48 hodinové kultivaci. Prokázali jsme příznivý vliv prodloužené kultivace na vývoj embryí in vitro, kdy embrya dosahovala více než 4 buněčného stádia a vyšší morfologické kvality než při klasické kultivaci. Prvního embrya ve stádiu blastocysty jsme dosáhli v roce 1995. Přestože obě metodiky byly plně srovnatelné v kvalitě a procentu dosahovaných těhotenství, postupně jsme kokultivace opustili, hlavně pro náročnost jejich přípravy. Prodloužená kultivace v syntetických médiích se stala naší každodenní praxí. Postupem doby jsou na trhu dostupné stále kvalitnější modifikace. Např. médium Embryo Assist pro stádia 4 - 8 buněk bylo následováno Blast Assist od 8 buněk do stádia blastocysty nebo ISM1 od 2 do 8 buněk a ISM 2 pro kultivaci do blastocysty (Medi-Cult, Dánsko). 23 KLASICKÁ KULTIVACE PRODLOUŽENÁ KULTIVACE zygota 2 bb embryo 4 bb embryo 8 bb embryo morula blastocysta Obr. 9: Stádia embryí při klasické a prodloužené kultivaci 24 PUBLIKACE I 25 26 27 28 29 PUBLIKACE II 30 31 32 33 34 PUBLIKACE III 35 36 37 38 39 PUBLIKACE IV 40 41 42 43 44 45 2. MIKROMANIPULAČNÍ TECHNIKY Velký význam a přínos pro asistovanou reprodukci mělo zavedení mikromanipulačních technik. Předpokladem jejich provádění je mikromanipulační zařízení, sestávající z inverzního mikroskopu s vyhřívaným stolkem, mikromanipulátorů, mikroinjektorů a skleněných mikromanipulačních pipet (holding, hatching, biopsy, injection). Primárním úkolem bylo využití fertilizačních mikromanipulací při řešení andrologického faktoru neplodnosti, avšak uplatnění našly i v dalších technikách - asistovaném hatchingu (AH) a biopsiích. Tato zcela nová oblast mikromanipulačních technik se stala v letech 1994 – 1995 na našem pracovišti předmětem řešení grantového úkolu I. kategorie IGA MZ ČR č. 1821-2 „Asistovaná fertilizace - mikromanipulace v oblasti zona pellucida zvyšující úpěšnost oplození a transferu embrya“ [106]. V době realizace projektu byly tyto techniky využívány pouze na několika předních evropských a světových pracovištích. 2.1. Fertilizační techniky V případech mužské infertility, nízkého procenta oplozených oocytů nebo neúspěchu fertilizace se začaly používat metody asistované fertilizace. Byly vyvinuty techniky, které spermiím usnadnily překonání zona pellucida (ZP). Vzestupnou řadou invazivnější a technicky náročnější. Zona drilling (ZD) - poprvé popsali Gordon a Talansky v roce 1986 [30] znamená vytvoření lokálního otvoru v zona pellucida, např. působením kyselého Tyrodova roztoku. Parciální disekce zony (PZD) - představuje mechanické narušení (naříznutí) zony pomocí operační mikropipety. Obě tyto metody umožňují spermiím se suboptimálními parametry snadněji dosáhnout plasmatické membrány oocytu. Navíc umožňují přirozenou selekci spermií, neboť pouze ty spermie, u kterých proběhla kapacitace a fyziologicky normální akrozomální reakce, jsou schopné fúze s oolemou. Subzonální inseminace (SUZI) – znamená mechanickou inzerci jedné nebo několika spermií přímo do perivitelinního prostoru. Byla zavedena jako další způsob obejití nedostatečné koncentrace a/nebo motility spermií [49]. Dovoluje fyziologickou interakci povrchu gamet vedoucí k aktivaci oocytu. Intracytoplazmatická injekce spermie do oocytu (ICSI) - nejnáročnější technika, která 46 spočívá v přímé injekci jedné spermie do cytoplazmy oocytu a překonává tak všechny předchozí metody. Byla vyvinuta pro případy těžké oligoasthenozoospermie a případy se zcela immobilními či nezralými spermiemi. Tato technika byla poprvé užita u člověka v roce 1998 [48] a brzy bylo oznámeno první těhotenství po ICSI [69]. Jedná se o náročnou metodu vyžadující trpělivost a praxi. Zkušenosti se zaváděním a prováděním fertilizačních mikromanipulačních technik jsou uvedeny v Publikaci V, VIII a IX. Materiál a metodika: Nácvik mikromanipulačních technik jsme zahájili na podzim roku 1993. První mikromanipulační zařízení bylo vlastnictvím Biologického ústavu LF MU Brno a sestávalo z mikroskopu Leitz Fluovert FS a mechanických mikromanipulátorů Leitz (obr. 10). Obr. 10: Mikroskop Leitz Fluoverts FS s mechanickými mikromanipulátory Leitz V první fázi bylo třeba se naučit vyrábět mikropipety (držící, operační a injekční), protože nebyly komerčně dostupné (obr. 11). Vyráběli jsme je ze skleněných neheparinizovaných kapilár vytažením na horizontálním nebo vertikálním tahači, dále byly opracovány na mikrokovárně a zabroušeny na brusce. Poté byly sterilizovány horkým vzduchem. Od roku 1995 již byly k dispozici první komerčně dostupné mikropipety (Humagen, COOK, Microtech). 47 Obr. 11: Mikromanipulační pipety vlastní výroby, provádění asistovaného hatchingu V roce 1993 jsme začali nácvik manipulací s oocyty, které byly neúspěšně oplozeny nebo na degenerovaných oocytech. Nácvik spočíval ve fixaci oocytu, průniku mikropipety přes zona pellucida a cvičném provádění ZD, PZD a SUZI. V roce 1994 jsme prováděli ZD a PZD. K provádění náročnější metody ICSI jsme přistoupili až po dostatečných zkušenostech a praxí v ovládání mikromanipulátorů, od konce roku 1995 [110]. V té době jsme již měli nové moderní mikromanipulační zařízení, jehož součástí byl inverzní mikroskop Nikon Diaphot 300, Obr. 12: Mikromanipulační zařízení (s mikroskopem Nikon Diaphot 300) 48 trojrozměrně pohyblivé hydraulické mikromanipulátory Narishige a mikroinjektory IM-6 Narishige spojené teflonovou hadičkou s držáky mikropipet (obr. 12). Od roku 2012 pracujeme s moderním automatizovaným mikroskopem Nikon Eclipse Ti, mechanickými a hydraulickými mikromanipulátory Narishige a mikroinjektory Eppendorf (obr. 13). Pipety k fixaci oocytu (holding) a ICSI mikropipety používáme od firem Microtech (ČR) a COOK (Austrálie). Obr. 13: Mikromanipulační zařízení (s mikroskopem Nikon Eclipse Ti) Veškeré mikromanipulace se provádějí na speciálních plastových miskách pod minerálním parafínovým olejem (OVOIL, Vitrolife) za pomoci mikropipet (obr. 14). Obr. 14: Detail mikropipet nad miskou pro Obr. 15: ICSI, oocyt v metafázi II, mikromanipulace spermie vpravo v mikropipetě zvětšení: 320 x 49 Vlastní provedení ICSI: Oocyty je třeba před ICSI zbavit kumulárních buněk, aby na ně bylo dobře vidět, což se provádí krátkodobým chemickým působením hyaluronidázy a mechanicku denudací. Zralé oocyty v metafázi II se přenesou na misku pro ICSI po jednom do kapek, které jsou umístěné kolem centrální kapky se spermiemi. Kapky jsou přelity minerálním olejem (OVOIL, Vitrolife) kvůli udržení teploty a pH média. Oplozování se provádí injekcí jedné spermie do cytoplazmy oocytu (obr. 15). Nejprve je vybraná spermie po imobilizaci nasáta do injekční mikropipety. Oocyt je před vpichem fixován pomocí držící (holding) mikropipety. Spermie je injekční mikropipetou proniknutím přes zona pellucida a oolemu vpravena do cytoplazmy. Po injekci všech oocytů, jsou oocyty přeneseny na kultivační misku a umístěny do CO2 inkubátoru ke kultivaci. Indikace k ICSI: - snížené hodnoty spermiogramy (nízká koncentrace a/nebo pohyblivost spermií) - získání spermií chirurgickým odběrem z varlete nebo nadvarlete - selhání oplození oocytů v předchozích cyklech umělého oplodnění - oplozování před preimplantační genetickou diagnostikou (PGD) - v případech malého množství získaných oocytů - v programu darovaných oocytů - při oplozování oocytů po kryokonzervaci (před kryokonzervací odstraňujeme od oocytu buňky cumulus oophorus, což může vést ke změnám v zona pellucida, které snižují šanci na oplození klasickým oplozováním) - věk ženy nad 35 let. Výsledky: 1. V průběhu tří měsíců roku 1994 jsme zvládli metodu výroby mikropipet, způsob zacházení s mikromanipulačním zařízením a způsoby manipulace s gametami a embryi. 2. V klinické praxi jsme v roce 1994 provedli ZD u 2 pacientek, avšak fertilizace oocytů nebylo dosaženo. 3. PZD byla provedena u 25 oocytů, z nichž u 2 došlo k polyspermii a pouze u 5 oocytů došlo k normální fertilizaci. Ze 2 embryotransferů nebylo dosaženo těhotenství. 4. Provádění SUZI jsme na našem pracovišti vynechali a od konce roku 1995 jsme zavedli techniku ICSI. 50 5. V roce 1996 jsme provedli již 109 výkonů ICSI, kde indikací bylo selhání fertilizace v předchozích cyklech, nebo hodnoty spermiogramu ≤ 5 mil/ml spermií a/nebo ≤ 10 % pohyblivých spermií. Z celkového počtu 64 embryotransferů jsme dosáhli 12 klinických těhotenství, tj. 18,8 % PR. 6. V květnu 1996 jsme dosáhli prvního těhotenství po ICSI. 7. Využití ICSI se rozšířilo i na další indikace a zájem o ně postupně vzrůstal (tab.1). Závěr: Zavedení fertilizačních mikromanipulačních technik, neboli technik asistované fertilizace, do klinické praxe vyžadovalo náročnou preklinickou přípravu. Pro nízkou úspěšnost fertilizace, riziko poškození oocytu při vytváření optimálně velkého otvoru v ZP, a významný výskyt polyspermie jsme upustili od technik ZD a PZD. Metoda ICSI se od roku 1996 stala nejpřínosnější a nejvyužívanější mikromanipulační technikou. V současné době tuto techniku nebo její kombinaci (část oocytů oplozována ICSI/ část klasicky), provádíme u více než 90 % výkonů AR ročně. ICSI je řešením pro řadu párů které byly v předešlých výkonech odkázáni na použití spermatu dárce. Tab. 1: Podíl cyklů, ve kterých byly oocyty oplozovány metodou ICSI z celkového počtu výkonů v letech 2003 – 2013 na GPK LF MU a FN Brno Rok 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Počet výkonů 469 498 511 396 424 531 471 454 363 371 356 Počet ICSI 280 350 333 310 359 487 437 397 348 356 335 ICSI (%) 59,7 69,0 65,2 64,2 84,6 91,7 92,8 87,4 95,0 95,9 94,1 2.1.1. Techniky získání spermií z nadvarlete a varlete V návaznosti na praktické využití možnosti mikromanipulačně oplozovat oocyty spermiemi, kterých je nízký počet nebo mají malou až nulovou pohyblivost, jsme zavedli techniky, které umožnily získat spermie i u mužů s azoospermií. Pomocí mikrochirurgické aspirace spermií z nadvarlete – MESA (Microepididymal Sperm Aspiration) nebo extrakcí spermií z varlete - TESE (Testicular Sperm Extraction) ve spojení 51 s ICSI se podařilo mužům s azoospermií dosáhnout vlastního potomstva. Pro tyto muže, bez šance na přirozenou koncepci, bylo do té doby jedinou nadějí použití spermatu dárce. Azoospermie je mezi mužskou infertilní populací relativně častým nálezem. Rozlišujeme azoospermii obstrukční, spojenou s obstrukcí vývodných semenných cest či agenezí vas deferens, nebo neobstrukční, s defektní spermiogenezí. Podle typu azoospermie byla volena metoda získání spermií. První zkušenosti s užitím epididymálních spermií při oplozování byly ve světě prezentovány v roce 1985 [93]. Těhotenství po oplození s testikulárními spermiemi bylo ve světové literatuře popsáno v roce 1993 [86]. V naší laboratoři jsme zavedli zpracování a použití spermií z MESA a TESE v roce 1996. První zkušenosti a výsledky uvádíme v Publikaci VI. Materiál a metodika: V obodobí od září 1996 do dubna 1997 jsme zaváděli ve spolupráci s lékaři Urologické kliniky LF MU a FN Brno zpracování spermií pro ICSI po mikrochirurgickém odběru. Výkonům mikrochirurgické aspirace epidydimálních spermií a testikulární biopsii prováděném urology, předcházelo podrobné andrologické vyšetření [68]. Získaná tekutina z epididymis v injekční stříkačce nebo kousky testikulární tkáně ve zkumavce s médiem jsou z operačního sálu přepraveny do embryologické laboratoře ke zpracování (obr. 16). Při MESA se spermie separují z epididymální tekutiny promytím a centrifugací v gradientu Percollu. Vzniklý sediment je zakapán médiem a ponechán v CO2 inkubátoru. Při TESE je excidovaný bloček semenotvorných kanálků velikosti cca 3 x 3 mm přenesen ze zkumavky s médiem na Petriho misku, kde se testikulární tkáň rozvolní pomocí ostrých jehel (obr. 17) a rozkrájí skalpelem (obr.18). Poté je tkáň semenotvorných kanálků (obr. 19) promývána a centrifugována. V získaném sedimentu se vyhledávají spermie pro oplozování. Oplozování se provádí vždy technikou ICSI. V případě získání dostatečného množství spermií provádíme jak přípravu pro oplození, tak kryokonzervaci vzorků pro případné použití v budoucích cyklech AR. Tím omezujeme nutnost opakování epididymálních aspirací a testikulárních extrakcí, které jsou pro muže psychicky zatěžující. 52 Obr. 16: Testikulární tkáň po TESE Obr. 17: Rozvolnění semenotvorných kanálků Obr. 18: Krájení semenotvorných kanálků Obr. 19: Semenotvorné kanálky, zvětšení 40x Výsledky: 1. V období zavádění metody od září 1996 do dubna 1997 bylo provedeno 16 výkonů, z nichž bylo 6 v případě obstrukční azoospermie. Spermie byly získány metodou MESA. V 10 případech se jednalo o neobstrukční azoospermii, kdy z nadvarlete se nepodařilo získat žádné spermie, proto byla odebrána testikulární tkáň. Ze všech vzorků se podařilo preparací získat spermie k oplozování oocytů. 2. Ve skupině ICSI+MESA (6 případů) bylo v období zavádění metody dosaženo 50,0 % fertilizace a 4 embryotransferů. Těhotenství nebylo dosaženo. 3. Ve skupině ICSI+TESE (10 případů) bylo ve stejném období dosaženo 51,0 % fertilizace, 10 embryotransferů a 1 těhotenství, které však skončilo spontánním abortem. 4. Od roku 1997 do konce roku 2013 bylo provedeno 122 výkonů MESA a 93 výkonů TESE. Ze 105 embryotransferů bylo dosaženo 24 těhotenství, což činí 22,9 % PR. Nižší úspěšnost je dána menším počtem kvalitních embryí, vhodných k transferování. 5. Spermie z MESA byly zamrazeny u 34 mužů, z TESE u 35 mužů. 53 Závěr: Účinnost metod MESA nebo TESE v kombinaci s ICSI byla prokázána v případech obstrukční i neobstrukční azoospermie. Fertilizace při kombinaci těchto technik u azoospermiků nás přesvědčily, že lze takto pomoci většině infertilních mužů ke svému biologickému potomstvu. Výkony MESA/TESE jsou prováděny ve spolupráci s urology z pracoviště FN Brno a staly se rutinní součástí asistované reprodukce. 2.1.2. Zpracování spermií při retrográdní ejakulaci Po zkušenostech s použitím ICSI i v nejtěžších případech andrologického faktoru jsme v letech 2006 až 2007 hledali způsob, jak získat spermie u mužů s retrográdní ejakulací. Zpětná ejakulace může postihovat až 2 % neplodných mužů a vyskytuje se až u 18 % mužů s azoospermií. Proto je třeba vždy v případě zjištěné azoospermie provést vyšetření močového sedimentu na přítomnost spermií. V klasické formě zpětné ejakulace není ejakulát vůbec produkován. V některých případech ejakulát může být produkován s nálezem azoospermie. Zvláště pokud je ejakulátu velmi malé množství 0,1 – 0,2 ml je třeba na tuto možnost myslet, s největší pravděpodobností se jedná pouze o sekret bulbo-uretrálních žláz. Tématu retrográdní ejakulace a zpracování získaných spermií se věnuje Publikace VII. Materiál a metodika: Vzhledem k tomu, že chirurgické řešení není v těchto případech úspěšné, hledali jsme metodu jak získat spermie z moči v takovém stavu, aby se jimi daly oplozovat oocyty. Nejprve bylo nutno provést alkalizaci moče. Po proběhlé ejakulaci se pacient vymočí do sterilní sběrné láhve a vzorek odevzdá do laboratoře k následnému zpracování. Moč se rozdělí do 15 ml zkumavek a centrifuguje se 5 min při 3000 otáčkách. Sediment se přenese do další zkumavky, resuspenduje v promývacím médiu a znovu 5 min centrifuguje. Po odstranění supernatantu je zbylá peleta převrstvena médiem a připravené spermie ponechány v CO2 inkubátoru [51]. Výsledky: 1. V roce 2007 byla tato metoda získání spermií po retrográdní ejakulaci použita u 7 mužů. 2. U jednoho pacienta byly s časovým odstupem jednoho měsíce postupně ze 3 odběrů získány ojedinělé spermie s minimálním počtem pohyblivých, které byly zamrazeny. Poté byly všechny dávky rozmrazeny a spermie použity k oplozování 9 oocytů metodou 54 ICSI. Oplozeno bylo 7 oocytů, k transferu byla vhodná 2 embrya. K otěhotnění nedošlo. 3. Celkem 3 páry s retrográdní ejakulací u muže podstoupily IVF. Podařilo se oplodnit 40 % oocytů, bylo dosaženo jedné gravidity, která skončila abortem. 4. Úspěch získání životaschopných spermií z moči je závislý na vyloučení působení kyselého prostředí moči na spermie, resp. na bezpečné regulaci pH a osmolarity moči v době ejakulace. Závěr: Od roku 2007 bylo provedeno pouze několik odběrů spermií po retrográdní ejakulaci. Potvrdili jsme, že námi prováděná technika získání a laboratorního zpracování moči se spermiemi otevírá prostor pro muže, aby se i s kompletní retrográdní ejakulací stali pomocí metod asistované reprodukce otci. Technika není příliš používaná, neboť pacienti i urologové volí pro získání spermií raději metodu MESA nebo TESE, kdy je šance získat spermie lepší kvality. 2.2. Asistovaný hatching u embryí Asistovaný hatching (AH) je další z mikromanipulačních technik. Její úloha není již fertilizační, ale provádí se v oblasti zona pellucida embrya před transferem a spočívá pouze v jejím arteficiáním narušení. Napomáhá zvýšit úspěšnost IVF/ET tím, že zvyšuje implantační potenciál embrya nejen mechanicky usnadněním procesu hatchingu, ale také tím, že dojde ke zprostředkování časnějšího kontaktu embrya s endometriem. Na konci 80. let 20. století se ukázalo, že embrya, která se vyvíjela po PZD měla vyšší implantační poměr než embrya po konvenční inseminaci. Pozitivní vliv narušení zona pellucida pro úspěšnost implantace potvrdili Malter a Cohen, kteří pozorovali, že embrya s artificiální štěrbinou zahajují hatching dříve [55]. To vedlo k myšlence provádět artificiální otvor v zona pellucida u embryí před transferem. Tato technika byla součástí již zmiňovaného grantového úkolu IGA MZ ČR č. 1821-2, Asistovaná fertilizace – mikromanipulace v oblasti zona pellucida zvyšující úpěšnost oplození a transferu embrya, řešeného v letech 1994 – 1995 na našem pracovišti [106]. Asistovaný hatching jsme začali provádět v roce 1994 jako první rutinní mikromanipulační techniku. Díky nácviku těchto „jednodušších“ mikromanipulací jsme potom mohli přistoupit s větší sebedůvěrou k náročnější technice ICSI. Zkušenosti a počáteční výsledky provádění asistovaného hatchingu byly postupně prezentovány v Publikaci VIII a Publikaci IX. 55 Materiál a metodika: Provedení metody spočívá v chemickém (Tyrodův roztok), fyzikálním (laser), či mechanickém narušení zona pellucida za využití mikromanipulačního zařízení. V naší laboratoři se nejvíce osvědčil způsob mechanického narušení ZP. Provádí se tak, že embryo je fixováno holding mikropipetou a operační mikropipetou je vytvořen otvor v zona pellucida. Po průniku operační mikropipetou přes zona pellucida je pohybem mikropipet proti sobě proříznut otvor (obr. 11). Výsledky: 1. V období zavádění metody (březen 1994 až prosinec 1995) jsme provedli 41 transferů s AH u 121 embryí [120]. 2. V roce 1995 jsme publikovali počáteční soubor 14 pacientek s AH, s dosažením 35,7 % PR. 3. Další soubor publikovaný v roce 1996 s 20 pacientkami s provedeným AH vedl k 6 klinickým těhotenstvím, což činilo 30,0 % PR [122]. 4. Větší soubor 41 pacientek publikovaný v roce 1996, u kterých bylo dosaženo 11 klinických těhotenství, vedl k výsledku 26,8 % PR. Při srovnání výsledků IVF –AH a výsledků IVF +AH v této práci jsme prokázali zvýšení úspěšnosti s AH o více než 8 % PR. 5. V práci z roku 1997, uvádíme výsledky za období 1994 až 1996, kdy byl transfer embryí po AH proveden již u 146 pacientek s výsledkem 37 klinických těhotenství, tj. 25,3 % PR (tab. 2). Při srovnání výsledků IVF - AH s IVF + AH došlo ke zvýšení úspěšnosti při provedení AH o 6,0 % PR [110]. 6. Z postupně získaných výsledků je zřejmé, že se zvětšováním se souboru pacientek u kterých byl provedený AH, se snižovalo procento klinických těhotenství/ET, což eliminuje počáteční chybu malých čísel, která je spojena vždy s každou nově zaváděnou technikou. Přesto AH významně zvýšil procento klinických těhotenství na embryotransfer. 7. Porodu prvního dítěte po AH jsme dosáhli v roce 1994. V roce 1996 jsme dosáhli prvního porodu a současně prvních dvojčat po metodě ICSI v kombinaci s AH. 8. Asistovaný hatching se stal rutinní součástí nabízených technik a provádí se dodnes. Od roku 2003 do roku 2013 se procento transferů s provedeným asistovaným hatchingem u embryí téměř zdvojnásobilo (tab. 3). 56 Tab. 2: Nárůst výkonů s AH a procento pregnancy rate (PR) v počátečním období na GPK LF MU a FN Brno Rok Počet transferů Počet transferů + AH Procento transferů + AH PR (%) 1995 197 14 7,1 35,7 1996 432 41 9,5 26,8 1997 367 146 39,7 25,3 Tab. 3: Podíl transferů s provedeným AH v letech 2003 – 2013 na GPK LF MU a FN Brno Rok 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Počet ET 553 453 460 417 474 546 460 463 377 410 374 Počet AH 217 285 264 245 307 395 344 331 292 316 269 AH (%) 39,2 62,9 57,4 58,8 64,8 72,3 74,8 71,5 77,5 77,1 71,9 Závěr: Asistovaný hatching je přínosná metoda zvýšující šanci na úspěšnou implantaci embryí. Je doporučován ženám se zvýšeným FSH, při věku 38 let a více, při viditelném ztluštění ZP, v případě opakovaných neúspěšných ET a v případě transferu embryí po kryokonzervaci. Dlouhodobě má zájem o AH více než 70 % pacientek. 2.3. Biopsie buněk Mikromanipulace s gametami a embryí vedly k rozšíření využití této techniky k biopsiím buněk z oocytu nebo embrya. Velký laboratorní zlom znamenala biopsie embryí, jejíž dopad spočívá v možnostech provádět metody určené k identifikaci chromosomálních aberací či monogenně dědičných chorob preimplantační genetickou diagnostiku (PGD) a preimplantační genetický screening (PGS). Z těchto metod zmíním pouze mikromanipulační část, která se provádí v embryologické laboratoři, a to odběr buněk pro genetické vyšetření. 57 Biopsie blastomer embrya se provádí v 6 až 8 buněčném stádiu. Při odběru jedné až dvou blastomer je zajištěný bezpečný následný vývoj embrya a nedojde k jeho poškození. Biopsie pólového tělíska je metodou odběru buněk z oocytu. Pólová tělíska se vytvářejí v průběhu meiotického dělení před (první pólové tělísko) a po (druhé pólové tělísko) oplození vajíčka spermií. Genetický materiál pólových tělísek obsahuje haploidní sadu maternálních chromozomů komplementární k sadě obsažené ve vlastním oocytu. Analýza pólového tělíska není vhodná při PGD v případě, že nosičem mutace je otec. Nejčastěji se biopsie polárního tělíska uplatňuje v diagnostice aneuploidií. Biopsie blastocysty se v poslední době stále více upřednostňuje. Odběr buněk z trofektodermu blastocysty a jejich vyšetření by mělo dát přesnější výsledek PGD. Hypotéza vychází z faktu, že 6 až 8 buněčná stádia embryí jsou často mozaikovitá, což vede k falešně pozitivnímu nebo falešně negativnímu výsledku v závíslosti na tom, která blastomera byla odebrána a navíc může dojít samokorekcí k odloučení abnormální buněčné linie [5, 12]. Buňky trofoektodermu se odebírají ve stadiu vývoje, kdy embryo sestává z více než 100 buněk. Výhodou této techniky pro molekulární diagnostiku je odběr většího počtu buněk (10 – 30), což významně zvyšuje přesnost výsledku genotypizace [45]. Pro odběr buněk trofoektodermu je doporučena laserová incize zona pellucida, po které je herniací vypuzena část buněk, jež mohou být odebrány pro vlastní vyšetření [42]. Na našem pracovišti provádíme od roku 2000 biopsie blastomer u 6 až 8 buněčného embrya. Nejprve provedeme mechanicky otvor v zona pellucida a poté odebíráme blastomery pomocí tenké skleněné bioptické mikropipety (obr. 20). Každá blastomera je přenesena do samostatné kapky média. Další úkony spočívají v přípravě blastomer ke genetickému vyšetření. Obr. 20: Biopsie blastomery z 8 buněčného embrya, zvětšení: 400 x 58 PUBLIKACE V 59 60 61 62 63 64 65 66 67 PUBLIKACE VI 68 69 70 71 72 73 PUBLIKACE VII 74 75 76 PUBLIKACE VIII 77 78 79 80 PUBLIKACE IX 81 82 83 84 85 86 3. KRYOKONZERVACE GAMET, EMBRYÍ A TKÁNÍ Kryokonzervace je nezbytnou rutinní součástí programu asistované reprodukce. Využívá se pro uchování a budoucí použití lidských zárodečných buněk, embryí nebo tkání, které jsou uskladněné v kontejnerech s tekutým dusíkem při teplotě -196° C. Přehled o kryokonzervaci buněk a tkání jsme prezentovali v Publikaci X a Publikaci XI. Zavedené techniky kryokonzervace vedly k využití v programu dárcovství gamet a embryí. Biologické, legislativní a etické aspekty, příjem dárců, podmínky darování a vyšetření jsme zpracovali v Publikaci XII, XIII a XIV. Možnosti kryokonzervace vedly na našem pracovišti rovněž ke vzniku programu ochrany fertility u onkologicky nemocných mužů a žen - Publikace XV až XX. Proces kryokonzervace zahrnuje několik na sebe navazujících kroků: počáteční vystavení buněk vlivu kryoprotektiv, vlastní zmrazení, skladování a rozmrazení. Rozmrazení spočívá v naředění a odmytí kryoprotektiv a návratu buněk do fyziologického prostředí. Úspěšný proces zmrazení a rozmrazení musí zaručit zachování integrity buněčné struktury i jejich funkčních parametrů. Proto je pro každý typ buněk je proto používán specifický postup. Kryokonzervují se spermie, oocyty, embrya ve všech vývojových stádiích, zárodečná tkáň z testes a ovariální tkáň [131] . Doba skladování není pro žádný typ buněk a tkání striktně určena. Teoreticky je neomezená, protože při skladování neprobíhají žádné biologické aktivity. Prakticky není známo, jak dlouho mohou buňky zůstat v těchto podmínkách životaschopné. Literární údaje uvádějí, že prokázaná doba skladování, během níž si reprodukční buňky uchovávají schopnost vývoje, je pro oocyty 4 roky [70], pro embrya až 12 let [76] a pro spermie 28 let [25]. Od počátku zavádění kryokonzervace na našem pracovišti prošly významným vývojem metody mrazení, zmrazovací protokoly, kryokonzervační roztoky i nosiče zmrazeného materiálu. Od roku 2008 platí zákon 296/2008 Sb. O zajištění jakosti a bezpečnosti lidských tkání a buněk určených k použití u člověka (zákon o lidských tkáních a buňkách) a vyhláška 422/2008 o stanovení bližších požadavků pro zajištění jakosti a bezpečnosti lidských tkání 87 a buněk určených k použití u člověka, který ukládá před zmrazením biologického materiálu provést vždy serologické vyšetření z důvodu zhodnocení rizika křížové kontaminace. Před uložením buněk a tkání do kryobanky je nutno vyšetřit HIV 1 a 2 (anti-HIV-1,2), hepatitidu B (HBsAg, anti HBc), hepatitidu C (anti-HCV-Ab) a syfilis. Zamrazený materiál je do doby získání negativních výsledků umístěn v karanténě. Po prokázání seronegativity je přemístěn do skladovacího kontejneru. V případě pozitivity na některou infekci, je materiál skladován odděleně v infekčním kontejneru. Způsoby kryokonzervace Aby se zabránilo poškození nebo zničení buněk během kryokonzervace, byly vyvinuty dva základní zmrazovací a rozmrazovací postupy. Postup pomalého počítačem řízeného mrazení a postup pro rychlé mrazení - vitrifikaci. Zařízení pro kryokonzervaci na našem pracovišti prošlo vývojem od nejjednodušších ramp, které počítač postupně v závislosti na čase spouštěl k hladině dusíku a ponořoval do něj, až po programovatelná zařízení. Od 90. let 20. století jsme používali přístroj pro pomalé řízené zmrazování Planer Kryo F10 (Sunbury On Thames, U.K.) (obr. 21), který sestává z řídící počítačové jednotky, zmrazovacího prostoru, sondy a zásobníku tekutého dusíku. Vzorky mohou být umístěny do držáčků na kryotuby nebo na slámky (straws). Programy pro zmrazování různých typů buněk je možno zadat do řídící jednotky, uložit a poté již na displeji zvolit patřičný program podle mrazeného materiálu. Naprogramovat lze až 10 zmrazovacích programů. Seeding (indukce tvorby ledových krystalů) lze provádět automaticky nebo manuálně. Vlastní mrazení trvá 2,5 – 3 hodiny. V technice kryokonzervace se kolem roku 2006 udál velký návrat ve zlepšené a ve velkém měřítku aplikované vitrifikaci, způsobu zavedeném téměř před 30 lety, ale téměř dvě dekády embryology opomíjeném. Došlo k renesanci metody, která byla používaná ještě před zavedením pomalého způsobu mrazení a to zvláště ve veterinární oblasti. Vitrifikace si našla v moderní době své místo hlavně proto, že je to metoda časové méně náročná, trvající pouze 15 – 20 minut a není k ní potřeba žádný přístroj. Provádí se pomocí nádoby s tekutým dusíkem (obr. 22). Buňky se na nosiči zmrazí ponořením do sterilního dusíku a poté se nosič se zmrazeným materiálem umístí do vnějšího označeného obalu. Tento způsob se nazývá otevřený systém. 88 Dochází-li k vitrifikaci bez přímého kontaktu buněk s dusíkem, kdy jsou buňky na nosiči nejprve umístěny do označeného obalu, uzavřeny a teprve poté zmrazeny, hovoříme o uzavřeném systému. Vitrifikace vyžaduje větší zručnost a zkušenost pracovníka laboratoře, než pomalé mrazení. Kryokonzervačná média a nosiče Pro úspěšné použití obou metod je nezbytné vystavit buňky nebo tkáně působení ochranných látek - kryoprotektiv. Při pomalém mrazení se používají kryoprotektiva v nízké koncentraci (10 – 15 %), buňky se dehydratují v průběhu mrazení, teplota se snižuje pomalu a tvorba ledových krystalů je řízená. Při vitrifikaci se používá vysoká koncentrace kryoprotektiv (40 – 60 %), buňky se dehydratují před mrazením a rychlost snižování teploty je více než 1000°C/min. Při vitrifikaci dochází k solidifikaci roztoku pří nízké teplotě bez tvorby krystalů. Kryoprotektiva mohou být penetrující nebo nepenetrující. Mezi nejčastěji používaná penetrující kryoprotektiva patří glycerol, dimethylsulfoxid, etylenglykol a 1,2-propandiol. Kryoprotektiva nepenetrující – cukry, mají osmoticky dehydratační účinek. Patří mezi ně sacharóza, manitol, sorbitol a trehalóza. Chrání při mrazení proteiny a buněčnou membránu. Je třeba přesně dodržovat výrobcem předepsané postupy a časy jak při přípravě buněk a tkání na zmrazení, tak při rozmrazování. Obr. 21: Kryokonzervační zařízení Planer Obr. 22: Nádoba s tekutým dusíkem pro Kryo 10 vitrifikaci Pro kryokonzervovaný materiál byla vyvinuta řada obalů a nosičů, jako kryotuby pro sperma a testikulární nebo ovariální tkáň, nebo nejrůznější slámky (straws) pro oocyty a embrya. Vitrifikace se nejprve prováděla bez nosiče pouze v podobě kapek, nebo byly používány mřížky 89 do elekltronového mikroskopu. Postupně byly pro vitrifikaci oocytů a embryí vyvíjeny nosiče různých tvarů, např. smyček, plátků (McGill cryoleaf, Origio), nebo dírky na tyčince s plochým koncem, které se uzavírají do pejet (Rapid-i Kit, Vitrolife) – viz. obr. 23. Obr. 23: Pejety pro vitrifikaci 3.1. Kryokonzervace spermatu a testikulární tkáně Historie mražení spermatu začala po druhé světové válce, když se zjistilo, že se azoospermie a těžká oligospermie nedaří vyléčit. Tehdy vznikla myšlenka skladování zamrazeného spermatu a vzniku spermabank. Technika kryokonzervace spermatu je v dnešní době dobře propracovaná a zachovává fertilizační potenciál spermií v průběhu dlouhodobého skladování v tekutém dusíku. Bezpečnost použití zmrazeného spermatu byla prokázána experimentálně i ve veterinární praxi a později narozením množství zdravých dětí po inseminaci spermatem dárce. Mrazí se buď kompletní sperma nebo zpracované proprané spermie. Některé práce uvádějí, že neproprané spermie jsou lépe chráněny před poškozením v průběhu mrazení/rozmrazení a vykazují lepší pohyblivost a DNA integritu po rozmrazení [20]. Sperma je možno mrazit jak pomalým způsobem pomocí Planer Kryo 10, tak vitrifikací [114]. Obě metody dávají dobré výsledky po rozmrazení. Testikulární tkáň je možno mrazit pomalou metodu, nebo vitrifikací. Avšak vhodnější a praktičtější je testikulární tkáň nejprve zpracovat a zamrazit pouze získané spermie. Materiál a metodika: Na našem pracovišti jsme zavedli mrazení spermatu v roce 1991. Kryokonzervace spermatu s Richardsonovým kryoprotektivním médiem byla prováděna na přístroji Planer Kryo 10. Médium jsme si připravovali sami na bázi pufru, glukózy, fruktózy a citrátu sodného. Glycin 90 a vaječný žloutek sloužil jako zdroj proteinů a jako kryoprotektivum byl použitý glycerol. Od roku 2000 používáme kryokonzervační média firmy Medi-Cult resp. Origio a od roku 2001 sperma pomocí těchto médií (Cryosperm) vitrifikujeme. Sperma je po zhodnocení spermiogramu smícháno s kryoprotektivem a je rozplněno do kryotub Nunc o objemu 1,0 nebo 1,8 ml. Zmrazeno a uchováváno je v kontejnerech s tekutým dusíkem (obr. 24). Rozmrazení spermatu se provádí ponecháním kryotuby při pokojové teplotě až do úplného roztátí vzorku. Poté je kryoprotektivum odmyto centrifugací s promývacím médiem. Obr. 24: Kryotuby se zamrazeným spermatem 3.1.1. Kryokonzervace spermatu u partnerů IVF pacientek a zdravých mužů Partněři pacientek IVF programu využívají kryokonzervaci spermatu v těchto případech: - jako pojistku pro případ selhání vybavení spermatu v den odběru oocytů - pro případ vlastní nedosažitelnosti v den odběru vajíček z různých důvodů (pracovní, zdravotní, psychické atd.). - v programu dárcovství oocytů - dárcovská vajíčka mohou být oplozena v den jejich získání bez nutnosti okamžitého příjezdu partnera k odběru spermatu - uchování spermií získaných při MESA nebo TESE pro budoucí použití bez nutnosti opakovaného chirurgického vstupu. U zdravých mužů stoupá v posledních letech zájem o uchování spermatu do rezervy. Jsou to nejčastěji aktivní sportovci, muži rizikových profesí, nebo muži odcházející do zahraničních misí. 91 Na našem pracovišti si za období 1991 až 2013 nechalo celkem 782 mužů zamrazit sperma pro použití v léčebných cyklech IVF. Z toho 540 mužů k oplozování oocytů partnerky a 242 mužů pro oplozování darovaných oocytů. Pro vlastní použití v budoucnu si nechalo zamrazit sperma 51 mladých zdravých mužů. Testikulární tkáň byla mrazena ve 3 případech. V době technik asistované reprodukce, kdy kvalita spermatu není již limitující faktor pro použití po rozmrazení, má technika kryokonzervace spermatu široké využití. Aktivní přístup zdravých mužů k uchování vlastního kvalitního spermatu s ohledem na jeho budoucí využití je díky médiím a šíření osvěty v současné době trendem. 3.1.2. Kryokonzervace spermatu dárců a spermabanka Program dárcovství spermií a budování vlastní spermabanky jsme na našem pracovišti započali v roce 1995. Od té doby jsme se stali největší spermabankou ve státním zdravotnickém zařízení [128]. Sperma dárců se z důvodu nebezpečí přenosu infekčních nemocí nepoužívá čerstvé, ale je nutno jej neprve zamrazit. Po zopakování serlogických testů za 180 dní karantény, může být sperma použito pro účel darování. Je všeobecně známo, že kryokonzervace způsobuje snížení počtu spermií s normální morfologií. Dochází k poškození integrity membrán, mitochondriální aktivity, akrozomu a bičíku. Zvláště je ovlivněna pohyblivost spermi, která může být po zmrazení/rozmrazení redukována o 20-50 % [13]. Z toho důvodu jsou požadavky kvalitu dárcovského spermatu vyšší (tab. 4), než je norma WHO pro normospermii (tab.7). Desetiletý přehled o dárcovském programu spermií (1995 – 2005) byl zpracován v Publikaci XIII. Materiál a metodika: Požadavky na dárce jsou: - věk 18 až 35 let - minimálně středoškolské vzdělání s maturitou - dobrý zdravotní stav s nezatíženou rodinnou anamnézou - negativní genetické vyšetření - karyotyp, cystická fibróza - negativní mikrobiologické vyšetření - aerobní a anaerobní mikroorganismy, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma homini, Chlamydia trachomatis 92 - negativní serologické vyšetření – HIV 1 a 2 (anti-HIV-1,2), hepatitidu B (HBsAg, anti HBc), hepatitidu C (anti-HCV-Ab) a syfilis, včetně krevní skupiny a Rh faktoru. - minimální požadované parametry spermatu (tab. 4). - dotazník zaměřený na fenotypickou charakteristiku, povahu a záliby - podepsaný informovaný souhlas - seznámení s anonymitou dárcovství v ČR Limity pro darování jsme si na pracovišti interně stanovili: - změna zdravotního stavu - překročení věkové hranice - více než 30 zamrazených vzorků - více než 8 - 10 narozených dětí Tab. 4: Minimální požadavky na parametry spermatu dárce na CAR GPK LFMU a FN Brno Objem ≥ 2 ml Motilita ≥ 60 % Koncentrace ≥ 50 mil/ml Morfologie ≥ 30 % s normální morfologií Přežívání za 24 hod. ≥ 50 % počáteční motility Výsledky: 1. Za 18 roků naší spermabanky projevilo zájem stát se dárcem 362 kandidátů. 2. Dárcem se po projití všemi testy stalo 99 mužů (27,3 % ze zájemců). 3. Nejvíce kandidátů bylo vyřazeno z důvodu nesplnění podmínek na spermiogram (65,7 %). 4. Naše spermabanka nabízí dárce všech krevních skupin a různých fenotypů. 5. Příjemci darovaných spermií si mohou vybírat dárce z naší databáze díky vyplnění dotazníku. 6. Sperma dárců je využíváno pro léčbu metodami IUI, IVF a ICSI. 7. Již 12 dárců bylo vyřazeno z databáze nabízených z důvodu více než 8 narozených dětí. 93 Závěr: Vybudování spermabanky a použití spermatu dárců zaujímá v asistované reprodukci stále své důležité místo, přestože máme k dispozici techniky, které dokáží řešit i těžký andrologický faktor. Díky zachování anonymy dárců a příjemců trvá zájem o darování spermatu i o využití dárcovského spermatu. Naši spermabanku využívají nejen klienti našeho centra, ale o kvalitní sperma našich dárců projevilo zájem dalších 5 pracovišť z ČR. 3.1.3. Kryokonzervace spermatu u onkologických pacientů Poškození reprodukčních funkcí včetně tvorby spermií a následné neplodnosti je dobře známý negativní vedlejší efekt spojený s terapií malignit. Zvyšující se úspěšnost onkologické léčby a aktivní život mladých mužů po jejím zvládnutí vedla na našem pracovišti v roce 1995 k zavedení kryokonzervace před zahájením onkologické (chirurgické, chemické nebo radiologické) léčby pro pozdější použití. Jsme jediné centrum, které se zabývá touto problematikou v tak velkém rozsahu a objemu. Přehled o nárůstu onkologických pacientů se zájmem o kryokonzervaci spermatu i o výsledcích u pacientů, kteří se po úspěšně prodělané léčbě vrátili na naše pracoviště k léčbě neplodnosti, byl průběžně publikován v našich pracech Publikace XVIII a XIX. Publikace XX rozebírá 17ti letou zkušenost s kryokonzervací spermatu a jeho dalším využitím v léčbě infertility u pacientů s testikulárním karcinomem. Materiál a metodika: Muži s onkologickým onemocněním (ve věku 13 až 64 let) jsou odesíláni na naše Centrum z Fakultní nemocnice Brno, Masarykova onkologického ústavu v Brně a z Fakultní nemocnice U sv. Anny v Brně. Přehled onkologických diagnóz a počty pacientů uvádí tabulka 6. Kryokonzervace spermatu byla prováděna do roku 2000 s Richardsonovým médiem jako kryoprotektivem a mrazením pomalým způsobem na přístroji Planer Kryo 10. Od konce roku 2000 je používáno médium firmy Medi-Cult resp. Origio (Dánsko) a k mrazení je volena metoda vitrifikace [135]. Z odběru jednoho pacienta jsou zamrazeny v průměru 4 kryotuby. Vzorky byly v letech 1995 – 2010 skladovány v Tkáňové bance FN Brno a od roku 2011 jsou uskladněny na Transfúzním a tkáňovém oddělení FN Brno. 94 Při léčbě neplodnosti je sperma rozmrazeno, zpracováno a používáno pro metody intrauterinní inseminace nebo IVF. V případě oplozování oocytů je standardně prováděna technikou ICSI. Výsledky: 1. Za období 1995 až 2013 využilo kryokonzervaci spermatu 1111 onkologických pacientů (1195 odběrů). Se stoupající informovaností onkologických pracovišť počet pacientů narůstal (tab. 5). 2. Nejčastějšími diagnózami byl tumor varlete (47,4 %), lymfom Hodgkin (17,8 %) a leukémie (10,6 %) - tab. 6. 3. Za období 18 let bylo zamrazeno 5335 kryotub spermatu. 4. K léčbě neplodnosti se na naše pracoviště ze skupiny pacientů s tumorem varlete vrátilo 34 mužů (6,5 %). Jejich partnerky podstoupily 57 léčebných cyklů. 5. Interval mezi onkologickou léčbou a léčbou neplodnosti byl 7 až 70 měsíců. Tab. 5: Počty mužů (onkologických pacientů) s kryokonzervovaným spermatem na GPK LF MU a FN Brno v letech 1995 – 2012 Rok 1995 1996 1997 1098 1999 2000 2001 2002 2003 Počet mužů 2 10 27 20 38 50 55 61 62 Rok 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Počet mužů 62 87 88 68 81 95 74 69 62 Závěr: Kryokonzervace spermatu před onkologickou léčbou je předpokladem úspěchu léčby následné neplodnosti. Kryokonzervace by měla být nabídnuta každému pacientovi před terapií vedoucí k destrukci spermatogeneze. Zamražené sperma je pozitivní faktor pro emocionální boj s nemocí, i kdyby nebylo nikdy použito. Program vyžaduje těsnou spolupráci centra asistované reprodukce s onkologickými pracovišti i se zázemím, kde je možno takové množství materiálu skladovat. 95 Tab. 6: Přehled onkologických diagnóz a počtu pacientů s kryokonzervovaným spermatem v letech 1995 – 2013 na GPK LF MU a FN Brno Onkologická diagnóza Počet pacientů % Tumor varlete 523 47,4 Lymfom Hodgkin 199 17,8 Leukémie 119 10,6 Lymfom non-Hodgkin 72 6,5 Osteosarkom 68 6,1 Tumor zažívacího traktu 32 2,8 Tumor CNS 15 1,4 Tumor močového traktu 11 1,0 Tumor respiračního traktu 11 1,0 Ostatní 61 5,4 Celkem 1111 100 3.2. Kryokonzervace embryí Mrazení lidských embryí se vyvinulo z aplikace kryokonzervačních technik pužitých u zvířat. V roce 1972 Whittingham [116] dosáhl narození myši z transferu moruly zamražené pomalým zmražovacím protokolem s dimethylsulfoxidem (DMSO). Stejný protokol vedl k prvnímu těhotenství u člověka ze zamraženého 8 buněčného embrya v Austrálii [100]. Následován byl porodem dvojčat v Holandsku v roce 1984 [118]. Při asistované reprodukci vzniká superovulací více oocytů a následně embryí, než je vhodné použít k transferu. Kryokonzervace embryí byla původně vyvinuta aby zachránila nadpočetná embrya pro budoucí použití. Důležité místo zaujímá program dárcovství, kdy jsou zamrazená embrya připravena pro použití u příjemkyň darovaných oocytů nebo darovaných embryí. Příjemkyně darovaných oocytů mají embrya vzniklá oplozením spermatem jejich pratnera. Příjemkyně darovaných embryí mají embrya vzniklá jak z darovaných oocytů, tak z darovaných spermií [129, 131]. V programu zachování fertility je kryokonzervace embryí jednou z možností pro pacientky před onkologickou léčbou [133]. 96 Indikace k mrazení embryí: - nadpočetná embrya - středně závažný až závažný ovariální hyperstimulační syndrom, žena by byla při přenosu embryí vystavena riziku ohrožení zdraví - překážka provedení transferu čerstvých embryí (akutní nemoc, děložní polyp, nízká sliznice, předčasná luteinizace, krvácení) - technický problém při provedení transferu - program dárcovství vajíček a embryí - uchování embryí žen před radio- nebo chemoterapií Materiál a metodika: Embrya jsou úspěšně mrazena za použití propanediolu (PROH), DMSO nebo glycerolu. Každé kryoprotektivum je vhodné pro určité stádium – PROH nebo DMSO je lepší pro zygoty nebo dělící se embrya, zatímco glycerol je vhodnější pro blastocysty. Embrya určená ke kryokonzervaci by neměla obsahovat více než 30 % fragmentů. Pro mrazení embryí lze využít pomalý způsob mrazení nebo vitrifikaci. Při pomalém mrazení Planerem Kryo 10 je teplota z počáteční pokojové teploty snižována rychlostí -2º C/ min do –7º C. Při této teplotě ponechat 5 minut před provedením seedingu a poté z –7º C snižovat rychlostí -0,3º C/min do –30º C. Z –30º C snižovat rychlostí -50º C/min do –150º C. Poté přenést pejety do kontejneru s kapalným dusíkem k uskladnění při –196º C (obr. 26). Vitrifikace zygot a rýhujících se embryí je rovnocennou metodou a provádí se ve 2 nebo 3 krocích postupným překládáním embryí do médií pro vitrifikaci (obr. 25). Rozmrazení probíhá dle protokolu adekvátního ke zmrazování. Je třeba dodržovat přesný postup uvedený výrobcem. Faktory, které ovlivňují efektivitu transferu rozmrazených embryí byly popsány v Publikaci XI. Výsledky: 1. Na našem pracovišti jsme zahájili program kryokonzervace embryí pomalým způsobem na zařízení Planer v roce 1992. 2. V roce 1994 jsme dosáhli prvního těhotenství z embryí po rozmrazení. 97 3. První dítě po transferu rozmrazených embryí po IVF (KET-IVF) se narodilo v roce 1996. 4. Od roku 1997 jsme na základě fungující kryokonzervace zavedli program dárcovství. 5. Od roku 2007 embrya mrazíme rychlejší metodou vitrifikace. 6. Za období 1992 až 2013 jsme zamrazili 6105 embryí. 7. Provedli jsme 2310 kryoembryotransferů (KET). 8. Úspěšnost po KET se na našem pracovišti je 26,2 % PR. VITRIFIKACE Obr. 25: Pomůcky pro provádění vitrifikace: misky s kryoprotektivními médii, pejety na embrya (straws) jsou umístěné v nádobách v tekutém dusíku Závěr: Úspěšnost kryokonzervace embryí a výsledku po embryotransferu je závislá na množství faktorů: na kvalitě časného embrya, na věku ženy, příčině infertility, způsobu mražení, na výsledku předchozího čerstvého transferu, na morfologické kvalitě rozmrazeného embrya 98 a dalších [125]. Embryotransfer lze provést ve stejný den jako rozmrazení nebo další den po několikahodinové kultivaci. Kryokonzervace embryí slouží v programu dárcovství oocytů nebo embryí. Pro ženy před onkologickou léčbou může kryokonzervace vlastních embryí sloužit jako „ochrana fertility“ pro budoucí použití. Obr. 26: Skladovací kontejnery s tekutým dusíkem 3.3. Kryokonzervace oocytů Po řadu let od prvně publikované práce [39] nebyla kryokonzervace oocytů příliš používanou metodou kvůli nízkému procentu přežívání oocytů, fertilizace, vyvíjejících se embryí a jejich špatné kvalitě. Technika vyšla z kryokonzervačních protokolů užívaných pro embrya. Četné práce vedené snahou o zkvalitnění výsledků se zabývaly modifikací těchto laboratorních postupů, jako např. zvýšení koncentrace sacharózy, změny počáteční teploty kryoprotektiva, změny teploty pro seeding, užití média s nízkým obsahem sodíku nebo např. injekce kryoprotektiva do oocytu. Důležitý je způsob oplozování oocytů po rozmrazení. Změny v zona pelucida, poškození funkce kortikálních granul a částečná disrupce membrán, která způsobila blok splynutí a penetrace spermií vedly k nízkému procentu oplození. Tyto překážky se podařilo úspěšně obejít použitím ICSI [74]. 99 Indikace k mrazení oocytů: - možnost uchování oocytů pacientek s rizikem předčasného ovariálního selhání - skladování zmrazených darovaných oocytů v programu dárcovství odbourá nutnost synchronizace cyklů dárkyně a příjemkyně - řešení v případě neočekávané absence partnerových spermií v den odběru oocytů (překážka zdravotní, dopravní, pracovní nebo i momentální psychické rozpoložení) - pomoc pro ženy s onkologickým onemocněním u kterých nemohou být zamrazena embrya, např. nemají vhodného partnera a odmítají dárcovské sperma - možnosti zamrazení a skladování oocytů se nově jeví jako příležitost pro ženy, které neplánují bezprostředně těhotenství a chtěly by si uschovat „mladé oocyty“ pro vlastní použití v budoucnu Materiál a metodika: Oocyty se mrazí nejdříve 5 hodin po odběru, po odstranění buněk cumulus oophorus [40]. Roztoky pro mrazení a rozmrazení obsahují jako kryoprotektivum nejčastěji 1,2 propandiol (PROH) a sacharózu. Může být použit i DMSO. Po projití řadou příslušných ekvilibračních a kryokonzervačnách roztoků se mohou mrazit jak pomalým způsobem, tak vitrifikací. Pro rozmrazení se volí protokol odpovídající způsobu zamrazení (pomalé, rychlé). Rozmrazené oocyty se po projití řadou roztoků, kdy se odmývá kryoprotektivum a optimalizují osmotické podmínky, umístí do kultivačního média. Vloží se do CO2 inkubátoru s teplotou 37° C se ponechají 2 až 4 hodiny regenerovat než se přistoupí k oplozování. Výsledky: 1. Oocyty jsme na našem pracovišti poprvé mrazili pomalým způsobem na přístroji Planer u dvou pacientek v roce 2003. 2. V roce 2006 jsme stejným způsobem zamrazeny oocyty 3 pacientek. Byly to vyjímečné případy (nedostavení se partnera k odběru spermií) a mrazení vycházelo z postupu pro mrazení embryí. 3. Od roku 2010 provádíme mrazení oocytů výhradně vitrifikací a doposud jsme zamrazili oocyty 8 dárkyň pro program dárcovství. 100 4. Jako způsob ochrany fertility si zvolily kryokonzervaci oocytů 3 pacientky před onkologickou léčbou, které nemají v současné době vhodného partnera, aby mohly využít kryokonzervaci embryí. Závěr: Kryokonzervace oocytů je v současné době slibná alternativa zmrazování embryí. Je vhodná pro pacientky s rizikem předčasného ovariálního selhání. Také pro mladé dívky, kterým plánovaná chemoterapie zničí pohlavní buňky, je to možná varianta řešení. 3.4. Kryokonzervace ovariální tkáně jako ochrana fertility Chemoterapie jako jedna ze základních modalit onkologické léčby zanechává často trvalé následky. Mezi nejčastější patří neplodnost na základě ireverzibilního poškození gonád. Jednou z metod zachování fertility u žen s nádorovým onemocněním je kryokonzervace ovariální tkáně. Metoda kryokonzervace ovariálně tkáně byla vyvinuta na našem pracovišti na podkladě dříve publikovaných prací jiných autorů [2, 21, 57]. Některé aspekty popsaných postupu byly modifikovány na základě vlastních zkušeností. První kryokonzervaci jsme provedli v roce 2004. V letech 2004–2007 jsme řešili grant IGA MZ ČR NR/8469-3 „Možnosti ochrany reprodukčních funkcí u žen podstupujících chemoterapii pro hematologickou malignitu“. Způsoby odběru materiálu, zpracování tkáně, kryokonzervace, elektronová mikroskopie a zhodnocení kvality zmrazeného/rozmrazeného materiálu, včetně 6ti letých zkušeností s tímto programem jsou podrobně popsány v Publikacích XVIII, XIX a XX. Indikace ke kryokonzervaci ovariální tkáně: - je vhodná pro mladé dívky, u kterých je zřejmé, že jim plánovaná chemoterapie zničí pohlavní buňky, a které nemají zatím partnera, aby podstoupily stimulaci ovarií, oplození oocytů a zamrazení embryí - pro ženy, u kterých na hyperstimulaci ovarií již není čas, neboť celá procedura by odsunula onkologickou léčbu nejméně o 14 dní až 3 týdny - pro ženy, které z důvodu rizika zhoršení nemoci nemohou hyperstimulaci ovarií podstoupit 101 Materiál a metodika: Odběr ovariální tkáně se provádí laparoskopicky za krátkodobé hospitalizace pacientky. Množství ovariální tkáně odebírané pro učely kryokonzervace je vzorek ovariální kúry o rozměrech cca 10 x 20 mm a tloušťce 1-2 mm z obou ovarií. Tkáň ovariálního kortexu je uložena do kultivačního média a transportována do embryologické laboratoře k dalšímu zpracování (obr. 27). V laboratoři je nařezána skalpelem na menší části o velikosti asi 10 x 3 x 2 mm (obr. 28). Poté je sycena kryoprotektivním médiem. Po inkubaci v kryokonzervačním médiu jsou 4 až 6 kousků vloženo do jedné kryotuby (Nunc) a vitrifikovány. Obr. 27: Odebraná ovariální tkáň Obr. 28: Zpracování ovariální tkáně před kryokonzervací 102 Výsledky: 1. Technika kryokonzervace ovariální tkáně je rozvíjena na našem pracovišti od začátku roku 2004, kdy se jednalo o ojedinělé případy. V prvních 3 letech jsme používali zejména metodu pomalého mrazení za použití zařízení Planer Kryo F10. Od roku 2007 kryokonzervujeme vitrifikací. 2. Od ledna 2006 do konce roku 2013 byla ovariální tkáň kryokonzervována celkem u 20 pacientek před plánovanou gonadotoxickou léčbou. Hodgkinův lymfom (11x), nonhodgkinský lymfom (5x), akutní myeloidní leukémie (1x), karcinom ovaria (1x), karcinom jazyka (1x), systémový lupus erythematodes (1x). 3. Pomalou metodou mrazení byly zpracovány vzorky od 8 pacientek a metodou vitrifikace od 12 pacientek. 4. Průměrný věk pacientek byl 26,7 roků. Nejmladší pacientka měla 13 let. 5. Průměrný čas do zahájení chemoterapie nepřesahoval jeden týden. 6. Ve dvou případech byl pro velmi vysoké riziko trvalého ovariálního selhání odebrán jeden celý vaječník. 7. Pro zjištění vhodnosti našeho postupu při kryokonzervace a kvality tkáně po rozmrazení jsme provedli elektronově mikroskopické vyšetření dvou náhodných vzorků ovariální tkáně. Byly zjištěny jak minimální strukturální změny v primordiálních a primárních ovariálních folikulech, tak i buňky s částečnou destrukcí [133]. 8. S transplantací ovariální tkáně nemáme zatím na našem pracovišti zkušenost. Závěr: Kvalitní kryokonzervace otevřela zcela nové možnosti pro ochranu fertility žen před onkologickou léčbou. Kromě mrazení oocytů a embryí může být uchována stejným způsobem ovariální tkáň. Slouží převážně pro ženy bez partnera a velmi mladé ženy. Možnost kryokonzervace buněk nebo tkání může významně zlepšit kvalitu života mladé paientky. V současnosti existuje již více než deset let klinických zkušeností s technikami kryokonzervace ovariální tkáně u člověka. Narození již desítek zdravých dětí s použitím této techniky dává šanci pacientkám do budoucna, ale zatím je stále nutné považovat tuto techniku za experimentální. 103 PUBLIKACE X 104 105 106 107 108 109 110 PUBLIKACE XI 111 112 113 114 115 116 117 118 PUBLIKACE XII 119 120 121 122 123 PUBLIKACE XIII 124 125 126 127 128 129 130 PUBLIKACE XIV 131 132 133 PUBLIKACE XV 134 135 136 137 138 139 PUBLIKACE XVI 140 141 142 143 144 145 PUBLIKACE XVII 146 147 148 149 150 151 PUBLIKACE XVIII 152 153 154 155 156 157 158 PUBLIKACE XIX 159 160 161 162 PUBLIKACE XX 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 4. HODNOCENÍ KVALITY GAMET A EMBRYÍ S počátkem nového tisíciletí, vyvstaly nové požadavky jak na klinickou, tak na laboratorní část asistované reprodukce v souvislosti jednak se stále stárnoucí populací pacientů a jednak s naléhavější snahou eliminovat výskyt vícečetných těhotenství. Lemos a spol. v americké studii z roku 2013 [50] uvádí, že cena porodu dvojčat je 5x vyšší, než u jednoho dítěte, zatímco u trojčat je téměř 20x vyšší. Celkové náklady na zdravotní péči jsou okolo 21 000 dolarů na porod jednoho dítěte, 105 000 dolarů na dvojčata a okolo 400 000 dolarů na trojčata a vícerčata. Studie, která hodnotila náklady na zdravotní péči o matku v průběhu 27 týdnů před porodem až do 30 dní po porodu, také brala v úvahu náklady na zdravotní péči o kojence až do jeho prvních narozenin. Jednalo se o skupinu žen ve věku 19 až 45 roků, které porodily nejméně jedno živé dítě v letech 2005 až 2010 a týkala se téměř 440 000 porodů. Z těchto porodů bylo okolo 97,0 % jednočetných, 2,8 % dvojčat a 0,13 % trojčat a vícečetných těhotenství. Tato fakta znamenají pro embryology nové výzvy a nová řešení. Narůstá snaha najít způsoby výběru jednoho nejkvalitnějšího embrya na transfer. Kvalita a vitalita embrya vychází největší měrou, pomineme-li kultivační podmínky, z kvality gamet. Naskytl se nám tedy úkol, jak vybrat kvalitní oocyty a spermie a jak poznat ta nejlepší životaschopná embrya. Některé metody jsme aplikovali do praxe. 4.1. Hodnocení kvality oocytů a spermií Kvalita oocytů Kvalitu oocytů hodnotíme poprvé hned při jejich vyhledávání ní z folikulární tekutiny, nepřímo hodnocením morfologie celého komplexu oocyt – cumulus oophorus, pod vyhledávacím mikroskopem (obr. 29). Posuzování provádíme následovně: Typ 1- buňky kumulu jsou velké, rovnoměrně rozprostřené kolem oocytu s velkým množstvím extracelulární matrix. Corona radiata se jeví buď jako velmi expandovaná a světlá, nebo kompaktní, méně světlá. Oocyt má vyvinuté první pólové tělísko, které však často nemusí být přístupné pozorování. Komplex oocyt-cumulus oophorus tohoto typu je vhodný k oplozování po preinkubaci po dobu 2 - 6 hodin. 173 Typ 2 -buňky kumulu mají průměrnou velikost, jsou v kumulu rovnoměrně rozptýleny. Corona radiata se jeví jako denzní a ostře ohraničená. Oocyt nemá vyvinuté pólové tělísko. Preinkubační doba pro tento typ je 6 - 12 hodin. Typ 3 - kumulus a korona obklopující zonu pellucidu sestávají z hustě nahloučených buněk. Oocyt nemá pólové tělísko. Vhodná preinkubační perioda je 12 - 24 hodin. Typ 4 - kumulus s koronou je malý, tvořený pouze několika málo vrstvami buněk. Oocyt nemá vyvinuté pólové tělísko, v oocytu je zpravidla patrný zárodečný měchýřek (jádro). Preinkubační perioda je 24 - 36 hodin. Takové oocyty by měly být z oplozování vyloučeny. Reálnější představu o stavu a zralosti oocytu získáme, když jej enzymaticky a mechanicky zbavíme buněk cumulus oophorus a corona radiata a hodnotíme samotný oocyt před oplozováním metodou ICSI. Tehdy je dobře patrné, zda jsou již v optimální fázi pro oplozování - v metafázi II, nebo naopak ještě ve stádiu zárodečného váčku. Van Blerkom [8] uvádí, že 13 % neoplozených oocytů po IVF v případě normálního spermiogramu, vykazovalo morfologické abnormality. Oocyt v metafázi II je definován jako oocyt s jasnou, jemně zrnitou cytoplazmou, malým perivitelinním prostorem a s jasnou, bezbarvou zona pellucida (obr. 30). Často pozorujeme abnormality v barvě, granularitě a homogenitě cytoplasmy, cytoplasmatických inkorporacích a extracytoplazmatických abnormalitách jako velikost perivitelinního prostoru, barva zona pellucida a tvar oocytu. Dále lze hodnotit přítomnost pólového tělíska, jeho tvar, případně fragmentaci. Oocytů je však omezený počet a mnohdy nelze příliš vybírat ty, které se budou oplozovat. Obr. 29: Komplex oocyt–cumulus oophorus Obr. 30: Oocyt v metafázi II, zvětšení: 350 x zvětšení: 40 x 174 Kvalita spermií Spermie má významný podíl na správném oplození oocytu a jeho dalším vývoji. Přináší přibližně polovinu vloh, které vytváří genom nového jedince. Úloha spermie byla mnoho let zjednodušována na pouhý transport DNA do oocytu. Bylo však spolehlivě prokázáno, že se významně podílí na abnormálním vývoji embrya a selhání implantace [6]. a) Konvenční analýza spermatu, stanovení spermiogramu, zůstává zlatým standardem při zahájení vyšetření mužské infertility. Ve snaze zajištění určitého standardu a srovnatelnosti výsledků postupujeme dle „WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen“ [117]. Vydala ho WHO v roce 1987 a od té doby prošel několika aktualizacemi v letech 1992, 1999 a naposled v roce 2010, kdy vyšla jeho 5. edice (tab. 7). Spermiogram je vyšetření, kdy zjištujeme objem ejakulátu, pH, barvu, viskozitu, koncentraci spermií v něm (v mil/ml), jejich motilitu a charakter pohybu (progresívní, neprogresívní, nepohyblivé), morfologii, tzn. patologie hlavičky, krčku a bičíku a další parametry. Vyšetření se provádí v Maklerově komůrce (obr. 31). Obr. 31: Maklerova komůrka k hodnocení spermiogramu Analýza spermatu má však limitovanou výpověď o šanci páru na těhotenství metodami AR, neboť snížená fertilita může mít mnoho příčin. Existuje řada přístupů k hodnocení ejakulátu, avšak žádný z nich neodhalí přesně míru plodnosti. 175 Tab. 7: Hodnoty základních parametrů při hodnocení spermiogramu dle WHO platné jako norma (4. a 5. edice manuálu) WHO manuál Edice 4 od r. 1999 Edice 5 od r. 2010 Objem ejakulátu (ml) 2 1,5 Celkový počet spermií (x 106 /ejakulát) 40 39 Koncentrace spermií (x 106 /na ml) 20 15 Celková pohyblivost (%) 50 40 Progresivní pohyblivost (%) 25 32 Morfologicky normálních (%) 30 4 Úspěšnost metody ICSI snížila význam a potřebu provádět testy kvality spermie, když dokonce morfologicky abnormální a immotilní spermie mohou vést k úspěchu ve 25 %. Byly vyvinuty různé funkční testy, avšak v nejsou příliš praktikovány. Klasické rutinní techniky úpravy spermatu využivané v embryologických laboratořích jsou density gradient centrifugation a swim-up. Na základě migrace nebo sedimentace se získavají spermie s lepší motilitou a morfologií. Morfologie a motilita neidentifikuje ovšem další charakteristiky, jako jsou chromozomální aberace, defekty chromatinu a DNA. Znamená to tedy, že z hlediska optimálního fertilizačního potenciálu takto připravené spermie k inseminaci selektovány nejsou. U klasické IVF funguje zona pellucida jako selektivní biologická bariéra proti abnormálním spermiím, takže ve většině případů jsou schopné oplodnit vajíčko jen „normální“ spermie. U metody ICSI se tento mechanismus „přirozeného“ výběru obchází a o výběru spermií rozhoduje morfologické posouzení embryologa. Je nutné využít další technické možnosti k vyšetření kvality spermií, které se nabízejí a začlenit je do každodenního použití v embryologické laboratoři [18]. 176 b) Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection (IMSI) Výběr kvalitnější spermie lze zvýšit mikroskopickou technikou „Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection“ (Intracytoplasmatická injekce spermie selektovaná morfologicky) (IMSI). Jedná se o metoda výběru spermie pro ICSI, přímo v reálném čase při velkém zvětšení pod mikroskopem. Metoda byla vyvinuta skupinou Bartoova v Izraeli [7]. K důkladnému morfologickému výběru spermie (bez abnormalit hlavičky, s normálním tvarem jádra a bez vakuol v hlavičce) pro injekci do vajíčka je používáno velké mikroskopické zvětšení (6000x – 8000x). Běžné oplodnění vajíček pomocí metody ICSI je prováděno při relativně malém zvětšení (200x – 400x) umožňujícím výběr spermie, která je pohyblivá a na první pohled morfologicky v pořádku. IMSI je technologicky náročná metoda, která výrazně prodlužuje čas celého výkonu (až na 5 hodin) a vyžaduje nakladné přistrojové vybaveni. Tuto techniku jsme na našem pracovišti neprováděli, je zmíněna pouze k výčtu metod hodnocení kvality spermie. c) Hodnocení integrity chromatinu spermií Kvalitu genetické informace v hlavičce spermie nelze účinně ovlivnit. DNA může být porušena zlomy nebo kovalentní modifikací nukleotidů, tzv. DNA addukty. Oba tyto typy poruch jsou jednou z příčin infertility. V mnoha případech je vyšetření poruchy DNA významným předpovědním ukazatelem úspěchu. Například muži s fragmentací DNA spermií nad hranici 25 % za použití Comet assay nebo 30 % při použití SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) mají vyšší riziko infertility [88]. Zdá se, že vyšetřování poškození DNA spermií se dá považovat za nový důvěryhodný biomarker mužské infertility. Poškození DNA spermie je spojeno s delším časem potřebným k otěhotnění než u fertilních párů, může zapříčinit selhání fertilizace, může se odrazit ve zhoršené morfologii embryí, s dopadem na dělení embryí, formaci blastocyst, snížením implantace po IVF a také s vyšším rizikem těhotenských ztrát jak po IVF, tak po ICSI. Poškozená DNA spermie může být inkorporována do embryonálního genomu a tak vést k chybám v DNA replikaci, transkripci a translaci v průběhu embryogeneze a může tím přispět k nemocem v příštích generacích [4]. Existuje celá řada metod, které umožňují kvantifikovat poškození chromatinu. Testy ke zjišťování poruch chromatinu jsou například kometový test - COMET assay, Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA), Terminal transferase dUTP Nick End Labelling assay 177 (TUNEL) nebo Sperm Chromatin Dispersion test (SCD test) či Halo test. Limitací těchto testů je, že testované spermie nejsou vhodné ke klinickému použití. Metodou FISH lze vyšetřit u spermií rovněž strukturální chromozomální abnormity. Ve snaze obejít tento problém jsou vyvíjeny další testy, které by pomohly embryologům vybrat spermii s malým DNA poškozením pro ART. d) Selekce zralých spermií U zralých spermií byl prokázán výrazně nižší výskyt chromozomálních anomálií (viabilní, bez retence cytoplasmy, nižší fragmentace DNA). Byla tedy vyvíjena řada metod s cílem získat zralé, strukturálně intaktní spermie s vysokou integritou DNA. Mezi tyto metody patří např. selekční metody založené na elektrických a magnetických vlastnostech spermie [26, 80], metody založené na apoptóze spermií, metody založené na ultramorfologii spermie (IMSI) a také selekční metody založené na zralosti membrány spermie (PICSI) [38]. Preselektovaná spermie pro intracytoplazmatickou injekci (PICSI) Analýza spermatu pro oplození oocytů neposkytuje další informace o spermiích, např. jaká je zralost jádra, integrita chromatinu či schopnost vazby spermie na oocyt. Sperma s dobrou koncentrací a pohyblivostí spermií nezaručuje oplození oocytu a zdárný vývoj embrya. Nehledě k faktu, že při in vitro fertilizaci je třeba oplozovat oocyty takovým spermatem, který je k dispozici a který velmi často nesplňuje ani hranici normy. Při obvyklých postupech ICSI jsou spermie pro injekci selektovány embryologem ve světelném mikroskopu vizuálně na základě jejich morfologie a pohyblivosti. Metoda PICSI dovoluje výběr spermie rozšířit o jeden další důležitý kvalitativní paramet, a to zralost resp. lepší genetickou výbavu (zralé spermie mají výrazně nižší výskyt chromozomálních aberací). Selekce zralých spermií je založena na základě jejich schopnosti vázat se k hyaluronanovému hydrogelu, neboť pouze hlavička zralé spermie nese receptor, který tuto vazbu umožňuje [37]. Kyselina hyaluronová je hlavní komponentou cumulus oophorus vrstvy buněk obklopující oocyt. Chemicky se jedná o polypeptid tvořený z opakujících se jednotek N-acetylglukozaminu a kyseliny glukuronové. Při oplození je z akrozomu spermie uvolňován mimo jiné enzym hyaluronidáza, který rozrušuje spoje buněk corona radiata a umožňuje vazbu spermie k zona pellucida. Bylo prokázáno, že spermie selektované touto 178 technikou jsou viabilní, bez retence cytoplasmy, mají nižší fragmentaci DNA a nižší markery apoptózy [41]. Metodu PICSI popisuje a hodnotí naše Publikace XXI. Materiál a metodika: Metodu PICSI jsme zavedli ve druhé polovině roku 2010. V úvodním 4 měsíčním souboru jsme provedli pomocí PICSI oplození oocytů 40 pacientkám. K výběru spermie je třeba speciální misky pro PICSI (PICSI® Sperm Selection Device MidAtlantic Diagnostics, Inc.), což je polystyrenová kultivační miska se třemi mikrokapkami hyaluronanu přichycenými na vnitřní stranu dna misky (obr. 32). Kapky jsou pro zviditelnění označeny šipkami na vnější straně dna misky. Hyaluronové mikrokapky je třeba před přidáním spermií nejdříve hydratovat médiem, což způsobí nabobtnání gelu a umožní vazbu spermií. Zralé spermie rozpoznají strukturu hyaluronanu a navážou se na něj (obr. 33). V mikroskopu je poznáme tak, že při intenzivním pohybu bičíku nevykazují progresivní pohyb. Pomocí mikromanipulační pipety jsou následně tyto spermie nasáty, přeneseny do samostatné kapky média použity k injekčnímu vpravení do cytoplazmy metodou ICSI [130]. Obr. 32: Miska pro PICSI Obr. 33: Spermie navázané na hyaluronan Výsledky: 1. V období zavádění metody (od července do konce října 2010) jsme pomocí PICSI oplozovali 152 MII oocytů od 40 pacientek. Ve 34 případech (85,0 %) byl spermiogram pod hranicí normy buď ve všech, nebo alespoň jednom parametru - koncentrace spermií (mil/ml), procento pohyblivých spermií, morfologie. 2. Oplozeno bylo 142 oocytů (fertilization rate 93,4 %) oproti dlouhodobému průměru 89,2 % 179 při ICSI bez selekce. 3. Transfer embryí byl proveden u 38 pacientek, přičemž u 21 z nich bylo dosaženo těhotenství, což bylo 55,3 % PR. U standardní metody ICSI bylo v tomto období dosahováno PR 38,2 %. 4. Od konce roku 2010 je PICSI zavedenou a rutinně prováděnou metodou v naší laboratoři. 5. Ze souboru 1090 pacientek, u kterých jsme prováděli oplozování intracytoplazmatickou injekcí, si 779 pacientek přálo provést výběr zralých spermií. Znamená to, že v 71,5 % volili pacienti ten nejkvalitnější výběr spermií, který v současných podmínkách v klinické praxi poskytujeme. Závěr: PICSI je perspektivní metodou pro zlepšení výsledků ICSI. Lze ji doporučit v případě nízkého počtu oplozených oocytů, nedostatečného vývoje embryí v předchozích výkonech a v případě opakovaných těhotenských ztrát. Očekávaná výhoda PICSI spočívá v tom, že u spermií selektovaných pomocí hyaluronanu je frekvence chromozomálních disomií a diploidií v normálním rozmezí, a to nezávisle na frekvenci aneuploidií v počátečním spermatu. e) Proteom seminální plazmy Seminální plazma je důležitou složkou spermatu, která vytváří „životní prostředí“ pro spermie. Obsahuje mnoho proteinů, jejichž zdrojem je varle, nadvarle a přídatné žlázy. Vyskytují se v něm mimo jiné i proteiny, které jsou důležitými markery patologií reprodukčního ústrojí. Patologie spermatu jsou spojeny s rozdílnou expresí proteinů přítomných v seminální plazmě. Technologie dvourozměrné gelové elektroforézy kombinovaná s identifikačními možnostmi spektrometrie byla úspěšně aplikována na komplexní proteom spermatu [65]. Cílem naší práce bylo pomocí stejné metody analyzovat, zda jsou nějaké rozdíly v proteomu seminální plazmy mužů s azoospermií a dárců spermatu s normospermií. Tématu proteomu seminální plazmy se věnujeme v Publikaci XXII. Materiál a metodika: Vzorky seminální plazmy byly získány po centrifugaci ejakulátu (2790g, 10 minut) od 6 mužů s normálním spermiogramem a 6 mužů s azoospermií. Supernatanty byly staženy do kryozkumavek a zamrazeny. K vyšetření byly transportovány do Centrální laboratoře Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecké fakulty MU v Brně. 180 Proteiny ve vzorcích byly solubilizovány a výsledné proteinové izoláty byly separovány dvourozměrnou gelovou elektroforézou. Kvalitativní a kvantitativní rozdíly byly vyhodnoceny programem PDQuest a Mascot [17]. Výsledky: 1. Vyšetření byla provedena na vzorcích od 6 normospermiků a 6 mužů s azoospermií. 2. Mezi oběma skupinami byly zjištěny četné kvalitativní i kvantitativní rozdíly. Na základě výsledků analýzy obrazu bylo pomocí hmotnostní spektrometrie identifikováno osmnáct kvalitativně odlišných proteinů. Závěr: Bylo nalezeno 18 kandidátních proteinů, které mohou být potenciální markery azoospermie. Vyšetření seminální plazmy přináší nové možnosti poznání patologie spermatu. Dalším důležitým krokem pro klinické využití bude stanovení funkce jednotlivých proteinů a jejich podílu na snížení plodnosti. 4.2. Hodnocení kvality embryí Kvalita embryí a jejich výběr pro embryotransfer jsou od samých počátků prováděn na základě morfologických znaků pomocí klasické mikroskopie. Nicméně pravděpodobnost uchycení takto vybraných embryí po implantaci do dělohy a následného rozvinutí těhotenství obecně nepřesahuje 35 %. Proto jsou hledány nové metody, které by nám o embryu a jeho životaschopnosti poskytly další údaje. Jak následně určit po všech stránkách kompetentní embryo pro transfer, k tomu slouží sofistikované a objektivní hodnocení přednostně neinvazivními metodami. a) Biomarkery metabolismu embryí V současné době jsou k dispozici vysoce citlivé analytické techniky umožňující přesnou detekci molekul, které souvisí s metabolismem embrya v prvních dnech jeho vývoje. Jednotlivé metabolity jsou výsledkem všech předchozích regulačních procesů na úrovni genomu a proteomu a proto dávají cennou informaci o výsledné reakci. V uplynulých letech byl analyzován metabolismus embryí kultivovaných in vitro a hodnocen jejich vztah k morfologii a dosažení těhotenství. Pozornost byla soustředěna nejčastěji na metabolismus aminokyselin, 181 glukózy a pyruvátu. Aminokyseliny jsou základními stavebními jednotkami proteinů a jako takové jsou součástí kultivačních médií. Změny hladin aminokyselin odráží metabolické funkce dělících se buněk [11]. Glukóza a pyruvát patří k základním látkám, ze kterých embryo získává energii. V časných stádiích vývoje je hlavním zdrojem energie pyruvát a laktát. Schopnost metabolizovat glukózu se zvyšuje při přechodu ze stádia moruly do blastocysty. Spolehlivé stanovení metabolitů biologických systémů vyžaduje adekvátní metody analýzy. K stanovení změn složení kultivačních médií lze využít široké spektrum analytických technik, jako jsou kapilární elektroforéza, plynová a kapalinová chromatografie, ve spojení s detektory pracujících na různých fyzikálních principech. K nejčastěji využívaným metodám patří hmotnostní spektrometrie (MS – mass spectrometry [44], kapilární elektroforéza v kombinaci s MS, kapalinová chromatografie v kombinaci s MS a plynová chromatografie s MS [22]. Zajímavou alternativou pro metabolomické studie je kombinace kapilární elektroforézy s bezkontaktní vodivostní detekcí (CCD - contactless conductivity detection) [66]. Naše centrum AR spolupracuje s výzkumnou skupinou Metabolomika z CEITEC Brno, která se v současnosti zaměřuje na využití CCD pro analýzu použitých kultivačních médií v asistované reprodukci. Výsledky by mohly poskytovat informace o metabolické aktivitě embrya a podpořit tak výběr embrya s nejvyšším implantačním potenciálem. Cílem vývoje je vytvoření metody, která by mohla být rutině používána v embryologických laboratořích. První klinické studie neinvazivního stanovení metabolomu média po kultivaci embryí prokázaly korelaci mezi zjištěným profilem a dosažením klinického těhotenství. Pro analýzu byla nejčastěji využita metoda NIR [111]. Při analýzách metabolismu pyruvátu bylo prokázáno, že zvýšený příjem pyruvátu embryem koreluje s jeho vývojem do stadia blastocysty [10]. V multicentrických studiích bylo také prokázáno, že metabolický profil kultivačního média embrya je nezávislý na morfologii a v kombinaci s morfologickým hodnocením embrya umožňuje výběr embryí s vyšším implantačním potenciálem [85]. Ve spolupráci s Ústavem biochemie Přírodovědecké fakulty MU a CEITEC v Brně jsme se snažili v roce 2011 učinit první kroky ke sledování metabolomu embryí. Byla zvolena metoda kapilární elektroforézy, která je vhodný analytický nástroj pro sledování bilancí koncentrací důležitých složek kultivačního média, jako jsou aminokyseliny a karboxylové kyseliny. Analyzovali jsme 6 vzorků kultivačního média G-1™ (Vitrolife, Švédsko) od embryí po 96ti 182 hodinách kultivace ve vývojovém stádiu morula. Z výsledků jsme nedošli ke globálním závěrům [53]. b) Hodnocení morfologie embryí Technologie neinvazivního hodnocení lidských embryí in vitro však nejsou stále ještě všeobecně dostupné. Techniky nejsou v klinické laboratorní praxi snadno a rychle aplikovatelné nebo analytické přístroje pro rutinní využívání nejsou dostupné. Většina embryologických laboratoří na celém světě proto stále ještě hlavní mírou vybírá embrya pro transfer na základě hodnocení jejich morfologie a vývojového potenciálu pomocí světelné mikroskopie. Protože jsou v systému hodnocení embryí a sledovaných parametrech velké rozdíly nejen v různých zemích, ale i mezi laboratořemi v rámci jedné země, sešli se zástupci mezinárodních společností Alpha Scientists in Reproductive Medicine a ESHRE Special Interest Group Embryology v roce 2011 v Istanbulu a zpracovali konsensus, který reprezentuje „minimální standard“ pro skórování oocytů a embryí [1]. Doporučují používat toto společné minimum popisného skórovacího systému pro všechny laboratoře s tím, že zvláště vhodné a přínosné to bude v případě publikací s mezinárodním významem, aby se zvýšilo vyžití poznatků pro každodenní praxi v kterékoliv laboratoři světa. „Timing“ sledování vývoje embrya je uveden v tabulce 8. Optimální morfologie oocytu: sférická struktura obalena zona pellucida, průsvitná cytoplasma bez inkluzí, vyčleněné pólové tělísko. Oocyt s abnormáně velkým pólovým tělískem by neměl být oplozován, neboť je pravděpodobné riziko aneuploidie oocytu. Velké vakuoly (≥ 14 μm v průměru) obvykle vedou k selhání fertilizace. Optimálně fertilizovaný oocyt: sférický, má dvě pólová tělíska se dvěma centrálně umístěnými, stejně velkými prvojádry. Prvojádra by měla mít stejný počet a velikost jadérek. Prvojádra jsou hodnocena jako symetrická, nesymetrická a abnormální (obr. 34). Dělící se embrya: dle „Consensu“ embrya, která se dělí rychleji nebo později než je očekávaný interval, mají redukovaný implantační potenciál. Fragmentace je u dělících se embryí definována jako střední (≤ 10 %), přiměřená (10 -25 %) a těžká (≥ 25 %). Multinukleace (přítomnost více než 1 jádra v blastomeře) souvisí se sníženým implantačním potenciálem 183 embrya. Stejná velikost blastomer je důležitá od 2 do 8 buněčného stádia. Ve všech dalších stádiích je nepravidelnost blastomer spojena s různou fází dělení. Další morfologické znaky, které se hodnotí jsou granulace cytoplazmy, vzhled membrán, přítomnost vakuol. Důležité je trojrozměné rozvrstvení buněk v embryu. Tab. 8 : „Timing“ sledování fertilizovaného oocytu a optimálního embryálního vývoje dle Istanbulského consensu Typ hodnocení Čas po inseminaci (hod) Očekávané vývojové stádium kontrola fertilizace 17 ± 1 stádium prvojader (PN) kontrola syngamie 23 ±1 50 % - stádium syngamie více než 20 % - 2 buněčné čané rýhování 26 ± 1 po ICSI 28 ± 1 po IVF 2 buněčné stádium embryo den 2 (Day-2) 44 ± 1 4 buněčné stádium embryo den 3 (Day-3) 68 ± 1 8 buněčné stádium embryo den 4 (Day-4) 92 ± 2 morula embryo den 5 (Day-5) 116 ± 2 blastocysta Obr. 34: Oplozený oocyt ve stádiu zygoty s prvojádry, v jádrech jsou patrna jadérka, zvětšení 300 x 184 Morula: Optimálně by dělící se embryo mělo být v době 92 ± 2 hodiny ve stádiu moruly. Mělo by být kompaktující nebo kompaktované po celém povrchu. Horší prognózu mají moruly s některými (2 až 3) buňkami vyloučenými mimo povrch. Blastocysta: Optimálně by měla být úplně expandovaná s prominující ICM s rozpoznatelnými buňkami k sobě těsně přiléhajícími a s trofektodermem, který je tvořený množstvím buněk, které formují kompaktní epitelium. Hodnocení embryí v naší laboratoři provádíme za 16 až 18 hodin po oplození, kdy u zygot sledujeme přítomnost a symetrii prvojader, rozložení a počet jadérek a pozice pólových tělísek. U dělícího se embrya hodnotíme počet blastomer v závislosti na dni kultivace, souměrnost blastomer, přítomnost fragmentů, případně multinukeace blastomer, počet jader a vakuoly. U moruly hodnotíme stupeň její kompaktace. U blastocysty hodnotíme její expanzi, vzhled ICM, blastocoel a buňky trofektodermu. Klasické hodnocení provádíme 1x denně ve světelném mikroskopu. Přestože tyto tradiční systémy hodnocení morfologie zárodečných buněk a embryí dosáhly již svého limitu při výběru optimálního embrya pro transfer, zůstávají pro embryology stále užitečným nástrojem. Pro pokrok v této oblasti je však žádoucí a nezbytné, abychom dostávali stále více informací a hlavně přesnějších informací nejen o morfologické kvalitě, ale i o fyziologické aktivitě jednotlivých embryí. c) Preimplantační genetická diagnostika (PGD) a preimplantační genetický screening (PGS) K vitalitě embrya přispívá jeho správná genetická výbava, avšak bez biopsií a vyšetření blastomer pomocí metod PGD nebo PGS nejsme schopni genetické abnormality zjistit. PGD, která byla poprvé ve světě provedena v roce 1989 [32] možňuje objevit jak poruchy v počtu, tak stavbě chromozomů a také genové mutace. To znamená změny ve stavbě genetické informace, které by mohly vyvolat vznik vrozené vady. Je možno zjišťovat jak genetické vady, které očekáváme, tak i vady náhodně vzniklé při vývoji vajíček a spermií. Indikací k PGD jsou např. vrozené chromozomální aberace u některého z rodičů, vyšší věk ženy, nebo obou rodičů, porod 185 dítěte s vrozenou vývojovou vadou v rodině, opakované spontánní potraty nejasné etiologie, závažný andrologický faktor atd. Pomocí PGD je možno vyšetřit aneuploidii embryí (metodou FISH), nebalancované translokace embryí (FISH) a monogenně dědičné choroby (PCR). V současné době se nejčastěji využívá metoda array CGH, která pracuje na principu mikročipové technologie (tzv. microarray). Hlavní změnou oproti starším postupům je mnohonásobně vyšší přesnost při záchytu dědičných onemocnění a možnost vyšetřit všechny chromozomy embrya. Metoda FISH dovoluje analýzu omezeného počtu chromozomů, nejčastěji 7 až 9. Munné et al. uvádí, že při vyšetření 10 až 12 chromozomů, se přesnost FISH zvyšuje na 89 až 91 % aneuploidií [63]. Metody PGD a PGS mají své nezastupitelné místo v indikovaných případech. Selekcí a transferem embrya, v jehož blastomeře nebyla prokázána aneuploidie chromozomů, se výrazně zlepšily výsledky léčby. V závěrech meta-analýzy randomizovaných studií v roce 2011 uvádí autoři, že v současné době neexistuje důkaz o přínosu PGS pro zvýšení počtu živě narozených dětí po IVF a u žen vyššího věku PGS signifikantně počet živě narozených dětí snižuje [56]. Příčinou je především mozaicismus jednotlivých blastomer. Z těchto důvodů rutinní provádění PGS ve všech IVF cyklech nedoporučuje ani „ESHRE PGD Consortium“ ve svém rozboru desetiletého sběru dat [33]. Na našem pracovišti provádíme PGD od roku 2000 a PGS od roku 2012. V roce 2001 jsme dosáhli narození prvního dítěte po PGD. V letech 2000 až 2013 jsme provedli u 139 pacientek odběr blastomer pro genetické vyšetření metodami FISH, PCR a aCGH. U 88 pacientek bylo po genetickém vyšetření alespoň jedno embryo vhodné k transferu. Dosáhli jsme 29 klinických těhotenství, což je 32,9 % PR. Alternativou velmi nákladné PGS by mohl být neinvazivní monitoring embryonálního vývoje s predikcí výskytu chromozomálních anomálií [34]. 4.2.1. Kontinuální monitoring vývoje embryí Ve snaze vybrat co nejkvalitnější embryo na transfer provádíme v průběhu kultivace každodenní hodnocení jeho vývoje. Klasický způsob hodnocení embryí používaný běžně v laboratořích se provádí jednou denně pod mikroskopem, kdy embrya opouští na několik minut 186 konstantní prostředí kultivačního boxu. Tradiční morfologické hodnocení bylo doplněno kontinuálním sledováním vývoje embryí zavedením time-lapse systému [77]. Pravidelnost a rychlost dělení embrya úzce souvisí s jeho správnou životaschopností a dosažením těhotenství. Pravidelné dělení buněk je projevem správného počtu chromozómů a genetické informace v nich obsažené. Odhalení poruch dělení buněk embrya, které je možné právě díky průběžným záznamům, umožňuje vyřadit a netransferovat embrya s výskytem chromozomálních abnormalit, které by mohly vést k časným potratům. Indikací k monitorování jsou hodnoty spermiogramu na spodní hranici normy, nízká fertilizace po ICSI, nepříznivý vývoj embryí v předchozích cyklech, opakované potraty v anamnéze léčeného páru, vyšší věk ženy. V současné době je nejvíce používán systém Primo Vision (Vitrolife, Švédsko), nebo Embryoscope (Unisense Fertilitech Dánsko), velmi sofistikovaný monitorovací přístroj obsahující inkubátor, mikroskop a počítač. Retrospektivní analýza dat ukazuje, že kultivace a výběr embryí po time lapse monitoringu signifikantně zvyšuje pravděpodobnost klinického těhotenství. (+15,7 % na embryotransfer) [59]. Ke zvýšení PR přispěla dvě pozitiva tohoto systému, a to kombinace stabilních kultivačních podmínek a užití morfokinetických parametrů k selekci embrya [75]. Multicentrická retrospektivní analýza [80] zjistila limitovanou implantaci těch embryí, která vykazovala v době první mitózy rozdělení z 1 na 3. Takové pozorování může být uděláno pouze při time lapse. Při statickém hodnocení by nepravidelnost dělení nemohla být zachycena. V roce 2011 jsme zavedli kontinuální hodnocení vývoje embryí pomocí zařízení Primo Vision System (Cryo-Innovation Technologies, Hungary, nyní Vitrolife Švédsko), jak uvádíme v Publikaci XXVI. Materiál a metodika: Systém sestává z kompaktního digitálního inverzního mikroskopu s kamerou umístěného v uzavřeném inkubátoru a z řídící počítačové jednotky a monitoru (obr. 35, 36). Kamera každých 15 minut pořizuje 5 sekundový záznam. K řídící počítačové jednotce může být připojeno až 6 sběrných kamer a mohou se tak monitorovat embrya od šesti paientek. Analýza morfologie a dynamiky vývoje se provádí z časosběrného digitálního záznamu na monitoru. 187 Embrya jsou pro toto sledování umístěna na speciální WOW misce v kultivačním médiu pod minerálním olejem v 9 nebo 16 samostatných jamkách. Jedna miska je určená vždy pro jednu pacientku. Výsledky: 1. V zaváděcím období od března do června 2011 jsme měli možnost se seznámit se zařízením Primo Vision Systém, který jsme měli zapůjčený a s technikou odečítání a vyhodnocovaných časosběrných záznamů. V tomto období jsme monitorovali vývoj embryí u 22 pacientek a k transferu vybírali embrya s pravidelným dělením a odpovídající dynamikou vývoje. Dosáhli jsme 9 těhotenství, což činilo 40,9 % PR. 2. Výsledky nás vedly k rozhodnutí zakoupit vlastní Primo Vision systém, který byl postupně zdokonalován a bylo na něm provedeno up grade na 3D rozlišení. 3. Od června 2011 do konce roku 2013 jsme provedli kontinuální záznam vývoje embryí u 133 pacientek. V případě 4 pacientek nebylo žádné embryo dle hodnotících kritérií vhodné k transferu. Bylo dosaženo 51 těhotenství, což představuje 39,5 % PR (tab. 9). 4. Provedli jsme analýzu vývoje kultivovaných embryí v závislosti na jejich dosažené kvalitě před transferem a určili jsme si limitní časové hranice, do kterých by se mělo embryo v určitou dobu kultivace vejít, aby mohlo být označeno za embryo s dobrou šancí a bylo přednostně vybráno pro embryotransfer: - optimální interval od provedení ICSI do stádia 2 buněk: 20 až 26 hodin - optimální interval od stádia 2 buněk do 4 buněk: 10 až 13 hodin - optimální interval od stádia 4 buněk do 8 buněk: 14 až 18 hodin - optimální interval od stádia 8 buněk do 16 buněk: 20 až 30 hodin Závěr: Metodou výběru embrya na základě kontinuálního monitorování a hodnocení jeho vývoje jsme významně zvýšili úspěšnost asistované reprodukce. Embya s nepravidelným dělením mají limitovaný vývojový potenciál, mají četné chromozomální abnormality a neměla by být transferována. Kontinuální hodnocení je objektivní, neboť podává přesné výsledky dělení buněk dle daného časového harmonogramu. Je založeno na hodnocení vývojového stadia embrya ina posouzení dynamiky jeho vývoje. 188 Kontinuální monitorování vývoje přineslo významný pokrok v hodnocení embryí, neboť nejdůležitější momenty v dělení buněk, svědčící o kvalitě embrya, zůstávají při pouhém stacionárním pozorování skryty. Tab. 9: Přehled celkového počtu monitoringů a počtu gravidit v jednotlivých letech na GPK LF MU a FN Brno Rok Počet monitoringů + embryotransfer Počet gravidit PR (%) 2011 zaváděcí obd. 22 9 40,9 2011 19 9 47,4 2012 35 12 34,3 2013 75 30 40,0 Celkem 151 60 39,7 Obr. 35: Monitorovací zařízení Primo Vision Obr. 36: Kamera v CO2 inkubátoru Systém 189 PUBLIKACE XXI 190 191 192 193 PUBLIKACE XXII 194 195 196 197 198 PUBLIKACE XXIII 199 200 201 202 203 5. PERSPEKTIVY KLINICKÉ EMBRYOLOGIE A VÝVOJ MODERNÍCH METOD Předpovědět vývoj moderních metod klinické embryologie, tak jako všeobecně u biologických věd, není jednoduchý. Ale cesty jak postupovat v tomto směru dál jsou nadějné a aplikovatelné z jiných oborů, které jsou podstatně dál. Vývoj se bude ubírat cestou změny laboratorních technologií a technického vybavení. V přirozených podmínkách se preimplantační embryo vyvíjí v neustálém pohybu, který je způsoben svalovými kontrakcemi a pohybem řasinkových buněk při průchodu vejcovodem. Tento pohyb zajišťuje stálou obnovu okolní tekutiny. Při statické kultivaci v inkubátoru se nic podobného neděje. Proto se bude přecházet k vývoji dynamického kultivačního systému, který bude založený na třepání, rotaci, míchání, vibracích a kontrolovaném toku média. Budou používány mikro a ultramikrokapky nebo mikrojamky se speciálními povrchy krytými třírozměrnými matricemi, které budou vytvářet podmínky podobné prostředí in vivo [46]. S narůstajícím rozvojem nano-a mikrofluidní technologie přicházejí nové technologické možnosti. Mikrofluidní mikroprostředí ve své podstatě lépe napodobuje prostředí pro vývoj in vivo. Využití této technologie bude použitelné jak pro chemické analýzu prostředí (transkriptom, proteom, metabolom, sekretom) až po neinvazivní výběr optimálních embryí [89]. Kombinace neinvazivních a invazivnívh přístupů dovolí zkoumat oblast „- omics“ s přístupem k mRNA, proteinům a metabolitům, s potenciálem zvýšit pregnancy rate [82, 85]. Tato strategie by měla být cestou ke zlepšení kultivačního systému. Dalším úkolem do budoucna je najít vhodný model pro testování epigenetického efektu kultivačních médií v lidské asistované reprodukci. Zdá se, že IVF ani ICSI neovlivňují metylaci DNA, avšak je zřejmé, že kultivace in vitro může defekty metylace indukovat [43, 62, 64]. Technicky je možné vynalézt test za použití embryonálních kmenových buněk nebo zvířecích modelů, avšak limituje nás to, že zatím neumíme interpretovat výsledky testování. Dalším aspektem kultivace lidských embryí, který si zaslouží velkou pozornost je sledovatelnost resp. ochrana záměny vzorků. Nedávno byl navržený hlídací systém pomocí nálepek s čárovým kódem, kterým byly označeny všechny laboratorní pomůcky používané pro jednu pacientku. Nový přístup navrhuje přímé označení oocytu, kde je „značka“ umístěna přímo na zona pellucida. Míra identifikace počínaje oocytem až do stádia blastocysty je tedy 100 %, i po 204 mikromanipulaci či vitrifikaci. Tento způsob by měl být dalším charakteristickým rysem kultivačního systému nové generace embryí v laboratoři budoucnosti [54]. Nové přístroje, jako robotický systém pro ICSI byl již úspěšně použitý u křeččích oocytů, a klinické zkoušky mají začít v dohledné v budoucnosti [52]. Byla již také představena plná automatizace dalších technik, jako například kryokonzervace [113]. Jsou vyvíjeny dokonalejší software pro hodnocení záznamů kontinuálního vývoje a výběr embryí. Závěr: Přestože plně robotická automatizace jako zatím futuristická vize může přinést větší objektivitu a kontrolu všech fází procesu v embryologické laboratoři, nikdo a nic, než embryolog může pozorovat, vyvozovat závěry, zjistit problémy a navrhnout řešení. Pouze embryologové se svými nejlepšími znalostmi mohou využít technologických pokroků a zajistit příchod „nové generace embryí“. 205 6. DATA Z EVROPSKÉHO A ČESKÉHO REGISTRU Revoluční techniky zavedené v průběhu minulých desetiletí – ICSI, PGD, prodloužená kultivace až do stádia blastocysty, vitrifikace gamet, embryí i tkání jsou dnes rutinně používány na celém světě. Přispěly k úspěchu ART - počtu úspěšně léčených pacientů na IVF klinikách po celém světě a počtu nejméně 5,5 milionů narozených dětí. Celosvětový stav v léčbě neplodnosti, dle výsledků generovaných z registrů Evropské společnosti pro lidskou reprodukci a embryologii [24] uvádí, že každý šestý pár má během svého života nejméně jednou problém s infertilitou. Ve 20-30 % případů jsou poruchy plodnosti na straně muže, ve 20-35 % na straně ženy, ve 25-40 % se jedná o problém obou partnerů a v 10-20 % není příčina známa. Infertilita je také spojena s faktory životního stylu jako kouření, obezita a stres. Dalším faktorem se vzrůstající věk žen, které si přejí otěhotnět. Nejvíce žen, které přicházejí k léčbě je ve věku 30 až 39 let. Podle údajů z roku 2010, ze kterého jsou posední dostupná data, provádějí evropská centra cca 55 % cyklů z celosvětových udajů. V roce 2010 bylo v 31 evropských zemích provedeno 565 031 léčebných cyklů. Nejvíce cyklů bylo provedeno ve Francii, Německu, Itálii, Španělsku a Velké Británii. V Americe bylo provedeno 147 260 cyklů a 61 774 cyklů v Austrálii a na Novém Zélandu [102]. Celosvětově nejčastější fertilizační technikou je ICSI, která činí dvě třetiny všech fertilizací. Nejvíce používanou technikou kryokonzervace oocytů a embryí je vitrifikace. Každý rok se celosvětově provede okolo 1,5 milionu cyklů asistované reprodukce s cca 350 000 narozených dětí. Údaje z Národního registru asistované reprodukce České republiky Národní registr asistované reprodukce (NRAR) eviduje údaje o provedených cyklech AR v České republice a je v plném provozu od 1.1.2007. Je veden ÚZIS, nezávislým státním úřadem, „cycle by cycle“, je prospektivní a povinný. Data z Národního registru České republiky z let 2007 – 2011 uvádějí 107 529 cyklů asistované, což činí v průměru cca 21 500 cyklů za rok. Ve věkové skupině do 34 let je patrný postupný úbytek cyklů (ze 7200 na 5661), zatímco ve věkové slupině žen od 34 do 40 let cyklů mírně přibývá (z 773 na 4750). Největší nárůst zaznamenaly dárcovské cykly. V roce 2008 jich bylo 98, zatímco v roce 2011 jich bylo již 3523 [79]. 206 E. DISKUSE Předkládaná práce je první práce v české literatuře, která se zabývá v přehledovém pojetí problematikou klinické embryologie. Komentáře k jednotlivým publikacím a zaváděným laboratorním metodám jsou proto uvedeny v širších teoretických souvislostech a témata diskutována v příslušných kapitolách. Stručně jsou zmíněny perspektivy klinické embryologie, vývoj moderních metod a data z evropského a českého registru. Následující text předkládá několik témat k doplnění pohledu na klinickou embryologii. Z předložené práce je zřejmé, že zavádění nových laboratorních metod do klinické praxe nebylo vždy jednoduché. Autorka prošla obdobím, kdy vedle laboratorní práce s gametami a embryi bylo nutnou součástí práce embryoga zvládnout výrobu médií, pipet, mikropipet, odběrových a transferových souprav a dalších pomůcek. Podmínky pro práci jsou v dnešní době jednodušší a příjemnější, neboť embryologové mají k dispozici veškeré materiály, pomůcky, média a přístroje. Na trhu je mnoho firem s nejrůznějšími modifikacemi veškerých potřeb pro asistovanou reprodukci. Ne všechny metody, které byly postupně zavedeny, jsou využívány stejnou měrou. Některé metody jsou aktuální dodnes a jsou stále zdokonalovány (ICSI, PICSI), některé byly opuštěny brzy po zavedení (ZD, PZD, SUZI). Metoda prodloužené kultivace embryí do stádia moruly nebo blastocysty se stala běžnou každodenní praxí. Kryokonzervace je využívána pro velkou oblast výkonů a mnoho indikací. Zvládnutí jednotlivých technik bylo náročné. Některé techniky jsou náročné na zručnost, některé na čas a některé na trpělivost pracovníka. Např. provádění mikromanipulací vyžadovalo před vlastním klinickým prováděním náročný trénink ovládání mikromanipulačního zařízení, zručnosti a nácvik jednotlivých pohybů mikropipetami na neoplozených oocytech. Příprava bioptovaného materiálu pro preimplantační genetické vyšetření vyžaduje zručnost, trpělivost a pečlivost. Metoda kontinuálního hodnocení embryí z time lapse záznamu vyžaduje čas a pečlivý odečet klíčových momentů vývoje embrya. Všechny metody klinické embryologie vyžadují od laboratorního pracovníka nejen odborné znalosti, zručnost a dodržování pravidel laboratorní práce [99], ale také odpovědný přístup, spolehlivost, pečlivost a schopnost kominukace s pacientem. Klinický embryolog musí kromě laboratorní práce 207 zvládat stále více i práci dokumentační a dodržovat požadavky zákona 296/2008, „Zákon o zajištění jakosti a bezpečnosti lidských tkání a buněk určených k použití u člověka a o změně souvisejících zákonů (zákon o lidských tkáních a buňkách), Vyhlášky 422/2008 o stanovení bližších požadavků pro zajištění jakosti a bezpečnosti lidských tkání a buněk určených k použití u člověka a Zákona č. 373/ 2011 Sb. „O specifických zdravotních službách (vybrané kapitoly)“. Řada laboratorních metod a technik klinické embryologie slouží jednoznačně ke zlepšení léčby neplodnosti, avšak právě tyto výkony nejsou hrazeny zdravotními pojišťovnami. Jedná se o nejčastěji využívanou prodlouženou kultivaci embryí, mikromanipulační metody ICSI, PICSI a asistovaný hatching. Výběr kvalitních embryí pomocí kontinuálního monitorování jejich vývoje nebo využití programu dárcovství a ochrany fertility není rovněž pojišťovnami hrazeno. Všechny tyto přístrojově, materiálově i časově náročné metody si proto musí klienti uhradit sami. Podle současně platných zákonů hradí zdravotní pojišťovny základní výkony u třech cyklů IVF s přenosem embryí. Za podmínky přenosu pouze jednoho embrya v prvních dvou cyklech hradí zdravotní pojišťovna ještě čtvrtý cyklus. Důležitou podmínkou u ženy podstupující umělé oplodnění je věk 22 – 39 let, pouze při oboustranné neprůchodnosti vejcovodů je dolní hranice snížena na 18 let. Výkony jsou vykazovány na rodné číslo ženy, což může někdo považovat za diskriminující, neboť muž může během svého života dosáhnout ze zdravotního pojištění na více hrazených cyklů asistované reprodukce, než česká žena. Jak už bylo uvedeno v úvodu, klinická embryologie existuje v České republice prakticky již 30 let. Dosud je realitou, že práci klinického embryologa vykonávají v centrech asistované reprodukce lékaři, přírodovědci, veterinární lékaři, zemědělští inženýři a další profese. Praktické zaměření oboru klinická embryologie a praktické kompetence embryologů do platnosti Vyhlášky č. 55/2011 Sb. nebyly určeny. Autorka habilitační práce spolu s dalšími členy výboru Asociace reprodukční embryologie (ARE), především s prof. MUDr. Pavlem Trávníkem, DrSc. a RNDr. Alicí Malenovskou ve spolupráci se Sekcí asistované reprodukce (SAR) ČGPS ČLS JEP zpracovali některé důležité materiály. Výbor ARE předložil pravidla pro činnosti a odpovědnosti pracovníků laboratoří, která vycházejí z vyhlášky a současně uvádějí modifikaci pro současný stav, kdy ještě nelze dodržet všechny předepsané podmínky odborné a specializované způsobilosti [134]. Výborem ARE byla také definována teoretická a praktická náplň oboru klinická embryologie, jako zdravotnického, vědeckého a vzdělávacího oboru [98]. 208 F. ZÁVĚR Technologie asistované reprodukce zaváděné na našem pracovišti od 90. let minulého století (tab. 10) a používané v současné době se postupně vyrovnaly se všemi faktory neplodnosti, od tubární neprůchodnosti přes mužský faktor neplodnosti, endometriózu, dysfunkci ovulace, snížení ovariální rezervy až po neplodnost z nevysvětlitelné příčiny. Asistovaná reprodukce se stala efektivní možností pro páry, kterým podstoupení PGD nebo PGS zabrání narození dítěte s genetickou zátěží. Onkologickým pacientům slouží techniky asistované reprodukce k zachování fertility i po agresivní onkologické léčbě. Metody zaváděné do klinické praxe byly předmětem desítky grantových úkolů IGA MZ ČR I. kategorie, které byly na našem pracovišti řešeny. 1. V letech 1995 až 1996 byla studována kvalita kultivačního prostředí nepřímo, na základě posouzení ultrastruktury buněk cumulus oophorus a spermií, které byly kultivovány společně s oocytem. Dobře zachovaná ultrastruktura buněk cumulus oophorus i spermií svědčila o optimálních kultivačních podmínkách. Studiem přítomnosti a působení kyslíkových radikálů v kultivačním systému vyplynulo, že všechny poškozené a zankající buňky kumulu a spermie jsou zdrojem ROS. Tyto poznatky vedly ke zkrácení doby, po kterou zůstávaly oocyty v kultivačním médiu společně s kumulárními buňkami a spermiemi. Řešili jsme, jak prodloužit délku kultivace embryí in vitro, kdy stávající kultivační média neposkytovala vhodné prostředí pro vývoj embryí déle, než dva dny. Od roku 1993 jsme prodloužili dobu kultivace in vitro až na 120 hodin a dosáhli stádia blastocysty, společnou kultivací embryí, tzv. kokultivací, s lidskými oviduktálními buňkami. Od roku 1994 jsme začali využívat plně definované syntetické médium M3 (MediCult, Dánsko). Oba způsoby prodloužené kultivace byly plně srovnatelné v kvalitě embryí i procentu dosahovaných těhotenství. Postupně jsme od kokultivací upustili hlavně pro náročnost přípravy misek s monovrstvou oviduktálních buněk. Prodloužená kultivace v syntetických médiích se stala naší každodenní praxí a je prováděna v 98,5 % výkonů IVF. 209 2. Byly zavedeny mikromanipulační techniky oplozování oocytů. Fertilizační mikromanipulace jsme začali provádět s perspektivou dosažení oplození nebo zvýšení procenta oplozených oocytů v případech těžkého andrologického faktoru sterility. Metoda ICSI se stala od roku 1996 nejpřínosnější a nejpoužívanější mikromanipulační technikou. Je vhodná i v případech nízkého procenta oplozených oocytů až selhání oplození při normálních hodnotách spermiogramu, v případě malého množství získaných oocytů, u starších žen, pro oplozování v programu darovaných oocytů a před preimplantační genetickou diagnostikou. V současné době se provádí ve více než 90 % výkonů AR ročně. V návaznosti na ICSI jsme zavedli metodiku pro použití spermií získaných mikrochirurgickými technikami MESA/ TESE a pro spermie získané z retrográdní ejakulace. Od roku 1994 provádíme asistovaný hatching. Techniku, která napomáhá uvolnění embrya ze zona pellucida a tím jeho implantaci provádíme v současné době u 98,5 % embryotransferů. Od roku 2001 provádímě biopsie buněk pro PGD, nejčastěji biopsii blastomer ze 6 až 8 buněčného embrya. 3. Metody kryokonzervace gamet, embryí a tkání jsme vyvíjeli od samých počátků v roce 1991. Vybudovali jsme první a největší spermabanku. Postupně jsme kryokonzervaci spermií začali využívat pro pacienty IVF programu a onkologické pacienty. Vybudovali jsme Centrum pro ochranu fertility. V neposlední řadě ochrana fertility do budoucna má svoje opodstatnění i u zdravých mužů. Kryokonzervaci embryí jsme zavedli v roce 1995. Sloužila zpočátku k uchování nadbytečných embryí pro příští transfery. Postupně se uplatnění rozšířilo na program dárcovství embryí i pro ochranu fertility onkologicky nemocných žen. Mrazení oocytů jsme poprvé provedli v roce 2003. Od roku 2010 mrazíme oocyty vitrifikací. Kromě dárcovského programu, a ochrany fertility, má mrazení oocytů význam pro ženy, které si zatím nepřejí těhotnět a mají zájem o zamrazení „mladých“ oocytů pro budoucí použití. Mrazení ovariální tkáně jako ochranu fertility onkologicky nemocných žen jsme začali provádět jako první centrum v ČR a máme s ním největší zkušenost. 4. V návaznosti na technické možnosti a zvyšující se kvalitu laboratorní práce, se zvyšuje úspěšnost léčby. Se snahou snížit počet transferovaných embryí a tím snížit počet vícečetných 210 gravidit, narůstá v novém tisícíletí snaha vybrat jedno nejkvalitnější embryo na transfer. Byly hledány možnosti jak vybrat kvalitní gamety a jak poznat nejlepší životaschopné embryo. Oocyty hodnotíme ve světelném mikroskopu podle morfologie, nejdříve komplexu oocytcumulus oophorus a po denudaci dle známek zralosti. Oocytů máme omezené množství, proto oplozujeme všechny zralé oocyty. Konvenční analýza spermatu nepodává informace o další charakteristice spermií, proto jsme hledali jak v praxi najít nejlepší spermie k oplozování. V roce 2010 jsme zavedli metodu PICI, která umožnila využít další parametr kvality spermie, její zralost a s tím související genetický potenciál. V 71,5 % případů oplozování, kdy je nezbytné provést ICSI volí pacienti metodu PICSI s výběrem kvalitnějších spermií. Kvalita embryí a jejich výběr pro embryotransfer byl od samých počátků hodnocen na základě morfologických znaků pomocí klasické mikroskopie. Z metod, které poskytují o embryu, jeho životaschopnosti a jeho genetické kvalitě další údaje jsme zavedli dvě metody hodnocení kvality embryí, a to PGD/PGS a kontinuální monitorování vývoje embryí. Od roku 2000 provádímě ve spolupráci s externí genetickou laboratoří PGD a od roku 2013 PGS s využitím metody array CGH na principu mikročipové technologie. Výběr embryí na základě neinvazivního kontinuálního monitoringu embryonálního vývoje pomocí Primo Vision Systému jsme zavedli do praxe v roce 2011. Kontinuálním snímáním vývoje embryí dostáváme přesné informace o pravidelnosti dělení buněk a dynamice vývoje v čase. Touto neinvazivní metodou výběru embrya jsme významně zvýšili úspěšnost asistované reprodukce. Centrum asistované reprodukce GPK LF MU a FN Brno a jeho embryologická laboratoř bylo a je předním pracovištěm asistované reprodukce v České republice, které se zabývá vývojem a aplikací nových metod a poskytuje celou šíři nejmodernějších metod s úspěšností léčby srovnatelnou s celosvětovou úrovní. Nespornou výhodou našeho pracoviště je, že se jedná o univerzitní centrum s kompletním klinickým zázemím, možností mezioborové spolupráce a zkušeným týmem odborníků. 211 Tab. 10: Přehled zaváděných metod a technik na pracovišti CAR GPK LF MU a FN Brno Rok Zavedená metoda 1991 Kryokonzercvace spermií 1992 Kryokonzervace embryí 1994 Prodloužená kultivace embryí Standardní provádění mikromanipuační techniky asistovaný hatching (AH) 1995 Zahájen program dárcovství spermií Intracytoplasmatická injekce spermie do oocytu (ICSI) Kryokonzervace spermatu mužů před onkologickou léčbou 1997 Program dárcovství oocytů a embryí Získání a zpracování spermií z nadvarlete (MESA) a verlete (TESE) 2000 Klinické provádění preimplantační genetické diagnostiky (PGD) 2004 Kryokonzervace ovariální tkáně u žen před onkologickou léčbou 2006 Získání spermií u mužů s retrográdní ejakulací 2007 Vitrifikace – metoda rychlého mrazení 2010 Kryokonzervace oocytů 2011 Kontinuální monitorování vývoje embryí (Primo Vision Systém) 212 G. PUBLIKACE AUTORKY ZAŘAZENÉ V TEXTU Publikace I…………………………………………………………………...….……….s. 24 Žáková J., Sedláčková M., Trávník P., Ventruba P. Morfologie buněk cumulus oophorus z komplexu oocyt-cumulus po oplození lidských oocytů in vitro. Gynekolog, 1996, 5, s. 209-212. Publikace II………………………………………………………………........................s. 29 Žáková, J., Sedláčková, M., Ventruba, P., Trávník, P. Vliv ultrastruktury spermií na výsledek fertilizace in vitro. Čes Gynek, 1997, 62, s. 3-6. Publikace III……………………………………………………………………………..s. 34 Žáková, J., Ventruba, P., Adler, J., Trávník, P. Kokultivace embryí s buňkami lidského vejcovodu v programu asistované reprodukce na I. gynek. porod. klinice v Brně. Gynekolog, 1995, 4, s. 124-127. Publlikace IV…………………………………………………………………………….s. 39 Ventruba, P., Žáková, J., Adler, J., Trávník, P., Komárková, J., Němcová, S. Prodloužená kultivace lidských embryí:srovnání kokultivace na lidských tubárních epiteliích a kultivace v syntetickém médiu. Čes Gynek, 1996, 61, s.27–33. Publikace V………………………………………………………………………………s. 58 Ventruba, P., Žáková, J., Crha, I., Němcová, S. Intracytoplasmatická injekce spermie do oocytu a asistovaný hatching - mikromanipulační techniky zvyšující úspěšnost programu fertilizace in vitro. Prakt Gyn, 1997, 1, s. 14-25. Publikace VI……………………………………………………………………………..s. 67 Pacík, D., Turjanica, M., Žáková, J. První zkušenosti s technikami MESA a TESE při léčbě infertilních mužů s azoospermií. Rozhl Chir, 1997, 76, 9, s. 463-467. Publikace VII…………………………………………………………………………….s. 73 Lousová, E., Žáková, J., Beharka, R., Ventruba, P., Pacík, D., Pochopová, H. Retrográdní ejakulace – jedna z příčin mužské neplodnosti. Prakt Gyn, 2008, 12, 1, s. 36-37. Publikace VIII…………………………………………………………………………...s. 76 Žáková, J., Ventruba, P., Němcová, S. Assisted hatching - results in women with repeated embryotransfer failure. Proceedings of the IXth World Congress on IVF and Assisted Reproduction, Monduzzi Editore, Bologna, Italy, 1995, p. 539-541. Publikace IX……………………………………………………………………………..s. 80 Ventruba, P., Žáková, J., Adler, J., Crha, I., Trávník, P. Mikromanipulace v oblasti zona pellucida embrya: asistovaný hatching 1994 – 1995. Gynekolog, 1996, 5, s. 37–41. Publikace X…………………………………………………………..………………...s. 103 Žáková, J., Ventruba, P., Lousová, E., Crha, I., Hudeček, R. Kryokonzervace buněk a tkání v asistované reprodukci. Prakt Gyn, 2011, 15, 1, s. 16–21. 213 Publikace XI……………………………………………………………….....….……..s. 110 Žáková, J., Ventruba, P., Petrenko, M., Višňová, H., Pelíšková, L. Factors influencing effectiveness of cryopreserved /thawed embryo transfer. Scripta Medica, 1998, 71, 1, p. 49- 56. Publikace XII…………………………………………………………………………...s. 118 Crha, I., Ventruba, P., Mardesic, T., Žáková, J. Dárcovství gamet - biologické, legislativní a etické aspekty. Čes Gynek, 1997, 62, 2, s. 72-75. Publikace XIII……………………………..…………………………………………...s. 123 Žáková, J., Ventruba, P., Crha, I., Lousová, E. Sperm Donation Programme at the Centre of Assisted Reproduction in Brno: 1995 – 2005 results. Scripta Medica Brno, 2005, p. 323-328. Publikace XIV……………………………………………..…………………………...s. 130 Žáková, J., Ventruba, P., Crha, I., Bulínová, E., Lousová, E. Možnost využití darovaných gamet nebo embryí při léčbě neplodnosti. Prakt Gyn, 2006, 3, s.105–107. Publikace XV…………………………………………………………..……………….s. 133 Crha, I., Ventruba, P., Petrenko, M., Žáková, J., Višňová, H., Kučera, M., Geryk, E. Kryokonzervace spermatu před onkologickou léčbou – 7 let zkušeností. Čes Gynek, 2002, 67, 6, s. 324–328. Publikace XVI……………………………………………………………………..…...s. 139 Crha, I., Ventruba, P., Huser, M., Žáková, J., Hudeček, R., Jarkovský, J. Survival and infertility treatment in male cancer patients after sperm banking. Fertil Steril, 2009, 91, 6, p. 2344-2348. Publikace XVII………………………………………………………………….……..s. 145 Žáková, J., Lousová, E., Ventruba, P., Crha, I., Pochopová, H., Vinklárková, J., Tesařová, E., Nussir, M. Sperm cryopreservation before testicular cancer treatment and its subsequent utilization for the treatment of infertility. The Scientific World Journal, 2014, article ID 575978, 5 pages, http://dx.doi.org/10.1155/2014/575978. Publikace XVIII………………………………………………………………..………s. 151 Huser, M., Juránková, E., Crha, I., Ventruba, P., Hudeček, R., Žáková, J., Šmardová, L., Král, Z. Kryokonzervace ovariální tkáně - šance na záchranu fertility žen s nádorovým onemocněním. Čes Gynek, 2007, 72, 1, s. 68-73. Publikace XIX………………………………………………………………..………...s. 158 Zakova, J., Sedlackova, M., Polak, S., Dumkova, J., Ventruba, P., Crha, I. Methods for preserving fertility in young women suffering from cancer: some aspects ofovarian tissue cryopreservation. Bratisl Med J, 2012, 113, 3, p.192-194. Publikace XX………………………………………………………………….……….s. 162 Huser M, Žáková J, Crha I, Šmardová L, Král Z, Revel A, Ventruba P. Kryokonzervace ovariální tkáně u onkologických pacientek – 6 let klinických zkušeností. Čes Gynek, 2012, 77, 2, s. 118-126. 214 Publikace XXI………………………………………………………………..………...s. 189 Žáková, J., Lousová, E., Crha, I., Ventruba, P., Pohanka, M., Nentwichová, P., Pochopová, H. PICSI – selekce zralých spermií pro oplození lidských oocytů metodou ICSI. Prakt Gyn, 2010, 14, 4, s. 180-182. Publikace XXII…………………………………………………………………..……..s. 193 Crha, I., Konečná, H., Žáková, J., Buršíková, J., Zdráhal, Z., Lousová, E., Ventruba, P., Pohanka, M. Proteom seminální plasmy u mužů s azoospermií. Prakt Gyn, 15, 2011, 2, s. 2-5. Publikace XXIII………………………………………………………………...…..….s. 198 Žáková J, Ventruba P, Crha I, Lousová E, Sochorová K, Pohanka M, Huser M. Nové metody zvyšující úspěšnost asistované reprodukce. Čes Gynek, 2012, 77, 2, s.139-142. 215 H. SEZNAMY 1. Seznam řešených grantů Hlavní řešitel: RNDr. Jana Žáková (1995-1996), grant MZ ČR č. 2703-2 Spoluřešitelé: Ventruba, P., Trávník, P., Sedláčková, M. Vztahy mezi buňkami cumulus oophorus a časným embryem při kultivaci in vitro. RNDr. Jana Žáková (1999–2001) grant MZ ČR č. 5164-3 Spoluřešitelé: Šťastná, J., Sedláčková, M., Ventruba, P., Crha, I., Vajcíková, H. Identifikace peroxisomů a jejich úloha v eliminaci poškození lidských zárodečných buněk kyslíkovými radikály při in vitro fertilizaci. Spoluřešitel: Hl. řešitel: doc. MUDr. Pavel Ventruba, DrSc. (1993-1994), grant MZ ČR č. 1770-2 Spoluřešitelé: Pilka, L., Čupr, Z., Trávník, P., Žáková, J., Unzeitig, V., Veselý, J. Asistovaná reprodukce II - Realizace nových metod v oblasti andrologické, imunologické, mikrobiologické, výpočetní techniky a kryokonzervace. Hl. řešitel: doc. MUDr. Pavel Ventruba, DrSc. (1994-1995), grant MZ ČR č. 1820-2 Spoluřešitelé: Adler, J., Trávník, P., Žáková, J., Sedláčková, M. Optimalizace in vitro fertilizace kokultivací embryí s lidskými tubárními epiteliemi. Hl. řešitel: doc. MUDr. Pavel Ventruba, DrSc. (1994-1995), grant MZ ČZ č. 1821-2 Spoluřešitelé: Trávník, P., Adler, J., Žáková, J. Asistovaná fertilizace - mikromanipulace v oblasti zona pellucida zvyšující úpěšnost oplození a transferu embrya. Hl. řešitel: doc. MUDr. Pavel Ventruba, DrSc. (1996-1998), grant MZ ČR č. 3804–3 Spoluřešitelé: Mardešic´, T., Petrenko, M., Crha, I., Žáková, J., Višňová, H. Prevence komplikací metod asistované reprodukce - využití analýzy dat z Národního registru. Navrženo na cenu ministra zdravotnictví Hl. řešitel: MUDr. Igor Crha, CSc. (1997-1999) grant MZ ČR č. 4078-3 Spoluřešitelé: Ventruba, P., Hrubá, D., Žáková, J., Paseka, J. Vliv xenobiotik na fertilizaci lidských gamet a výsledky IVF. Hl. řešitel: MUDr. Martin Huser (2004–2007) grant IGA MZ ČR NR/8469-3 Spoluřešitelé: Višňová H, Ventruba, P., Žáková, J., Hudeček R, Šmardová, L., Král Z. Možnosti ochrany reprodukčních funkcí u žen podstupujících chemoterapii pro hematologickou malignitu. Hl. řešitel: doc. MUDr. Igor Crha, CSc. (2008-2011) grant IGA MZ ČR: NS 9661-4/2008 Spoluřešitelé: Ventruba, P., Žáková, J, Huser, M., Kubešová, J., Králíková, J., Matejovičová, M., Pohanka, M. Vliv metabolismu homocysteinu na poruchy plodnosti. 216 2. Seznam zkratek aCGH – array Comparative Genome Hybridization AR – asistovaná reprodukce ARE – Asicoace reprodukční embryologie ART – asistované reprodukční techniky AH – asistovaný hatching CAR – centrum asistované reprodukce CCD – Contactless Conductivity Detection CEITEC – Central European Institute of Technology (Středoevropský technologický institut) DNA – deoxyribonukleová kyselina DMSO - dimethylsulfoxid ET – embryotransfer ESHRE – European Society of Human Reproduction and Embryology FISH – Fluorescent In Situ Hybridisation FN – Fakultní nemocnice FSH – folikuly stimulující hrmon GIFT – Gamete IntraFallopian Transfer GnRH – Gonadotropin releasing hormon GPK – gynekologicko – porodnická klinika hMG – human Menopausal Gonadotropin HSA – Human Serum Albumin ICM – Inner Cell Mass ICSI – IntraCytoplazmic Sperm Injection IMSI – IntraCytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection IUI – intrauterinní inseminace IVF – In Vitro Fertilizace LF MU – Lékařská fakulta Masarykovy univerzity LH – luteinizační hormon MS – Mass Spectrometry MESA – Micro Epididymal Sperm Aspiration NIR – Near Infrared Spectroscopy 217 PCR – Polymerase Chain Reaction PGD – peimplantační genetická diagnostika PGS – preimplantační genetický screening PICSI – Preselected IntraCytoplazmic Sperm Injection PR – Pregnancy Rate (% klinických těhotenství/embryotransfer) PZD – Partial Zona Dissection PROH – propandiol, propylenglykol ROS – Reactive Oxygen Species SAR – sekce asistované reprodukce SCD – Sperm Chromatin Dispersion SCSA – Sperm Chtomatin Structure Assay SPG – spermiogram SUZI – SubZonal Insemination TESE – Testicular Sperm Extraction TUNEL – Terminal transferase dUTP Nick End Labelling WHO – World Health Organisation ZD – Zona Drilling ZP – zona pellucida 218 3. Seznam obrázků Obr. 1: Osobní setkání autorky s nositelem Nobelovy ceny, prof. Robertem Edwardsem Obr. 2: CO2 inkubátor Binder pro kultivaci embryí Obr. 3: CO2 inkubátor Sanyo pro kultivaci embryí Obr. 4: Buňka cumulus oophorus preovulačního oocytu, světlé jádro (N), v cytoplazmě bohatá organelová výbava. Lipidové kapky (l), extracelulární matrix (ECM). Foto: Sedláčková, zvětšení: 6 400 x Obr. 5: Část buňky cumulus oophorus od oplozeného oocytu. Mitochondrie s tubulózními kristami (M). Foto: Sedláčková, zvětšení: 23 000 x Obr. 6: Spermie bez zjevných anomálií. Hlavička s intaktním akrozomem ( →), kondenzovaný jaderný chromatin (N), střední oddíl (SO). Foto: Sedláčková, zvětšení: 15 300 x Obr. 7: Monovrstva tubárních epitelií, zvětšení: 400x Obr. 8: Blastocysta a neoplozený oocyt na na monovrstvě tubárních epitelií, zvětšení: 250 x Obr. 9: Stádia embryí při klasické a prodloužené kultivaci Obr. 10: Mikroskop Leitz Fluovert FS s mechanickými mikromanipulátory Leitz Obr. 11: Mikromanipulační pipety vlastní výroby, provádění asistovaného hatchingu Obr. 12: Mikromanipulační zařízení (s mikroskopem Nikon Diaphot 300) Obr. 13: Mikromanipulační zařízení (s mikroskopem Nikon Eclipse Ti) Obr. 14: Detail mikropipet nad miskou pro mikromanipulace Obr. 15: ICSI, oocyt v metafázi II, spermie vpravo v injekční mikropipetě, zvětšení: 320 x Obr. 16: Testikulární tkáň po TESE Obr. 17: Rozvolnění semenotvorných kanálků Obr. 18: Krájení semenotvorných kanálků Obr. 19: Semenotvorné kanálky, zvětšení: 40x Obr. 20: Biopsie blastomery z 8 buněčného embrya, zvětšení: 400 x Obr. 21: Kryokonzervační zařízení Planer Kryo 10 Obr. 22: Nádoba s tekutým dusíkem pro vitrifikaci Obr. 23: Pejety pro vitrifikaci Obr. 24: Kryotuby se zamrazeným spermatem Obr. 25: Pomůcky pro provádění vitrifikace: misky s kryoprotektivními médii, pejety na embrya (straws) jsou umístěné v nádobách v tekutém dusíku 219 Obr. 26: Skladovací kontejnery s tekutým dusíkem Obr. 27: Odebraná ovariální tkáň Obr. 28: Zpracování ovariální tkáně před kryokonzervací Obr. 29: Komplex oocyt–cumulus oophorus, zvětšení: 40 x Obr. 30: Oocyt v metafázi II, zvětšení: 350 x Obr. 31: Maklerova komůrka k hodnocení spermiogramu Obr. 32: Miska pro PICSI Obr. 33: Spermie navázané na hyaluronan Obr. 34: Oplozený oocyt ve stádiu zygoty s prvojádry, v jádrech jsou patrna jadérka, zvětšení: 300 x Obr. 35: Monitorovací zařízení Primo Vision Systém Obr. 36: Kamera v CO2 inkubátoru 220 4. Seznam tabulek Tab. 1: Podíl cyklů, ve kterých byly oocyty oplozovány metodou ICSI z celkového počtu výkonů v letech 2003 – 2013 na GPK LF MU s FN Brno Tab. 2: Nárůst výkonů s AH a procento pregnancy rate (PR) v počátečním období na GPK LF MU a FN Brno Tab. 3: Podíl transferů, s provedeným asistovaným hatchingemv letech 2003 -2013 na GPK LF MU a FN Brno Tab. 4: Minimální požadavky na parametry spermatu dárce na CAR GPK LFMU a FN Brno Tab. 5: Počty mužů (onkologických pacientů) s kryokonzervovaným spermatem na GPK LF MU a FN Brno v letech 1995 – 2012 Tab. 6: Přehled onkologických diagnóz a počtu pacientů s kryokonzervovaným spermatem v letech 1995 – 2013 na GPK LF MU a FN Brno Tab. 7: Hodnoty základních parametrů při hodnocení spermiogramu dle WHO platné jako norma (4. a 5. edice manuálu) Tab. 8 : „Timing“ sledování fertilizovaného oocytu a optimálního embryálního vývoje dle Istanbulského consensu Tab. 9: Přehled celkového počtu monitoringů a počtu gravidit v jednotlivých letech na GPK LF MU a FN Brno Tab. 10: Přehled zavádění metod a technik na pracovišti CAR GPK LF MU a FN Brno 221 I. LITERATURA 1. Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology. The Istanbul konsensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Hum Reprod, 2011, 26, 6, p, 1270-1283 2. Amorim, C.A., Van Langendonckt, A., David, A. et al. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod, 2009, 24, p. 92-99. 3. Asch, R., Ellsworth , L., Balmaceda, J., Wong, P.C. Pregnancy after translaparoscopic gamete intrafallopian transfer. Lancet, 1984, 1, p.1034–1035. 4. Aitken, R.J., de Iuliis, GN., Mc Lachlan, R.I. Biological and clinical signifikance of DNA damage in the male germ line. Int J Androl, 2009, 32, p. 46-56. 5. Baart, E.B., Martini, E., van den Berg, M. et al. Preimplantation genetic screening revers a high incidence of aneuploidy and mosaicism in embryos from young women undergoing IVF. Hum Reprod, 2006, 21, p. 223-233. 6. Barroso, G., Valdespin, C., Vega, E. et al. Developmental sperm contributions: fertilization and beyond. Fertil Steril, 2009, 92, p. 835–848. 7. Bartoov, B., Berkovitz, A., Eltes, F. Selection of spermatozoa with normal nuclei to improve the pregnancy rate with intracytiplasmic sperm injection. N. Engl J Med, 2001, 345, p.1067-1068. 8. Van Blerkom, J., Henry, G. Cytogenetic analysis of living human oocytes: cellular basis and developmental consequence of perturbations in chromosomal organization and complement. Hum Reprod, 1988, 3, p.777 – 790. 9. Bongso, A., Sathananthan, Ng P.L., Rauff, M., Ratnam, S. Improved quality of human embryos when co-cultures with human ampullary cells. Hum Reprod, 1989, 4, p. 706-713. 10. Botros, L., Sakkas, D., Seli, E. Metabolomics and its application for non-invasive embryo assessment in IVF. Mol Hum Reprod, 2008, 14, 12, p. 679-90. 11. Brison D.R., Houghton F.D., Falconer, D. et al. Identification of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover. Hum Reprod, 2004, 19, p. 2319-2324. 12. Cohen, J., Wells, D., Munné, S. Removal of 2 cells from cleavage stage embryo sis likely to reduce the efficacy of chromozomal tests that are used to enhance implantation rates. Fertil Steril, 2007, 87, p. 496-503. 13. O´Connell, M.O., McClure, N., Lewis, S.E.M. The effects of cryopreservation on sperm morphology, motility and mitochondrial function. Hum Reprod, 2001, 17, 3, p. 704-709. 222 14. Crha, I., Ventruba, P., Mardesic, T., Žáková, J. Dárcovství gamet - biologické, legislativní a etické aspekty. Čes Gynek, 1997, 62, 2, s. 72-75. 15. Crha, I., Ventruba, P., Petrenko, M., Žáková, J., Višňová, H., Kučera, M., Geryk, E. Kryokonzervace spermatu před onkologickou léčbou – 7 let zkušeností. Čes Gynek, 2002, 67, 6, s. 324–328. 16. Crha, I., Ventruba, P., Huser, M. et al. Survival and infertility treatment in male cancer patients after sperm banking. Fertil Steril, 2009, 91, 6, p. 2344-2348. 17. Crha, I., Konečná, H., Žáková, J. et al. Proteom seminální plasmy u mužů s azoospermií. Prakt Gyn, 15, 2011, 2, s. 2-5. 18. Crha, I., Žáková, J. Současné možnosti výběru spermie v asistované reprodukci. Moderní gynekologie a porodnictví, 2012, 21, 1, s. 4-9. 19. Diedrich, K., van der Ven, H., Al-Hasani, S., Krebs, D. Ovarian stimulation for in-vitro fertilization. Hum Reprod, 1988, 3, p. 39-44. 20. Donnelly, E.T., McClure, N., Lewis, S.E.M. Cryopreservation of human semen and prepared sperm: effects on motility parameters and DNA integrity. Fertil Steril, 76, 5, 2001, p. 892-900. 21. Donnez, J., Dolmans, M.M., Demylle, D. et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet, 2004, 364, p. 1405-1410. 22. Dun, WB. Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes. Phys Biol, 2008, 5, p. 1–24. 23. Dvořák, M., Čupr, Z., Pilka, L. et al. Oplození in vitro a přenos embrya při léčbě lidské neplodnosti. Sborník prací LF v Brně, Acta Facultatis Medicinae Universitatis Brunensis, 1990, 106, 155 s. 24. ESHRE Guidelines and Legal. ART fact sheet. 2013, http://www.eshre.eu/Guidelines- and-Legal/ART-fact-sheet.aspx. 25. Feldschuh, J., Brassel, J., Durso, N., Levine, A. Successful sperm storage for 28 years. Fertil Steril 2005, 84, 4, 1017.e3-1017.e4. 26. Fleming, S.D., Ilad, R.S., Grifin, A.M. et al. Prospective controlled trial of an electroforetic method of sperm preparation for assisted reproduction: comparison with density gradient centrifugation. Hum Reprod, 2008, 23, p. 2646-2651. 27. Gandolfi, F., Moor, R.M. Stimulation of early embryonic development in the sheep by coculture with oviductal epithelial cells. J. Reprod Fertil, 1987, 81, p. 23-28. 223 28. Gardner D. K. et al. Environment of the preimplantation human embryo in vivo: metabolite analysis of oviduct and uterine fluids and metabolism of cumulus cells. Fertil Steril, 1996, 65, p. 349-353. 29. Gardner, D.K., Lane, M., Schoolcraft, W.B. Culture and transfer of viable blastocysts: a feasible proposition for human IVF. Hum Reprod, 2000, 16, 6, p. 9-23. 30. Gordon J.W., Talansky B.E. Assisted fertilization by zona dribling: A mouse model for correction of oligospermia. J. Exp. Zool., 1986, p. 239-347. 31. Hardarson T., Ahlström T., Rogberg L., et al. Non-invasive metabolomic profiling of Day 2 and 5 embryo culture medium: a prospective randomized trial. Hum Reprod, 2012, 27, p. 89–96. 32. Handyside, A.H., Kontogianni, E.H., Hardy, K., Winston, R.M. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature, 1990, 344, p. 768-770. 33. Harper, JC., Wilton, L., Traeger-Synodinos, J., et al. The ESHRE PGD Consortium: 10 years of data collection. Hum Reprod Update, 2012, 18, 3, 234-247. 34. Hlinka, D., Lazarovská, S., Rutarová, J., et al. Non-invasive monitoring of the timing of early embryo cleavages-objectively measurable predictor of human embryo viability. Česká Gynek, 2012, 77, 1, s. 52-7. 35. Huser, M., Juránková, E., Crha, I., Ventruba, P., Hudeček, R., Žáková, J., Šmardová, L., Král, Z. Kryokonzervace ovariální tkáně - šance na záchranu fertility žen s nádorovým onemocněním. Čes Gynek, 2007, 72, 1, s. 68-73. 36. Huser M, Žáková J, Crha I, Šmardová L, Král Z, Revel A, Ventruba P. Kryokonzervace ovariální tkáně u onkologických pacientek – 6 let klinických zkušeností. Čes Gynek, 2012, 77, 2, s. 118-126. 37. Huszar G, Ozenci CC, Cayli S et al.Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity, viability, and unreacted acrosomal status. Fertil Steril, 2003, 79, 3, s.1616 - 24. 38. Huszar. G., Jakab, A., Sakkas, D. et al. Fertility testing and ICSI sperm selection by hyaluronic acid binding: clinical and genetic aspscts. Reprod. Biomed. Online, 2007, 14, p. 650-663. 39. Chen, C. Pregnancy after human oocyte cryopreservation. Lancet, 1, 1986, p. 884-886. 40. Imoedemhe, D.G., Sigue, A.B. Survival of human oocytes cryopreserved with or without the cumulus in 1,2-propanediol. J Assist Reprod Genet, 9, 1992, s. 323-327. 224 41. Jakab A, Sakkas D, Delpiano E et al. Intracytoplasmic sperm injection: a novel selection method for sperm with normal frequency of chromosomal aneuploides. Fertil Steril, 2005, 84, 6, p. 1665 - 73. 42. Joris H, De Vos A, Janssens R et al. Comparison of the results of human embryo biopsy and outcome of PGD after zona drilling using acid Tyrode medium or a laser. Hum Reprod, 2003, 18, p. 1896–1902. 43. Katari, S., Turan, N, Bibikova, M, et al. DNA methylation and gene expression differences in children conceived in vitro or in vivo. Hum Mol Genet, 2009, 18, p. 3769-3778. 44. Katz-Jaffe, MG., Schoolcraft, WB., Gardner, DK. Analysis of protein expression (secretome) by human and mouse preimplantation embryos. Fertil Steril, 2006, 86, p. 678– 685. 45. Kokkali G, Traeger-Synodinos J, Vrettou C et al. Blastocyst biopsy versus cleavage stage biopsy and blastocyst transfer for preimplantation genetic diagnosis of beta-thalassaemia: a pilot study. Hum Reprod, 2007, 22, p. 1403–1409. 46. Krisher, R.L., Wheeler, M.B. Towards the use of microfluidics for individual embryo culture. Reprod Fertil Dev, 2010, 22, p. 32-39. 47. Laufer, N., Tarlatzis, B.C., De Cherney, A. Asynchrony between human cumulus-corona cell komplex and oocyte maturation after human menopausal gonadotropin treatment for in vitro fertilization. Fertil Steril, 1984, 42, p. 366-372. 48. Lanzendorf, S.E., Maloney, M.K., Veeck, L.L. et al. A preclinical evaluation of pronuclear formation by microinjection of human spermatozoa into human oocytes. Fertil Steril, 1988, 49, p. 835-842. 49. Laws-King, A., Trounson, A., Sathananthan, H., Kola, I. Fertilization of human oocytes by microinjection of a single spermatozoon under the zona pellucida. Fertil Steril, 1987, 48, p. 637. 50. Lemos EV, Zhang D, Van Voorhis BJ, Hu H. Healthcare expenses associated with multiple vs singleton pregnancies in the United States. Am J Obstet Gynecol, 2013, 209:586.e1-586.e11. 51. Lousová, E., Žáková, J., Beharka, R., Ventruba, P., Pacík, D., Pochopová, H. Retrográdní ejakulace – jedna z příčin mužské neplodnosti. Prakt Gyn, 2008, 12, 1, s. 36-37. 52. Lu Z., Zhang, X., Leung, C., et al. Robotic ICSI. IEEE Trans Biomed Eng, 2011, 58, p. 2102-2108. 53. Mádr, A., Foltová, K., Žáková, J., Lousová, E et al. Stanovení životaschopnosti embryí v asistované reprodukci pomocí kapilární elektroforézy. Sborník abstrakt jubilejní 10. česko-slovenské konference reprodukční gynekologie a 21. sympozia asistované reprodukce, 8.-9.11.2011, Brno, s. 35 225 54. Magli, C. New generation embryos. How the IVF lab can improve implantation. Focus on Reproduction, January 2014, p. 29-31. 55. Malter, H., Cohen, J. Blastocyst formation and hatching in vitro following zona dribling of mouse and human embryos. Gamete Res., 1989, 24, p. 67-80. 56. Mastenbroek, S., Twisk, M., van der Veen, F., Repping, S. Preimplantation genetic screening: asystematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update, Vol.17, No.4 p. 454–466, 2011 57. Meirow, D., Levron, J., Eldar-Geva, T. et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. N Engl J Med, 2005, 353, p. 318-321. 58. Menezo, Y., Hazout, A., Dumont, M., Herbaut, N., Niccolet, B.: Coculture of embryos on Vero cells and transfer of blastocysts in humus. Hum Reprod, 1992, 7, p. 101-106. 59. Meseguer, M., Herrero, J., Tejera, A. et al. The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum Reprod, 2011, 26, p. 2658-2671. 60. Meseguer, M., Rubio, I., Cruz, M. et al. Embryo Incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 2012, 98, p.1481-1489.e10 61. Mettler, L., Seki, M., Baukloh, V., Samm, K. Human ovum recovery via operative laparoskopy and in vitro fertilization. Fertil Steril, 1982, 38, p. 30-37. 62. Van Montfoort, A.P.A., Hanssen, L., de Sutter, P. et al. Assisted reproduction treatment and epigenetic inheritance. Hum Reprod Update, 2012, doi:10.1093/humus/dmr04 63. Munné, S., Fragouli, E., Colls, P. et al. Improved detection of aneuploid blastocysts using a new 12-chromosome FISH test. Reprod Biomed Online, 2010, 20, p. 92-97. 64. Nelissen, E., Van Montfoort, A.P.A., Menheere, P. et al. Effect of IVF culture medium on human fetal growth. O-169, Hum Reprod, 2011, 26 (suppl), i67-i69. 65. Nixon, B., Aitken, R.J. Proteomics of human spermatozoa. In: Krause, W.K., Naz, R.K. (eds). Immune infertility: The impact of immune reactions on human infertility. Heidelberg, Springer-Verlag, 2009. 66. Opekar, F., Štulík, K. Elektrochemická detekce s elektrodami mimo roztok – znovuzrození kontaktních impedančních metod. Chem Listy, 2010, 104, s. 1148-1154. 67. Ouhibi, N., Menezo, Y., Benet, G., Nicollet, B. Culture of epithelial cells derived from the ovidukt of different species. Hum Reprod, 1989, 4, p. 229-235. 226 68. Pacík, D., Turjanica, M., Žáková, J. První zkušenosti s technikami MESA a TESE při léčbě infertilních mužů s azoospermií. Rozhl Chir, 1997, 76, 9, s. 463-467. 69. Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Ven Steirteghem, A.C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet, 1992, 340, p. 17-18. 70. Parmegiani, L., Garello, C., Granella, F. et al. Long-term cryostorage does not adversely affect the outcome of oocyte thawing cycles. Reprod Biomed Online, 2009, 19, 3, p. 374- 379. 71. Pilka, L., Tesařík, J., Dvořák, M. et al. Narození dítěte po přenosu krátkodobě kultivovaného oocytu do vejcovodu. Čs Gynek, 1983, 48, s. 324-326. 72. Pilka, L., Trávník, P., Dvořák, M. et al. Porod po nitroděložním přenosu embryí získaných fertilizací a kultivací oocytů in vitro. Čs Gynek, 50, 1985, s. 452 – 459. 73. Plachot, M., Antoine, J.M., Alvarez, S., Firmin, C. et al. Granulosa cells improve human embryo development in vitro. Hum Reprod., 1993, 8, p. 2133-2140. 74. Porcu, E., Fabbri, R., Seracchioli, R. Birth of a healthy fiale after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes. Fertil Steril, 1997, p. 724-726. 75. Pribenszky, C., Matyas, S., Kovacs, P. et al. Pregnancy achieved by transfer of a single blastocyst selected by time –lapse monitoring. Reprod Biomed Online, 2010, 21, p. 533- 536. 76. Revel, A. Safran, A., Laufer, N. et al. Twin delivery following 12 years of human embryo cryopreservation: Case report. Hum Reprod 2004, 19, 2, p. 328-329. 77. Rienzi, L., Martinez, F., Ubaldi, F et al. Polscope analysis of meiotic spindle ganges in living metaphase II human oocytes during the freezing and thawing procedures. Hum Reprod, 2004, 19, p. 655-659. 78. Rubio, I., Kuhlmann, R., Agerholm, I., et al. Limited implantation Access of direktcleaved human zygotes: a time-lapse study. Fertil Steril, 2012, Fert Steril, 98, 6, p 1458- 1463. 79. Řežábek, K. In vitro fertilizace – rozbor údajů Národního registru asistované reprodukce za roky 2007 -2011, Čes Gynek, 2012, 77, 4, s. 336 – 341. 80. Said, T.M., Agarwal, A., Zborowski, M. et al. Utility of magnetic cell separation as o molecular sperm preparation technique. J. Androl., 2008, 29, p.134-142. 81. Sakkas, D., Trounson, A.O. Co-culture of mouse embryos with oviductal and uterine cells prepared from mice at different days of pseudopregnancy. J Reprod Fertil, 1990, 90, p. 109-118. 227 82. Scott, L., Berntsen, J., Davies, D., et al. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assesment. Human oocyte respiration-rate measurement – potential to improve oocyte and embryo selection? Reprod Biomed Online, 2008, 17, p. 461-469. 83. Sedláčková M., Šťastná J., Žáková J. Cytochemická detekce zdrojů peroxidu vodíku v kultivačním systému v průběhu fertilizace in vitro u člověka. Scripta Medica, 2001, 74, s. 415. 84. Sedláčková M., Šťastná J., Žáková J., Ventruba P. Failure of the in vitro fertilisation and production of hydrogen peroxide. Plzeň lék sborn, 2003, 78, Suppl., s. 49-52. 85. Seli, E., Botros, L., Sakkas, D., Burns, DH. Non-invasive metabolomic profiling of embryo culture media using proton NMR correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril, 2008, 90, p. 2183–2189. 86. Schoysman, R., Vanderzwalmen, P., Nijs, N.: Pregnancy after fertilization with human testicular spermatozoa. Lancet, 342, 1993, p. 1237. 87. Silber, S.J. Ovary cryopreservation and transplantation for fertility preservation. Mol Hum Reprod, 2012, 18, p. 59-67. 88. Simon. L., Lutton, D., McManus, J., Lewis, SE. Sperm DNA damage measured by tje alkaline Comet assay as an independent predictor of male infertility and IVF success. Fertil Steril 2010, 95, s. 652–657. 89. Smith, G.D. Microfluidics in human IVF laboratories, Hum Reprod, 2011, Abstracts of the 27th Annual Meeting of ESHRE, Stockholm, Sweden, 3 July – 6 July, i60. 90. Steptoe, P.C., Edwards, R.G. Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet, 1978, p. 366. 91. Šťastná, J., Sedláčková, M. Ultracytochemical demonstration of peroxidative activity of catalase in the cumulus cells of mouse cumulus-oocyte complexes. Scripta Medica, 1999, 72, s. 233 - 236. 92. Šťastná J., Sedláčková M., Žáková J. Differences in the occurrence of peroxisomes in human and mouse oocytes and their cumuli oophori. Scripta Medica, 2002, 75, s. 337. 93. Temple-Smith, P.D., Southwick, G.J., Yates, C.A. et al. Human pregnancy by IVF using sperm aspirated from the epipdidymis. J In Vitro Fertil Embryo Transf, 1985, 2, p. 119- 122. 94. Trávník, P., Čech, S., Leonov. B.V. et al. Výsledky a perspektivy oplození lidského vejce, jeho kultivace a transferu při léčbě tubární neplodnosti. Scripta Medica, 1982, 55, s. 243- 244. 228 95. Trávník, P., Šťastná, J., Pilka, L., Soška, J. Možnosti testování kultivačních prostředí při IVF a ET. In: Nové směry v léčbě sterility, Sborník prací celost. Věd. konf., Brno, 1985, s. 68-69. 96. Trávník, P. Příprava vody pro kultivaci embryí, buněk a tkání. Autorské osvědčení ČSSR č. 257.098, Praha 1987. 97. Trávník, P., Tesařík, J., Šťastná, J. Medium pro oplození lidských vajíček a jejich kultivaci. Autorské osvědčení ČSSR č. 257.097, Praha, 1987. 98. Trávník, P., Hampl, A., Huttelová, R., Malenovská, A., Priesnitz, J., Rejthar, D., Žáková, J. Teoretická a praktická náplň oboru klinická embryologie. Čes Gynek, 2013, 78, 4, s. 400–401 99. Trávník P., Hüttelová R., Jelínková L. et al. Směrnice ke správné laboratorní praxi při asistované reprodukci - čistota prostředí. Čes Gyn, 2014, v tisku. 100. Trounson A, Mohr L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature, 1983, 305, p. 707-709. 101. Tucker, M. J. Human oocyte and embryo cryopreservation. The Art and Science of Assisted Reproductive Techniques, Taylor Francis, London and New York, A Parthenon Book, 2004. 102. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Assisted Reproduction Technology Success Rates (2010), National Summary and Fertility Clinic Reports, December 2012 at http://www.cdc.gov/art/ART2010 103. Ventruba, P., Pilka, L., Čupr, Z., Trávník, P., Malenovská, A., Žáková, J Oozytenentnahme in Verbindung mit Beckenmikrochirurgie. Zent bl Gynakol, 1991, 113, S. 557-561. 104. Ventruba, P., Čupr, Z., Pilka, L., Veselý, J., Rejdová, I., Žáková, J. Transvaginální odběr oocytu pod kontrolou vaginální sonografie: 1987 - 1990. Gynekolog, 1992, 1, s. 5-7. 105. Ventruba, P., Žáková, J., Adler, J., Trávník, P., Komárková, J., Němcová, S.: Prolonged cultivation of human embryos: coculture on human tubal epithelia versus a synthetic medium. Proceedings of the IXth World Congress on IVF and Assisted Reproduction, Monduzzi Editore, Bologna, Italy, 1995, p. 429-433. 106. Ventruba, P., Žáková, J., Trávník, P., Adler, J. Závěrečná zpráva grantu IGA MZ ČR č. 1821-2: Asistovaná fertilizace-mikromanipulace v oblasti zona pellucida zvyšující úspěšnost oplození a transferu embrya. Brno, 1996, 94 s. 107. Ventruba, P., Žáková, J., Adler, J. et al. Mikromanipulace v oblasti zona pellucida embrya: asistovaný hatching 1994 – 1995. Gynekolog, 1996, 5, s. 37–41. 229 108. Ventruba, P., Žáková, J., Trávník, P., Adler, J. Závěrečná zpráva grantu IGA MZ ČR č. 1820-2: Optimalizace in vitro fertilizace kokultivací embryí s lidskými tubárními epiteliemi. Brno, 1996, 122 s. 109. Ventruba, P., Žáková, J., Adler, J., Trávník, P., Komárková, J., Němcová, S. Prodloužená kultivace lidských embryí: srovnání kokultivace na lidských tubárních epiteliích a kultivace v syntetickém médiu. Čes Gynek, 1996, 61, s. 27–33. 110. Ventruba, P., Žáková, J., Crha, I., Němcová, S. Intracytoplasmatická injekce spermie do oocytu a asistovaný hatching - mikromanipulační techniky zvyšující úspěšnost programu fertilizace in vitro. Prakt Gyn, 1997, 1, s. 14-25. 111. Vergouw, CG., Botros, LL., Roos, P., et al. Metabolomic profiling by near-infrared spectroscopy as a tool to assess embryo viability: a novel, non-invasive method for embryo selection. Hum Reprod, 2008, 23, p. 1499–1504. 112. Vergouw CG., Kieslinger DC., Kostelijk H., et al. Day 3 embryo selection by metabolomic profiling of culture medium with near-infrared spectroscopy as an adjunct to morphology: a randomized controlled trial. Hum Reprod, 2012, p. 1-8. 113. Vom, E., Roy, T.K., Brandi, S., Tappe, M.M. et al. Development of novel automated vitrification instrument; confirmation of ability to control critical parameters in a microfluidics consumable and software controlled instrument as part of vitrification. Hum Reprod, 2013, 28 (suppl 1): i112-i115 doi:10.1093/humrep/det204. 114. Vutyavanich T, Piromlertamorn W, Nunta S. Rapid freezing versus slow programmable freezing of human spermatozoa. Fertil Steril, 2010, 93, 6:1921-8. Epub 2009 Feb 24. 115. Wetzels, A.M.M., Punt, A.P.E.M., Van der Zalm, Bastiaans, B.A. et al.: The effect of human skin fibroblast monolayers on human sperm motility and mouse zygote development. Hum Reprod, 1992, 7, p. 852-856. 116. Whittingham DG, Leibo SP, Mazur P. Survival of mouse embryos frozen to – 196°C and – 289° C. Science, 1972, 178, p. 411- 414. 117. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen - 5th ed. World Health Organisation, Cambridge University Press, 2010, ISBN 9789241547789. 118. Zeilmaker GH, Alberda A, Van Gent I. Two pregnancies following transfer of intact frozen-thawed embryos. Fertil Steril,1984, 42, p. 293-296. 119. Žáková, J., Ventruba, P., Adler, J., Trávník, P. Kokultivace embryí s buňkami lidského vejcovodu v programu asistované reprodukce na I. gynek. porod. klinice v Brně. Gynekolog, 1995, 4, s. 124-127. 120. Žáková, J., Ventruba, P., Němcová, S. Assisted hatching - results in women with repeated embryotransfer failure. Proceedings of the IXth World Congress on IVF and Assisted Reproduction, Monduzzi Editore, Bologna, Italy, 1995, p. 539-541. 230 121. Žáková J., Sedláčková M., Trávník P., Ventruba P. Morfologie buněk cumulus oophorus z komplexu oocyt-cumulus po oplození lidských oocytů in vitro. Gynekolog, 1996, 5, s. 209-212. 122. Žáková, J., Ventruba, P., Adler, J., Trávník, P., Němcová, S. Asistovaný hatching přínosná mikromanipulační technika pro ženy s opakovaně neúspěšným embryotransferem. Čes Gynek, 1996, 61, s. 6–9. 123. Žáková, J., Ventruba, P., Trávník, P., Sedláčková, M. Závěrečná zpráva grantu IGA MZ ČR č. 2703-2 Vztahy mezi buňkami cumulus oophorus a časným embryem při kultivaci in vitro. Brno, 1997, 71 s. 124. Žáková, J., Sedláčková, M., Ventruba, P., Trávník, P. Vliv ultrastruktury spermií na výsledek fertilizace in vitro. Čes Gynek, 1997, 62, s. 3-6. 125. Žáková, J., Ventruba, P., Petrenko, M., Višňová, H., Pelíšková, L. Factors influencing effectiveness of cryopreserved /thawed embryo transfer. Scripta Medica, 1998, 71, 1, p. 49-56. 126. Žáková, J. Vztahy mezi buňkami cumulus oophorus a lidským oocytem v průběhu fertilizace in vitro. Disertační práce k získání vědecké hodnosti Ph.D., Brno, 2000. 69 s. 127. Žáková, J., Šťastná, J., Ventruba, P., et al. Závěrečná zpráva grantu IGA MZ ČR č. 5164- 3: Identifikace peroxisomů a jejich úloha v eliminaci poškození lidských zárodečných buněk kyslíkovými radikály při in vitro fertilizaci. Brno 2002, 48 s. 128. Žáková, J., Ventruba, P., Crha, I., Lousová, E. Sperm Donation Programme at the Centre of Assisted Reproduction in Brno: 1995 – 2005 results. Scripta Medica Brno, 2005, p. 323-328. 129. Žáková, J., Ventruba, P., Crha, I., Bulínová, E., Lousová, E. Možnost využití darovaných gamet nebo embryí při léčbě neplodnosti. Prakt Gyn, 2006, 3, s.105–107. 130. Žáková, J., Lousová, E., Crha, I., Ventruba, P., Pohanka, M., Nentwichová, P., Pochopová, H. PICSI – selekce zralých spermií pro oplození lidských oocytů metodou ICSI. Prakt Gyn, 2010, 14, 4, s. 180-182. 131. Žáková, J., Ventruba, P., Lousová, E., Crha, I., Hudeček, R. Kryokonzervace buněk a tkání v asistované reprodukci. Prakt Gyn, 2011, 15, 1, s. 16–21. 132. Žáková J, Ventruba P, Crha I, Lousová E, Sochorová K, Pohanka M, Huser M. Nové metody zvyšující úspěšnost asistované reprodukce. Čes Gynek, 2012, 77, 2, s. 139-142. 133. Zakova, J., Sedlackova, M., Polak, S., Dumkova, J., Ventruba, P., Crha, I. Methods for preserving fertility in young women suffering from cancer: some aspects ofovarian tissue cryopreservation. Bratisl Med J, 2012, 113, 3, p.192-194. 231 134. Žáková, J., Trávník, P., Malenovská, A., Hüttelová, R. Činnosti a odpovědnosti pracovníků embryologické a andrologické laboratoře v centrech asistované reprodukce, Čes Gynek., 2013, 78, 5, s. 481-484. 135. Žáková, J., Lousová, E., Ventruba, P., Crha, I., Pochopová, H., Vinklárková, J., Tesařová, E., Nussir, M. Sperm cryopreservation before testicular cancer treatment and its subsequent utilization for the treatment of infertility. The Scientific World Journal, 2014, article ID 575978, 5 pages, http://dx.doi.org/10.1155/2014/575978. 232 J. SOUHRN Habilitační práce na téma „Vývoj a podíl klinické embryologie v programu asistované reprodukce“ je zpracována formou komentovaného souboru 23 publikovaných prací autorky. Cílem práce je podat přehled o nejvýznamnějších metodách a technikách klinické embryologie, jejichž zavádění, rozvoj a praktické využití autorka sama v embryologické laboratoři prováděla. Práce vychází z publikací a z výsledků desítky grantových úkolů, řešených na jednotlivá témata na pracovišti asistované reprodukce Gynekologicko – porodnické kliniky LF MU a FN Brno. Úvodní kapitola přináší základní informace o úloze klinické embryologie v asistované reprodukci a o rozvoji laboratorních metod a technik od 90. let 20. století. Na počátku každé kapitoly je uveden stručný přehled o daném tématu a poté vlastní příspěvek autorky k dané problematice. V kapitole 1. „Kultivace gamet a embryí“ jsou komentovány 4 práce. Jsou uvedeny způsoby hodnocení kultivačních podmínek na základě studia ultrastruktury kumulárních buněk a spermií. Dále je popsán vývoj metod prodloužení délky kultivace embryí in vitro za hranici 48 hodin. Od roku 1993 jsme prodloužili kultivaci až na 120 hodin a dosáhli poprvé stádia blastocysty společnou kultivací embryí, tzv. kokultivací, s lidskými oviduktálními buňkami. Prodloužená kultivace v syntetických médiích se stala naší každodenní praxí a je prováděna v 98,5 % výkonů IVF. V kapitole 2. „Mikromanipulační techniky“ je komentováno 5 publikací, které podávají přehled o zavádění mikromanipulačních technik a jejich současném využití v asistované reprodukci. Od roku 1994 provádíme techniku, která napomáhá uvolnění embrya ze zona pellucida a tím jeho implantaci, tzv. asistovaný hatching. Metoda intracytoplazmatické injekce spermie do oocytu (ICSI) se stala na našem pracovišti od roku 1996 nejpřínosnější a nejpoužívanější mikromanipulační technikou pro oplozování oocytů. V současné době provádíme ICSI ve více než 90 % výkonů AR ročně. S použitím této techniky souvisí popsané metody pro získání spermií z epididymální (MESA) a testikulární tkáně (TESE) a při retrográdní ejakulaci. 233 V kapitole 3. „Kryokonzervace gamet, embryí a zárodečných tkání“ je komentováno celkem 11 prací. Zabývají se zaváděním a využitím kryokonzervace spermií, oocytů a embryí při léčbě neplodnosti. Kryokonzervaci spermií provádíme od roku 1991 a mrazení embryí jsme zavedli v roce 1995. Dobře fungující kryokonzervace je základním předpokladem pro program dárcovství gamet a embryí. V rámci center asistované reprodukce máme první a největší spermabanku v ČR. Vybudovali jsme také Centrum pro ochranu fertility pro onkologicky nemocné muže a ženy. Mrazení spermatu nebo ovariální tkáně před gonadotoxickou léčbou jsme začali provádět jako první centrum v ČR a máme s ním největší zkušenost. V kapitole 4. „Hodnocení kvality gamet a embryí“ jsou komentovány 3 publikace. Jsou uvedeny způsoby hodnocení kvality oocytů, spermií a embryí. Možnost hodnocení zralosti, jako dalšího parametru kvality spermií je podstata metody PICSI (Preselected sperm for IntraCytoplazmic Sperm Injection). Pro oplozování jsou zralé spermie předem vybrány. Metodu jsme zavedli v roce 2010 a pacienti ji volí v 71,5 % případů mikromanipulačního oplozování oocytů. Výběr embryí na základě neinvazivního kontinuálního monitoringu embryonálního vývoje pomocí Primo Vision Systému jsme zavedli do praxe v roce 2011. Kontinuálním snímáním vývoje embryí dostáváme přesné informace o pravidelnosti dělení buněk a dynamice vývoje v čase. Centrum asistované reprodukce GPK LF MU a FN Brno a jeho embryologická laboratoř bylo 1. pracovištěm asistované reprodukce v České republice. Autorka je vedoucí embryologické a andrologické laboratoře tohoto pracoviště, které patří po celou dobu k předním centrům asistované reprodukce v ČR a ve světě. Pracoviště poskytuje klientům celou šíři metod a jeho výhodou je, že jde o univerzitní centrum s kompletním klinickým zázemím, možností mezioborové spolupráce a zkušeným týmem odborníků. 234 K. SUMMARY The habilitation thesis on the topic "Development and the Role of Clinical Embryology in the Assisted Reproduction Program" is based on the set of author´s 23 commented papers supplemented with further commentaries. The aim of this work is to provide an overview of the most important methods and techniques of clinical embryology, where the author was personally engage with implementation, development and practical use in the embryological laboratory. This work is based on the author´s publications and the results of grant research on individual topics, in the Assisted Reproduction Center of the Obstetrics and Gynaecology Clinic of Masaryk University´s Medical Faculty and Faculty Hospital Brno. The introductory chapter provides basic information about the role of clinical embryology in assisted reproduction and the development of laboratory methods and techniques since the 1990s. The beginning of each chapter features a brief topical overview and is followed by author own contribution to the subject. In chapter 1. "The Cultivation of Gametes and Embryos" 4 publications are commented. This chapter describes the ways of the cultivation conditions evaluation on the basis of the cumullar cells and sperm ultrastructure study. Development of methods to extend length of the in vitro embryo cultivation beyond 48 hours is also described. Since 1993, we have extended this cultivation up to 120 hours, and for the first time, we have achieved for the first time the blastocyst stage embryo, due to the co-culture with human oviductal cells. Extended cultivation in the synthetic media has become our daily practice and is performed in 98.5 % of IVF procedures. In chapter 2. "Micromanipulation Techniques" 5 publications are discussed which provide overviews of the implementation of micromanipulation techniques and their current use in assisted reproduction. Since 1994 we have provided a technique that helps an embryo leave the zona pellucida and its implantation - assisted hatching. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) into the oocyte has become the most beneficial and the most widely used technique for oocyte fertilization since 1996. Currently, ICSI is carried out in more than 90 % of the cycles 235 each year. This technique is related to established methods for obtaining sperm from epididymal (MESA) and testicular tissue (TESE) and retrograde ejaculation. In chapter 3. "Cryopreservation of Gametes, Embryos and Embryonal Tissues" 11 papers are discussed dealing with the introduction and application of cryopreservation of sperm, oocytes and embryos in the treatment of infertility. We have cryopreseerved sperm since 1991 and we introduced embryo freezing in 1995. Well-functioning cryopreservation is an essential prerequisite for a donation of gametes and embryos program. Within the center of assisted reproduction, we have the first and the largest spermbank in the Czech Republic. We have also built a centre for fertility preservation of both male and female oncologic patients. As a first center in the Czech Republic, we have started to perform ovarian tissue and sperm freezing before gonadotoxic treatment and we have become quite experienced with this procedure. Three publications are commented in chapter 4. entitled "Evaluation of the Quality of Gametes and Embryos", where we describing the procedures for quality evaluation of oocytes, sperm and embryos. The possibility of sperm maturity evaluation, as a successive quality parameter, is the base of the PICSI method (Preselected sperm for IntraCytoplazmic Sperm Injection). Only pre-selected mature sperm are used for fertilization. We instituted this procedure in 2010, and patients choose this method in 71.5 % of oocyte insemination cases. In 2011, we began selecting embryos on the basis of non-invasive continuous monitoring of embryo development using the Primo Vision System. By continuously recording embryo development, we have received accurate information about the regularity of cell division and the dynamics of embryonic development. This Center of Assisted Reproduction and its embryologic laboratory was the first workplace of assisted reproduction in the Czech Republic. The author of this thesis is a head of the center´s Embryological and andrological laboratory, which is rated as one of the leading centers for assisted reproduction in the Czech Republic and world. This workplace offers clients an entire range of methods and as a part of a University Complex, the center features complete clinical facilities, interdisciplinary collaboration, and an experienced team of experts.