Lékařská fakulta Masarykovy university Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie Molekulární diagnostika vybraných dědičných nemocí Habilitační práce RNDr. Lenka Fajkusová, CSc. Brno 2014 2 Poděkování Velké díky patří všem současným i bývalým kolegům z Centra molekulární biologie a genové terapie, kteří se podíleli na diagnostice dědičných nemocí a přispěli tak k publikovaným výsledkům, úspěšnému řešení řady grantových projektů a hlavně k potvrzení diagnózy u tisícovek pacientů s nejrůznějšími typy dědičných monogenních nemocí. Dále děkuji vedení Centra molekulární biologie a genové terapie IHOK prof. Šárce Pospíšilové a prof. Jiřímu Mayerovi za možnost pracovat na problematice dědičných nemocí a volnost při výběru výzkumných i diagnostických témat. 3 Obsah 1 Abstrakt...............................................................................................................................4 2 Dědičné neuromuskulární nemoci.......................................................................................5 2.1 Facioskapulohumerální svalová dystrofie ...................................................................6 2.2 Duchennova svalová dystrofie, pletencové svalové dystrofie...................................10 3 Dědičné kožní nemoci.......................................................................................................71 3.1 Epidermolysis bullosa................................................................................................72 3.2 Ichtyózy .....................................................................................................................75 4 Dědičné metabolické nemoci ............................................................................................94 5 Závěr................................................................................................................................143 6 Použitá literatura .............................................................................................................144 4 1 Abstrakt Habilitační práce nazvaná “Molekulární diagnostika vybraných dědičných nemocí” je rozdělena do tří tématických oddílů. První část je zaměřena na molekulární podstatu a genetickou diagnostiku dědičných neuromuskulární nemocí, konkrétně na facioskapulohumerální svalovou dystrofii (FSHD), Duchennovu svalovou dystrofii a pletencovou svalovou dystrofii. Je zde popsán vývoj poznatků týkajících se molekulární podstaty FSHD, tj. asociace delece makrosatelitní repetice v subtelomerní oblasti a klinického projevu FSHD. V rámci této části je prezentováno 7 prací zaměřených na Duchennovu svalovou dystrofii, pletencovou svalovou dystrofii, kongenitální myotonii a spinální svalovou atrofii. Druhá část habilitační práce je věnována dědičných kožním nemocem a to epidermolysis bullosa a ichtyózám. Jsou prezentovány dvě práce, první s tématikou epidermolysis bullosa dystrophica, druhá s tématikou epidermolysis bullosa simplex. Vzhledem k tomu, že problematice dědičných ichtyóz se pracoviště Centra molekulární biologie a genové terapie (CMBGT) věnuje teprve od roku 2013, publikace vztahující k tomuto onemocnění jsou v současné době připravovány. Kromě vlastní molekulárně genetické diagnostiky jsou zde stejně jako v předchozí části shrnuty i dosavadní poznatky v oblasti molekulární patologie jmenovaných chorob. Třetí část habilitační práce je zaměřena na molekulární problematiku metabolických nemocí. V této části je po krátkém úvodu prezentováno 6 prací vztahujících se k problematice molekulárně genetické diagnostiky familiální hypercholesterolémie, hyperfenylalaninémie a kongenitální adrenální hyperplazie. U všech prezentovaných prací je Lenka Fajkusová korespondující autor. 5 2 Dědičné neuromuskulární nemoci Neuromuskulární nemoci jsou velmi rozsáhlou a různorodou skupinou chorob, která je spojena s narušením funkce svalů. V CMBGT se zbýváme molekulárně genetickou diagnostikou neuromuskulárních nemocí od roku 2002 a v současné době standardně nabízíme diagnostiku Duchennovy/Beckerovy svalové dystrofie (analýza genu DMD), facioskapulohumerální svalové dystrofie (stanovení delece makrosatelitní repetice D4Z4 v oblasti 4q35), pletencové svalové dystrofie (analýza genů CAPN3, FKRP, SGCA a ANO5), myotonické dystrofie 1 (stanovení expanze mikrosatelitní repetice v genu DMPK), myotonické dystrofie 2 (stanovení expanze mikrosatelitní repetice v genu ZNF9), nondystrofické myotonie (analýza mutací v genech CLCN1 a SCN4A) a spinální svalové atrofie (analýza genu SMN1). Molekulární diagnostika zahrnuje v závislosti na typu hledané mutace různé metodické přístupy, jedním z nich je polymerázová řetězová reakce (PCR) ve spojení se sekvenční analýzou, tedy metoda, která umožňuje identifikaci mutací malého rozsahu. Tento metodický přístup je hojně využíván v diagnostice; dále se uplatňují různé modifikace PCR, např. repeat-primed PCR (pro detekci expanzí krátkých repetitivních sekvencí) nebo multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA, pro detekci rozsáhlých delecí/duplikací); pro diagnostiku nemocí spojenou se změnou počtu repetitivních sekvencí se užívá i Southern blot a hybridizace s radioaktivně značenou sondou. U řady nemocí se genetické diagnostické přístupy mění v čase, příkladem může být Duchennova svalová dystrofie. Původně jsme vzhledem k velikosti genu DMD (79 exonů) analyzovali mRNA pomocí reverzní transkripce, PCR a PTT (protein truncation test), pak jsme přešli na analýzu DNA pomocí MLPA a klasické PCR-sekvenace, v současné době využíváme amplikonové sekvenování nové generace (DMD MASTR assay, Multiplicom). Klinické manifestace neuromuskulárních nemocí se často mohou překrývat bez ohledu na genetickou příčinu nemoci a určit vhodný gen pro molekulárně genetickou diagnostiku na základě klinického obrazu pacienta (často i ve spojení s výsledkem patologické analýzy svalové tkáně) může být problematické. Z tohoto důvodu jsme zavedli nový diagnostický přístup, který umožní rychlou a relativně ekonomickou analýzu genů asociovaných s neuromuskulárními nemocemi: sequence capture and targeted resequencing (SeqCapTR). SeqCap je proces, který zachytí a obohatí vybrané oblasti genomové DNA v jednom 6 kroku (místo nutnosti stovek až tisíců jednotlivých PCR) a ve spojení s technikami sekvenování nové generace umožní identifikaci kauzální mutace/mutací. Námi zavedený metodický přístup využívající SeqCap EZ Choice Library (Roche NimbleGene) a sekvenování na přístroji GS Junior System (Roche) nebo MiSeq (Illumina) umožňuje analýzu exonů a přilehlých intronových sekvencí 42 genů (1020 exonů, 280 kb) asociovaných se svalovými dystrofiemi, kongenitálními svalovými dystrofiemi, kongenitálními myopatiemi, distálními myopatiemi a dalšími myopatiemi (dle http://www.musclegenetable.org/). Seznam vybraných nemocí a genů zahrnuje Duchennovu svalovou dystrofii (DMD), Emery-Dreifussovu svalovou dystrofii (EMD, FHL1, LMNA), pletencové svalové dystrofie (MYOT, LMNA, CAV3, CAPN3, DYSF, SGCG, SGCA, SGCB, SGCD, TCAP, TRIM32, FKRP, TTN, POMT1, ANO5, FKTN, POMT2, POMGNT1); geny spojené s kongenitálními svalovými dystrofiemi (LAMA2, LARGE, SEPN1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, ITGA7, DNM2); kongenitálními myopatiemi, distálními myopatiemi a dalšími myopatiemi (NEB, TPM3, ACTA1, TPM2, TNNT1, CFL2, RYR, MTM1, BIN, CRYAB, DES, LAMP2, PABPN1). Uvedený metodický přístup byl již aplikován u 70 pacientů a u poloviny z nich jsme identifikovali kauzální mutace spojené s onemocněním. U části vzorků jsme detekovali mutace, ale ještě ověřujeme jejich kauzalitu analýzou DNA rodinných příslušníků, vyhodnocením vlivu mutace na strukturu proteinu pomocí in silico metod a zastoupením zjištěné genetické varianty v populaci. V oblasti diagnostiky neuromuskulárních nemocí spolupracujeme nejen s klinikami v rámci Fakultní nemocnice Brno (Klinika dětské neurologie, Neurologická klinika, Oddělení lékařské genetiky, Patologicko-anatomický ústav), ale intenzivní spolupráce je i s Fakultní nemocnicí Motol, Všeobecnou fakultní nemocnicí Praha, Fakultní nemocnicí Ostrava, Fakultní nemocnicí Olomouc a Thomayerovou nemocnicí. 2.1 Facioskapulohumerální svalová dystrofie V řadě případů výzkumu dědičných nemocí můžeme sledovat zajímavý vývoj poznatků a jejich interpretací, které se dramaticky mění v čase. Tím nám poskytují nejen možnost nahlížet na problematiku daného onemocnění z řady různých hledisek, ale současně upozorňují na relativitu současného chápání molekulární podstaty dané choroby. Velmi 7 dobrým příkladem v tomto směru je vývoj poznání molekulárních příčin facioskapulohumerální svalové dystrofie (FSHD). FSHD je autozomálně dominantní onemocnění a je třetí nejběžnější dědičnou svalovou dystrofií [1]. Prvním poznatkem směřujícím k objasnění molekulární podstaty FSHD byla vazba na kontrakci (snížení počtu) subtelomerických tandemových repetic D4Z4 na chromosomu 4q35 pod prahovou úroveň 11 kopií [2]. Na tomto zjištění bylo možno založit diagnostický postup, v němž lze pomocí restrikčního štěpení, pulsní gelové elektroforézy a následné Southernovy hybridizace změřit počet kopií repetic D4Z4 v 4q35 lokusu. Tento počet je 11-100 u standardní DNA a u pacientů 1-10, velikost jedné repetice D4Z4 je 3,3 kb. Nicméně, asi u 5% FSHD pacientů (tzv. FSHD2) se zkrácení repetic D4Z4 nevyskytuje [3]. Později bylo zjištěno, že součástí repetice D4Z4 je kandidátní gen, který by mohl kódovat protein se dvěma homeodoménami (DUX4, double homeobox 4) [4], ale jeho souvislost s patogenezí FSHD nebyla objasněna. Sekvence homologní k D4Z4 byly identifikovány také na krátkých ramenech několika dalších, především akrocentrických chromozómů [5]. FSHD je však spojena jedině s kontrakcí repetic D4Z4 na chromozómu 4, zatímco kontrakce D4Z4 na chromozómu 10 s FSHD spojena není. Monosomie subtelomerické oblasti 4q35, čili haploinsuficience v oblasti obsahující D4Z4, rovněž FSHD nevyvolává [6]. Stejně tak hybridní repetice vznikající subtelomerickou výměnou mezi chromozomy 4 a 10 (pokud celkový počet repetic na chromozomu 4 neklesne pod 11), nebo repetice translokované z chromozómu 4 na jiné chromozómy nevedou k onemocnění [7],[8]. Závislost delece D4Z4 na specifickém okolí chromozómu 4q35 ukazovala na epigenetickou podstatu FSHD. Současně se objevily hypotézy o tom, že repetice D4Z4 mají úlohu nekódujících regulačních sekvencí a jejich kontrakce vede k zvýšení exprese genů v jejich okolí až do vzdálenosti několika megabází [9],[10]. Hypotéza o příčinné úloze této tzv. poziční variability exprese (position effect variegation) v patogenezi FSHD nebyla jednoznačně prokázána, vznikla však řada studií, které na tuto atraktivní epigenetickou interpretaci navázaly. Mezi nimi je možno uvést např. práci [11], v níž autoři ukázali pomocí fluorescenční hybridizace in situ, že standardní subtelomerický lokus 4q35 je v buněčném jádře během interfáze lokalizován specificky do heterochromatinových kompartmentů na periférii jádra. Ukázalo se však také, že tato lokalizace je velmi stabilní a zůstává zachována i v myoblastech pacientů s FSHD. Autoři na základě svých výsledků spekulovali o možné izolátorové funkci repetic D4Z4, které 8 chrání proximální geny v sousedním euchromatinu před ještě silnější represí heterochromatinem distálních β-satelitních sekvencí [8] a tvoří hraniční pásmo mezi těmito epigeneticky rozdílnými kompartmenty. Podporou pro takové spekulace byla i studie, která identifikovala dvě alelické varianty uspořádání subtelomery 4q: 4qA nesoucí v sousedství D4Z4 β-satelitní sekvence, a 4qB bez těchto sekvencí [12]. Ačkoli obě varianty jsou v populaci zastoupeny podobně, FSHD je spojena výlučně se zkrácením D4Z4 v alele 4qA, zatímco stejné zkrácení u alely 4qB k FSHD nevede. Další podporu epigenetických efektů jako příčinných faktorů onemocnění přinesly studie methylačního stavu sekvencí D4Z4. Ty jsou u všech FSHD pacientů (jak u těch, kteří vykazují kontrakci repetic D4Z4, tak i u tzv. FSHD2 bez kontrakce repetic D4Z4) hypomethylovány, tj. jeví významné snížení úrovně methylace cytosinů v CpG dinukleotidech, na které jsou D4Z4 repetice poměrně bohaté [13]. Zjištění hypomethylace, jako faktoru obvykle spojeného s aktivací exprese, inspirovalo analýzy dalších chromatinových značek, zejména methylací a acetylací histonů. Tyto studie ukázaly charakteristiky 4q35 chromatinu odpovídající spíše inaktivnímu euchromatinu (případně fakultativnímu heterochromatinu) než konstitutivnímu heterochromatinu [14],[15]. Pozornost výzkumníků se proto zaměřila na možnou roli částečné delece D4Z4 při aktivaci genů DUX4 přítomných v elementech D4Z4, jejichž exprese se zdá být normálně omezena na stadium časné embryogeneze [16], zatímco mimo toto stadium byla zjištěna u FSHD myoblastů, kde má pro-apoptotické účinky [17],[18]. Vzhledem k tomu, že protein DUX4 se chová jako transkripční aktivátor [17], může hrát významnou roli při aktivaci exprese dalších genů. Byly detekovány dva typy transkriptů DUX4, z nichž první je přepisován z vnitřních repetic, zatímco druhý je přepisován z nejvíce distální D4Z4 jednotky. S touto jednotkou sousedí pLAM sekvence, která transkriptu poskytuje polyadenylační signál a podílí se tak na stabilitě vzniklé mRNA a vzniku proteinu DUX4. Vzhledem k tomu, že pLAM sekvence se vyskytuje pouze na chromozomech 4qA, tedy chromozomech asociovaných s FSHD, je její přítomnost zásadní v patofyziologii FSHD [17]. Deregulace exprese genů sousedících s D4Z4 v 4q35 lokusu (FRG1, FRG2 a ANT1) se zdála snad nejpravděpodobnější příčinou onemocnění, zvýšenou expresi těchto genů ve svalových buňkách FSHD pacientů se ale nepodařilo reprodukovatelně prokázat a ani zvýšená exprese navozená u myší nevedla k projevům svalové dystrofie [19],[20],[21],[22],[23]. Spekulovalo se rovněž o možné deregulaci dalších genů v patogenezi FSHD. Podkladem k tomu je fakt, že každá z jednotek D4Z4 obsahuje 27 pb 9 dlouhý vazebný element DBE (D4Z4-binding element), k němuž se váže komplex proteinů YY1, HMGB2 a nukleolin [10]. Vzhledem k tomu, že se uvedené proteiny účastní řady dalších procesů a interakcí (např. remodelace struktury chromatinu, transkripční aktivace nebo represe), nerovnováha vzniklá úbytkem jejich vazebných míst může deregulovat i geny lokalizované zcela mimo 4q35 lokus. Jakkoli je tato hypotéza zajímavá, její testování představuje velmi komplexní problém a zatím neexistují experimentální důkazy, které by ji podporovaly [8]. Další zajímavý posun ve zkoumání příčin FSHD přineslo zjištění, že repetice D4Z4 jsou cílovým místem pro vazbu PcG (Polycomb Group) proteinů, které obecně umlčují expresi genů a udržují chromatin v transkripčně inaktivním stavu. Tím představují významnou složku epigenetické paměti u diferencovaných buněk. U FSHD pacientů je snížena vazba PcG na zbylé repetice D4Z4, stejně jako výskyt dalších výše zmíněných epigenetických značek typických pro umlčený chromatin (methylace cytosinu, modifikace histonů – např. methylace H3K9me3, deacetylace) [24],[25]. Ztráta represivní struktury chromatinu pak aktivuje transkripci dlouhé nekódující RNA (lncRNA), nazvané DBE-T. Počátek transkripce DBE-T je v proximální oblasti před D4Z4 úsekem. Tato RNA zůstává asociovaná s chromatinem, k němuž přitahuje protein Ash1L (protein skupiny Trithorax, TrxG), jehož funkce je opačná než u PcG. Vazba tohoto proteinu vede k aktivační modifikaci ve FSHD lokusu. Tím může dojít k aktivaci nejen samotných DUX4 genů, ale i dalších genů v 4q35 lokusu. Změna v počtu kopií D4Z4 tak může fungovat jako epigenetický přepínač mezi Polycomb a Trithorax drahami. Stále ovšem zbývalo vyřešit otázku, jak dochází k aktivaci exprese genů DUX4 u FSHD2, kde ke kontrakci repetic nedochází, ačkoli zde podobně jako u FSHD1 dochází k hypomethylaci repetic D4Z4 (viz výše). Ukázalo se, že v těchto případech s hypomethylací D4Z4 kosegreguje mutace v genu pro jeden z proteinů SMC komplexů (Structural maintenance of chromosomes), SMCHD1. Snížení hladiny SCHMD1 v kosterním svalstvu v důsledku mutace v jedné z alel SMCHD1 má za následek navození exprese DUX4 i bez kontrakce D4Z4 repetic. SMCHD1 tak funguje jako epigenetický modifikátor metastabilní epialely D4Z4 a jako příčinný faktor FSHD2 [26]. Lze tedy uzavřít, že aktivace genu DUX4 je základní příčinou patogeneze FSHD [27]. Obsah tohoto proteinu je zvýšen v myoblastech a svalových vláknech FSHD pacientů a narušuje buněčnou diferenciaci. Ke všem uvedeným genetickým a epigenetickým 10 faktorům, které se na této aktivaci podílejí nebo mohou podílet, lze přidat nejméně jeden další, a sice tzv. poziční efekt telomer (telomere position effect, TPE). Podobně jak oblast D4Z4 působí jako izolátor a brání aktivaci proximálních genů i vlastních DUX4 genů, přičemž jejím zkrácením se tato izolátorová a represívní funkce ztrácí, samotná oblast D4Z4 je pod represívním pozičním vlivem svého distálního souseda – telomer. Jejich efekt záleží obecně na délce telomer a na vzdálenosti od nich, jak bylo zjištěno na řadě modelových organismů od kvasinek po savce. Nedávná studie ukázala, že exprese DUX4 je skutečně nepřímo úměrná délce telomer [28]. Zkracováním telomer se jejich umlčovací efekt zmírňuje a exprese DUX4 vzrůstá až desetinásobně. Je tedy možné, že FSHD je vůbec první známou lidskou nemocí u níž TPE přispívá k jejímu fenotypu v závislosti na věku. V CMBGT se molekulárně genetickou diagnostikou FSHD zabýváme od roku 2005. Celkem jsme vyšetřili 280 pacientů a u 132 (47%) z nich jsme pomocí restrikčního štěpení, pulsní gelové elektroforézy a Southernovy hybridizace onemocnění potvrdili. V současné době zavádíme i analýzu genu SMCHD1 a stanovení metylačního stavu repeticí D4Z4. 2.2 Duchennova svalová dystrofie, pletencové svalové dystrofie Na rozdíl od FSHD bylo stanovení molekulární podstaty Duchennovy/Beckerovy svalové dystrofie (DMD/BMD) relativně přímočarou záležitostí. DMD a její mírnější alelická varianta BMD jsou výsledkem mutací genu, který kóduje protein dytrofin (DMD). Dystrofin je cytoplazmatický protein, který je součástí membránově vázaného proteinového komplexu, který propojuje cytoskelet svalového vlákna s extrabuněčnou matrix a umožňuje tak ochranu svalové buňky před mechanickým stresem během svalové kontrakce a dilatace [29]. Gen DMD je lokalizován na chromozomu Xp21. Asi 60% mutací genu DMD je tvořeno delecemi, 5% duplikacemi a 35% mutacemi malého rozsahu [30]. Obecně platí, že mutace způsobující předčasné ukončení translace jsou spojeny s fenotypem DMD a mutace mající za následek vznik proteinu s vnitřní delecí/duplikací (Ckonec zůstává zachován) jsou spojeny s mírnějším fenotypem BMD [31]. V diagnostické praxi je však možné se setkat s případy, kdy fenotyp pacienta neodpovídá nalezenému genotypu a v takovém případě je pak nutné hledat vysvětlení zjištěné neshody. Z naší 11 laboratorní praxe, která zahrnuje 85 pacientů s identifikovanou mutací malého rozsahu a provedenými klinicko-geneticko-patologickými korelacemi, je možné uvést několik případů demonstrujících uvedenou neshodu. Za všechny případ pacienta s identifikovanou nonsense mutací, kdy očekávaným fenotypem byla DMD, ale pacient měl klinický projev odpovídající BMD. Analýza DNA byla doplněna analýzou mRNA a bylo zjištěno, že ve svalových buňkách pacienta jsou dva typy mRNA genu DMD: mRNA nesoucí identifikovanou nonsense mutaci a mRNA obsahující deleci exonu, ve kterém se tato mutace nachází. In silico analýza ukázala, že v místě mutace je v případě standardní DNA lokalizována sekvence zvaná exon splicing enhancer (místo vazby sestřihových faktorů), mutace má pak za následek změnu chování této oblasti v průběhu sestřihu mRNA, tj. nezařazení exonu do výsledné mRNA. Vzhledem k tomu, že delece tohoto exonu neruší čtecí rámec translace, vzniká protein s vnitřní delecí. Svalová vlákna uvedeného pacienta obsahují tedy dva typy DMD transkriptů (transkript s nonsense mutací a transkript s delecí) a teoreticky i dva typy DMD proteinů (zkrácený protein bez C-konce, ten ale pravděpodobně nevzniká, protože mRNA je rozložena procesem nonsense mediated mRNA decay, a protein s vnitřní delecí, který je částečně funkční). Dalším příkladem nutnosti spojení analýzy DNA a mRNA jsou pacienti, u nichž pomocí MLPA a sekvenční analýzy exonů a přilehlých intronových oblastí nejsou zjištěny mutace. Pokud ale klinické projevy a výsledky patologické analýzy svalové tkáně svědčí pro DMD, provádí se analýza mRNA, která může identifikovat inzerce intronových částí genu DMD do výsledné mRNA. Tyto inzerce většinou vznikají mutací, která hluboko uvnitř intronu vytvoří sestřihové místo a vnese část intronové sekvence tzv. pseudoexon do výsledné mRNA [publikace Neuromuscul Disord. 2009 Nov;19(11); Neuromuscul Disord. 2001 Mar;11(2)]. Pletencové svalové dystrofie (limb girdle muscular dystrophies, LGMD) jsou spojeny s mutacemi v nejméně 8 genech s autosomálně dominantní dědičností (LGMD1A-1H) a 16 genech s autosomálně recesivní dědičností (LGMD2A-Q). LGMD mohou mít podobný klinický obraz jako DMD nebo i FSHD. Základním diferenciálně diagnostickým testem je pohlaví, hodnota svalové kreatinkinázy, imunohistochemické vyšetření svalových proteinů, výskyt onemocnění v rodině; konečné potvrzení diagnózy umožňuje ale jenom molekulárně genetická diagnostika [32],[33],[34]. Stanovit gen, který se bude v rámci LGMD1 nebo LGMD2 analyzovat, je ale obtížné, protože klinické projevy většiny typů LGMD jsou podobné a imunohistochemická analýza se provádí jen u vybraných proteinů, 12 navíc jejich přítomnost nebo deficit nemusí souviset s výskytem kauzálních mutací v kódujícím genu. Často se volí postup, kdy se na základě literárních dat vyberou geny, u kterých je výskyt mutací v dané populaci nejpravděpodobnější. V CMBGT se zabýváme molekulárně genetickou diagnostikou LGMD2 od roku 2004, kdy jsme začali analyzovat gen CAPN3 (LGMD2A), a v průběhu času jsme pak přidali geny FKRP (LGMD2I), SGCA (LGMD2D), ANO5 (LGMD2L). Analýza uvedených genů byla aplikována v souboru 218 nepříbuzných pacientů a četnost výskytu jednotlivých forem LGMD2 byla 32.6% (71 pacientů) pro LGMD2A, 4.1% (9 pacientů) pro LGMD2I, 2.8% (6 pacientů) pro LGMD2D a 1.4% (3 pacientů) pro LGMD2L. V současné době jsme ale již schopni díky technologiím SeqCap-TR analyzovat většinu genů asociovaných s LGMD2 i LGMD1 [publikace Neuromuscul Disord. 2007 Feb;17(2); Neuromuscul Disord. 2004 Oct;14(10); Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies in the Czech Republic (submitted)]. V případě LGMD je zajímavé srovnání podobnosti klinických projevů na jedné straně a různosti funkce proteinů, jejichž geny jsou mutovány, na straně druhé. Jako příklad je možné uvést kalpain-3 (CAPN3), což je svalově specifická proteáza specificky štěpící své substráty [35]. Kalpain-3 se ve svalových buňkách vyskytuje volně nebo ukotven v cytoskeletu sarkomery, jeho úkolem je degradovat poškozené proteiny a přispívat tak k efektivnímu fungování svalu. Dalšími enzymy souvisejícími LGMD jsou glykosyltransferáza FKRP (fukutin related protein) [36] nebo ubikvitinligáza TRIM32 [37]. Naproti tomu s LGMD je spojena i řada strukturních proteinů účastnících se tvorby membránově vázaného komplexu s dystrofïnem (sarkoglykany alfa-delta, SGCA-SGCD) [38], ovlivňujících procesy související s reparací svalové membrány (dysferlin, DYSF) [39], podílejících se na kontrakci a dilataci svalového vlákna (titin, TTN) [40] nebo vytvářejících transmembránové iontové kanály (anoktamin 5, ANO5) [41]. Molekulárně genetická diagnostika a korelace výsledného genotypu s klinickými projevy pacienta a výsledky analýzy svalové tkáně je komplexní proces. Tento proces z pohledu molekulárního biologa musí zahrnovat analýzu typů identifikovaných mutací (missense, nonsense, splicing, delece/duplikace aj.); u missense mutací analýzu fyzikálních a chemických vlastností aminokyselin původních a mutantních a vyhodnocení mutací pomocí in silico přístupů; důležité je rovněž vyhodnocení mutací v souvislosti s lokalizací dané aminokyseliny ve struktuře proteinu resp. v jeho funkčních doménách. Vyhodnocení mutace znamená současně i analýzu publikovaných studií a databází souvisejících s daným genem. V některých případech je pro konečné potvrzení kauzality mutace nutné provést 13 její funkční analýzu, tj. zjistit jestli protein nesoucí identifikovanou mutaci plní svoji funkci. Tento přístup založený na expresi mutantních proteinů, analýze jejich buněčné lokalizace a funkce zavádíme v současné době v souvislosti s genem kódujícím chloridový kanál typu 1 (CLCN1), jehož mutantní formy jsou zodpovědné za onemocnění Thomsenova/Beckerova kongenitální myotonie, a v souvislosti s genem pro LDL receptor (LDLR) a tedy familiální hypercholesterolémií. Publikace s tématikou neuromuskulárních nemocí 1) Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies in the Czech Republic. Stehlíková K, Skálová D, Zídková J, Mrázová L, Vondráček P, Mazanec R, Voháňka S, Haberlová J, Hermanová M, Zámečník J, Souček O, Ošlejšková H, Dvořáčková N, Solařová P, Fajkusová L. Submitted (L. Fajkusová jako korespondující autor) 2) Point mutations in Czech DMD/BMD patients and their phenotypic outcome. Sedlácková J, Vondrácek P, Hermanová M, Zámecník J, Hrubá Z, Haberlová J, Kraus J, Maríková T, Hedvicáková P, Vohánka S, Fajkusová L. Neuromuscul Disord. 2009 Nov;19(11):749-53. (L. Fajkusová jako korespondující autor) 3) Novel dystrophin mutations revealed by analysis of dystrophin mRNA: alternative splicing suppresses the phenotypic effect of a nonsense mutation. Fajkusová L, Lukás Z, Tvrdíková M, Kuhrová V, Hájek J, Fajkus J. Neuromuscul Disord. 2001 Mar;11(2):133-8. (L. Fajkusová jako 1. a korespondující autor) 4) Quantitative analysis of CAPN3 transcripts in LGMD2A patients: involvement of nonsense-mediated mRNA decay. Stehlíková K, Zapletalová E, Sedlácková J, Hermanová M, Vondrácek P, Maríková T, Mazanec R, Zámecník J, Vohánka S, Fajkus J, Fajkusová L. Neuromuscul Disord. 2007 Feb;17(2):143-7. (L. Fajkusová jako 1. a korespondující autor) 5) Mutations in Czech LGMD2A patients revealed by analysis of calpain3 mRNA and their phenotypic outcome. Chrobáková T, Hermanová M, Kroupová I, Vondrácek P, Maríková T, Mazanec R, Zámecník J, Stanek J, Havlová M, Fajkusová L. Neuromuscul Disord. 2004 Oct;14(10):659-65. (L. Fajkusová jako korespondující autor) 6) CLCN1 Mutations in Czech Patients with Myotonia Congenita, In Silico Analysis of Novel and Known Mutations in the Human Dimeric Skeletal Muscle Chloride Channel. Skálová D, Zídková J, Voháňka S, Mazanec R, Mušová Z, Vondráček P, Mrázová L, Kraus J, Réblová K, Fajkusová L. PLoS One. 2013 Dec 11;8(12):e82549. (L. Fajkusová jako korespondující autor) 7) Analysis of point mutations in the SMN1 gene in SMA patients bearing a single SMN1 copy.Zapletalová E, Hedvicáková P, Kozák L, Vondrácek P, Gaillyová R, Maríková T, 14 Kalina Z, Jüttnerová V, Fajkus J, Fajkusová L. Neuromuscul Disord. 2007 Jun;17(6):476- 81. (L. Fajkusová jako korespondující autor) 15 Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies in the Czech Republic Kristýna Stehlíkováa,b , Daniela Skálováa,b , Jana Zídkováa,b , Lenka Mrázovác , Petr Vondráčekc , Radim Mazanecd , Stanislav Voháňkae , Jana Haberlováf , Markéta Hermanovág , Josef Zámečníkh , Ondřej Součeki , Hana Ošlejškovác , Nina Dvořáčková j , Pavla Solařovák , Lenka Fajkusováa,b,* a Centre of Molecular Biology and Gene Therapy, University Hospital Brno, Černopolní 9, 613 00 Brno, Czech Republic b Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 5, 625 00 Brno, Czech Republic c Department of Child Neurology, University Hospital Brno, Černopolní 9, 613 00 Brno, Czech Republic d Department of Neurology, Second Faculty of Medicine, Charles University and University Hospital Motol, V Úvalu 84, 150 06 Prague, Czech Republic e Department of Neurology, University Hospital Brno, Jihlavská 20, 625 00 Brno, Czech Republic f Department of Child Neurology, Second Faculty of Medicine, Charles University and University Hospital Motol, V Úvalu 84, 150 06 Prague, Czech Republic g First Department of Pathological Anatomy, Faculty of Medicine, Masaryk University and St. Anne´s University Hospital, Pekařská 53, 656 91 Brno, Czech Republic h Department of Pathology and Molecular Medicine, Second Faculty of Medicine, Charles University and University Hospital Motol, V Úvala 84, 150 06 Prague, Czech Republic i Institute of Pathology, University Hospital Brno, Jihlavská 20, 625 00 Brno, Czech Republic j Departmemt of Medical Genetics, University Hospital Ostrava, 17. Listopadu 1790, 708 52 Ostrava, Czech Republic k Department of Medical Genetics, University Hospital Hradec Králové, Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové, Ostrava * Corresponding author: Lenka Fajkusová Central European Institute of Technology 16 Masaryk University Kamenice 5 CZ-62500 Brno, Czech Republic e-mail: lenka.fajkus@gmail.com Phone: +420-532234625 Fax: +420-532234623 Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies in the Czech Republic Abstract Introduction: Limb-girdle muscular dystrophies (LGMD) include a number of disorders with heterogeneous etiology. In this study, we determined the frequency of LGMD subtypes within a cohort of Czech LGMD2 patients using mutational analysis of the CAPN3, FKRP, SGCA, and ANO5 genes. Results: Mutations of the CAPN3 gene are the most common cause of LGMD2 and in the set of 218 Czech probands with suspicion of LGMD2, mutations in this gene were identified in 71 patients. Totally, we detected 37 different mutations of which 12 have been described only in Czech LGMD2A patients. The mutation c.550delA is the most frequent among our LGMD2A probands and was detected in 47.1% of CAPN3 mutant alleles. The frequency of particular forms of LGMD2 was 32.6% for LGMD2A (71 probands), 4.1% for LGMD2I (9 probands), 2.8% for LGMD2D (6 probands), and 1.4% for LGMD2L (3 probands). Further, we present first results of a new approach established in the Czech Republic for diagnostics of neuromuscular diseases: sequence capture and targeted resequencing. Using this approach, we identified patients with mutations in the DYSF and SGCB genes. Conclusions: We characterised a cohort of Czech LGMD2 patients on the basis of mutation analysis of genes associated with the most common forms of LGMD2 in the European population and subsequently compared the occurrence of particular forms of LGMD2 among countries on the basis of our results and published studies. 17 Background Limb-girdle muscular dystrophies (LGMD) are characterised by wide clinical and genetic heterogeneity. Considering this, achieving a precise diagnosis can be difficult and requires a comprehensive clinical and laboratory approach. LGMD are known to be associated with mutation/mutations in at least 8 genes with autosomal dominant inheritance (LGMD1A- 1H) and 16 genes with autosomal recessive inheritance (LGMD2A-Q). It is helpful to take into account the geographical and ethnic origins of patients in differential diagnosis, since the relative local frequency of the different forms of LGMD varies considerably [1],[2],[3],[4]. The clinical course of LGMD ranges from severe to milder forms with different age of onset and progression even within the same family [5]. Diagnosis of LGMD relies on a combination of clinical findings, results of histopathological examination of muscle biopsy (including the analysis of muscle proteins using immunohistochemistry and/or immunoblotting), followed by DNA sequencing to identify the primary mutation, which is essential for the provision of genetic and prognostic counselling. LGMD2A, caused by mutations in the calpain-3 gene (CAPN3), is probably the most frequent form of LGMD2 in Europe. The CAPN3 gene encodes a muscle-specific member of the family of Ca2+ -activated neutral proteases that is important for muscle remodelling [6],[7],[8]. In calpainopathy, a marked clinical heterogeneity has been observed. While null type gene mutations are usually associated with absence of calpain-3 protein in muscle and a severe phenotype, missense-type mutations are associated with an unpredictability of their effect at both the protein and the phenotype levels [9],[10],[11]. Mutations in the fukutin-related protein gene (FKRP) result in two distinct allelic diseases: severe congenital muscular dystrophy and LGMD2I [12]. The missense mutation c.826C>A, p. Leu276Ile is particularly common in LGMD2I patients and has been reported to confer a relatively mild phenotype when present in the homozygous state [13],[14],[15]. The FKRP gene encodes a putative Golgi-resident glycosyltransferase that is involved in posttranslational glycosylation of the α-dystroglycan. LGMD2C-2F are due to mutations in the genes encoding the components of the sarcoglycan (SG) complex. The SG complex, composed of 5 glycoproteins (α-, β-, γ-, δ-, ε-SG), is a member of the dystrophin-associated glycoprotein (DAG) complex localised to the sarcolemma of muscle fibres, which acts as a link between the extracellular matrix and 18 the cytoskeleton, confers structural stability, and protects the sarcolemma from mechanical stress developed during muscle contraction. The clinical phenotype of sarcoglycanopathies ranges from a severe Duchenne-like dystrophy to a relatively mild LGMD [16]. Although the relative frequency of mutations in the different sarcoglycan genes varies from population to population, α-sarcoglycanopathy (LGMD2D) appears to be the most frequent [17]. Recently, recessive mutations in the anoctamin 5 gene (ANO5) were identified as a cause of LGMD2L and non-dysferlin Miyoshi myopathy [18],[19]. ANO5 encodes a member of the anoctamin family of proteins which contains eight transmembrane domains. Dominant mutations in the ANO5 gene are associated with the skeletal disorder gnathodiaphyseal dysplasia [20]. While the role of ANO5 is unknown, ANO1 and ANO2, which share significant sequence homology with ANO5, are known to be calcium-activated chloride channels [21],[22],[23]. In the study by [24], analysis of ANO5 was performed in a group of 59 British and German probands, and the mutation c.191dupA was found in 15 patients, homozygously in 11 and in compound heterozygosity with another ANO5 variant in the rest. An intragenic SNP and an extragenic microsatellite marker were in linkage disequilibrium with the mutation, suggesting a founder effect in the populations analysed. In this study, we determined the frequency of LGMD subtypes within a cohort of Czech LGMD2 patients using mutation analysis of the CAPN3, FKRP, SGCA, and ANO5 genes. We present also two patients with mutations in the gene encoding dysferlin (DYSF) and a patient with mutations in the gene encoding β-sarcoglycan (SGCB). These mutations were identified using Sequence capture and targeted resequencing (SeqCap-TR). SeqCap is a process for the capture and enrichment of selected genomic regions from full genomic DNA in a single step which, in association with targeted resequencing, allows to focus on genomic regions of interest to discover causative mutations. Patients and methods Patients For analysis of genes associated with LGMD2, patients´ blood or DNA were sent to the Centre of Molecular Biology and Gene Therapy, University Hospital Brno (as the only one laboratory performing LGMD genetic testing in the Czech Republic) from Departments of 19 Neurology and Medical Genetics of University Hospitals located in Brno, Prague, Ostrava, Hradec Králové. Patients were included into the study on the basis of fulfilment of the following criteria: 1) a clinical phenotype characterized by progressive muscle weakness affecting primarily or predominantly pelvic and/or shoulder girdle muscles and 2) dystrophic or myopathic features at muscle biopsy (if performed). Pathological analyses of muscle tissues were performed at the Institute of Pathology, University Hospital Brno, Brno and the Department of Pathology and Molecular Medicine, University Hospital Motol, Prague. Detailed clinical information was requested retrospectively on the basis of positive results of DNA analysis. Diagnoses as Duchenne muscular dystrophy, spinal muscular atrophy type III, facioscapulohumeral muscular dystrophy were excluded using DNA analysis, late-onset Pompe disease using the enzyme assay. All analyses were done in accord with the standards of the Committee on Human Experimentation of the University Hospital Brno. Analysis of muscle tissue Muscle tissues were routinely examined by conventional histopathological methods. Muscle protein analyses were performed using immunohistochemistry and immunoblotting as described in our previous studies [25],[26],[27]. DNA analysis Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes by the standard salting-out method and amplified. Primers for amplification of all exons and adjacent intron sequences are available on request, as well as the conditions of particular PCRs. PCR products were sequenced directly using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and analysed on the ABI PRISM 310 or ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). The resulting sequences were compared with the reference sequences of CAPN3 (NCBI NG_008660.1), FKRP (NCBI NG_008898.1), SGCA (NCBI NG_008889.1), ANO5 (NCBI NG_015844.1), DYSF (NCBI NG_008694.1), and SGCB (NCBI NG_008891.1). To find out whether the detected sequence variations were described previously, we used the literature and the Leiden Muscular Dystrophy Pages (LMDP, http://www.dmd.nl/nmdb/home.php?action=switch_db). All novel missense mutations were screened in a control panel consisting of DNA from 150 healthy Czech 20 individuals. In silico approaches, PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml), SIFT (http://sift.jcvi.org/www/SIFT_BLink_submit.html), and PON-P (http://bioinf.uta.fi/PONP/), were used for predicting effects of novel missense mutations on the function and the structure of proteins. For prediction of effects of mutations on splicing of pre-mRNA, the in silico tools NetGene2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) and SpliceView (http://zeus2.itb.cnr.it/~webgene/wwwspliceview.html) were used. The nomenclature of mutations was implemented according to the current HGVS recommendations (http://www.hgvs.org/mutnomen/). In patients with one mutation in the CAPN3 gene, detection of deletions/duplications was performed using multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). We used the SALSA MLPA P176 CAPN3 probemix kit (MRC Holland) according to the manufacturer’s guidelines. Some CAPN3 mutations were described also on the mRNA level in our previous studies [25],[26],[27]. We started with LGMD2 DNA analysis in 2002 when sequencing analysis of the CAPN3 gene was introduced and subsequently, other genes were integrated. Patients were analysed step by step for mutations in the CAPN3, FKRP, SGCA, and ANO5 genes. In CAPN3 and SGCA, all exons and adjacent intron regions were sequenced. In FKRP and ANO5, we analysed only exons with the occurrence of the most common mutations p.Leu276Ile and c.191dupA, respectively. In case of patients heterozygous for mentioned mutations, analysis of all exons of a relevant gene was performed. The mentioned genes were selected on the basis of published results related to higher percentage representation of patients with these types of LGMD2 in European populations [28],[29],[30]. Sequence capture and targeted resequencing (SeqCap-RT) For identification of mutations associated with neuromuscular disorders, we introduced a solution-based capture method SeqCap EZ Choice Library (Roche NimbleGene) and targeted resequencing on the GS Junior System (Roche) in 2013. A custom capture array was designed to capture exons and adjacent intron sequences of 42 genes (1020 exons, 280 kb) known to be associated with muscular dystrophies (Group 1), congenital muscular dystrophies (Group 2), congenital myopathies (Group 3), distal myopathies (Group 4), and other myopathies (Group 5), according to http://www.musclegenetable.org/ . The list of selected diseases and genes includes Duchenne muscular dystrophy (DMD), EmeryDreifuss muscular dystrophy (EMD, FHL1, LMNA), limb-girdle muscular dystrophy 21 (MYOT, LMNA, CAV3, CAPN3, DYSF, SGCG, SGCA, SGCB, SGCD, TCAP, TRIM32, FKRP, TTN, POMT1, ANO5, FKTN, POMT2, POMGNT1); and additionally genes associated with congenital muscular dystrophies (LAMA2, LARGE, SEPN1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, ITGA7, DNM2); congenital myopathies, distal myopathies, and other myopathies (NEB, TPM3, ACTA1, TPM2, TNNT1, CFL2, RYR, MTM1, BIN, CRYAB, DES, LAMP2, PABPN1). Probes for the target regions were designed by Roche NimbleGen according to the protocol NimbleGen Sequence Capture Custom Designs. Sequence capture was performed according to the manufacturer’s instructions (NimbleGen SeqCap EZ Choice Library LR User’s Guide) with modifications of DNA fragmentation and hybridisation. We replaced nebulization by shearing using the S220 Focused Ultrasonicator (Covaris) (3µg DNA, peak incident power 140 W, duty factor 10 %, 200 cycles per burst and treatment time 80 s) and replaced three days hybridization by hybridization according to the NimbleGen technical note Double Capture: High Efficiency Sequence Capture of Small Targets for use in SeqCap EZ Library Applications on 454 Sequencing Systems. Emulsion PCR and sequencing on the GS Junior System (Roche) were performed according to the emPCR Amplification Method Manual - Lib-L and the Sequencing Method Manual. Sequencing data were evaluated using the software Sequence Pilot (JSI Medical Systems). In this study, we present only results in relation to patients in who mutations in genes associated with LGMD2 were identified. Overall results and results related to other genes are a subject of another study. Results and discussion Considering the wide clinical and genetic variability of LGMD, determination of particular types of LGMD is a comprehensive process. The muscle biopsy still represents an important and economical step in diagnosis, however, protein changes documented by immunohistochemistry can be secondary or not pronounced and so a definite diagnosis requires genetic analysis. Mutations of the CAPN3 gene are the most common cause of LGMD2 and in the set of 218 Czech probands with suspicion of LGMD2, two mutations in this gene were identified in 67 patients. In 4 patients, only one CAPN3 mutation was determined, and sequence analysis was completed by MLPA but no gene deletions/duplications were found (Table 1). Totally, we identified 37 different mutations 22 of which 12 have been described only in Czech LGMD2A patients. The most frequent mutation among our LGMD2A probands is c.550delA which was detected in 65 mutant alleles from the total number of 138 (47.1 %). Patients´ clinical and pathological findings (when available) are presented in Table 1S (Additional file 1). Probands negative for CAPN3 mutations (151) were analysed for the most common mutation p. Leu276Ile in the FKRP gene. The homozygous occurrence of this mutation was identified in 7 patients. In two patients heterozygous for p.(Leu276Ile), we were able to identify a second mutation – patient 79 carries the mutation p.(Pro316Arg) described in the study of [12], and patient 80 has the new mutation p.(Trp359Ser) (Table 2). In 142 probands without mutations in the CAPN3 or FKRP genes, we performed analysis of the SGCA gene. Mutations were detected in 6 patients (Table 2). The most common mutation among our LGMD2D patients is p.(Arg77Cys), which was present in 4 mutant alleles. We identified also one new SGCA mutation, c.303dupA (patient 85). Probands negative for CAPN3, FKRP, and SGCA mutations (136) were screened for the most common mutation c.191dupA in the ANO5 gene. This mutation was found heterozygously in 3 patients, and subsequent sequencing analysis of all exons and adjacent intron regions detected the mutation p.(Arg758Lys) in two of them (Table 2). The mutation p.(Arg758Lys) was described in combination with c.191dupA in other studies [24],[31] and associated phenotypes corresponded to distal non-dysferlin Miyoshi myopathy, unlike our patient 88 whose phenotype matches rather LGMD2L (a detailed description of the phenotype of patient 89 was not available). Analysis of the mutation p.(Arg758Lys) was subsequently performed in all LGMD2 patients with unconfirmed diagnosis at the DNA level but this mutation was not detected. In patient 87 carrying c.191dupA on one allele, we did not identify a second mutation, only the polymorphism p.(Leu322Phe) described in LMDP. Patients´ clinical and pathological findings are presented in Table 2S (Additional file 2). The aim of the study was to evaluate the relative proportion of the most frequent types of LGMD2 identified in European countries in Czech probands with the suspicion of LGMD2. The results show that the frequency of the forms of LGMD2 analysed is 32.6% for LGMD2A (71 probands), 4.1% for LGMD2I (9 probands), 2.8% for LGMD2D (6 probands), and 1.4% for LGMD2L (3 probands). These results indicate that there is good agreement between the frequency of particular forms of LGMD2 in the Czech Republic and in Italy (LGMD2A 31.1%, LGMD2I 7.4%, LGMD2D 8.4%, LGMD2L 2.1% [28]; and LGMD2A 28.4%, LGMD2I 6.4%, LGMD2D 8.3% [2]), in contrast to studies from 23 Denmark where the frequency of LGMD2A is significantly lower (12.1%) and that of LGMD2I significantly higher (38.4%) [29] (Table 3). In 2013, we introduced the SeqCap-TR method for genetic diagnostics of neuromuscular disorders, and using this approach we identified two patients with LGMD2B (mutations in the DYSF gene) and a patient with LGMD2E (mutations in the SGCB gene). Patient 90 is the compound heterozygote for two DYSF mutations (genotype p.[Gln1278*];[Asp1837Tyr]). Compound heterozygous and homozygous occurrence of p.(Gln1278*) was described in the study of [32], in the case of a homozygous patient an initial phenotype corresponded to Miyoshi myopathy. The mutation c.5509G>T, p.(Asp1837Tyr) was not identified so far, but the mutation c.5509G>A, p.(Asp1837Asn) was described in several studies. In the study of [33], a patient carried the genotype p.[Asp1837Asn];[Trp1968*] and the phenotype of LGMD2B, and in the study of [34] and [35] patients with the genotype p.[Asp1837Asn];[Tyr522*] had Miyoshi myopathy. In cases of homozygous occurrence of the mutation, phenotypes of Miyoshi myopathy [36],[37],[38] and also of LGMD2B [38] were observed. The phenotype of our patient 90 corresponded rather with LGMD2B. Patient 91 carries 4 mutations in the DYSF gene – p.(Ala170Glu), p.(Arg204*), p.(Val374Leu), and a novel mutation p.(Trp1969Cys). The mutation p.(Ala170Glu) is described in the LMDP as unknown pathogenic, probably pathogenic, and pathogenic; and the mutation p.(Val374Leu) as probably not pathogenic and pathogenic. The evaluation of these missense mutations using in silico tools is described in Table S3 (Additional file 3) together with the evaluation of selected missense mutations identified in the genes analysed. DNA analysis was performed in patient´s parents; her father carries p.(Arg204*) and p.(Val374Leu), her mother carries p.(Ala170Glu) and p.(Trp1969Cys). On the basis of in silico tools and inheritance in the patient´s family, we suppose that p.(Arg204*) and p.(Trp1969Cys) are causal mutations. Patient 92 is homozygous for the SGCB mutation p.(Ser114Phe) described in the LMDP in association with LGMD2E. The patients´ clinical and pathological findings are shown in Table 2S (Additional file 2). All novel missense mutations were tested on 150 control DNAs and none of them were detected. Conclusions 24 We characterised a cohort of Czech LGMD2 patients on the basis of mutation analysis of genes associated with the most common forms of LGMD2 in the European population and compared these results with published studies. This study expands our previous results obtained in the Czech LGMD2A population [25],[26],[27] as well as the mutation spectrum in other types of LGMD2, and further provides information concerning clinical and genetic correlations. Additional file Additional file 1: Table S1. Mutations and pathological-clinical findings identified in Czech LGMD2A probands Additional file 2: Table S2. Mutations and pathological-clinical findings identified in Czech LGMD2I, 2D, 2L, 2B, and 2E probands Additional file 3: Table S3. In silico prediction of effects of selected missense mutations List of abbreviations DAG complex, Dystrophin-associated glycoprotein complex; LGMD, Limb-girdle muscular dystrophy; LMDP, Leiden muscular dystrophy pages; MLPA, Multiplex ligation-dependent probe amplification SG complex, Sarcoglycan complex; SeqCap-TR, Sequence capture and targeted resequencing; Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Authors´ contributions 25 KS, DS, JZ carried out the molecular genetic studies. LM, PV, RM, SV, JH, HO, ND, PS performed clinical diagnostics of LGMD patients. MH, JZ, OS were involved in pathological analysis of muscle tissue. LF participated in design study and the manuscript preparation. Acknowledgements This work was funded by the project of the Internal Grant Agency of the Czech Ministry of Health (NT/14574-3); the projects of the Czech Ministry of Education “CEITEC – Central European Institute of Technology” (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) and SuPReMMe (CZ.1.07/2.3.00/20.0045); and the project of the Czech Ministry of Health for conceptual development of research organization 65269705 (University Hospital Brno, Brno, Czech Republic) and MH – DRO, University Hospital Motol, Prague, Czech Republic 00064203 . We would like to thank the physicians from Departments of Neurology and Medical Genetics in the Czech Republic (Drs. P. Doležalová, M. Forgáč, R. Gaillyová, D. Grečmalová, A. Gřegořová, M. Havlová, T Honzík, P. Ješina, Z. Kalina, K. Kalous, V. Křivková, R. Kutějová, M. Langová, T. Maříková, Š. Prášilová, D. Polendová, M. Soukupová, J. Staněk, M. Ševčíková, E. Šilhánová, S. Širůčková, D. Tenora, J. Zvolská) for providing us with their patients’ blood samples. References 26 1. Kang PB, Feener CA, Estrella E, Thorne M, White AJ, Darras BT, Amato AA, Kunkel LM: LGMD2I in a North American population. BMC Musculoskelet Disord 2007, 8:115. 2. Guglieri M, Magri F, D'Angelo MG, Prelle A, Morandi L, Rodolico C, Cagliani R, Mora M, Fortunato F, Bordoni A et al: Clinical, molecular, and protein correlations in a large sample of genetically diagnosed Italian limb girdle muscular dystrophy patients. Hum Mutat 2008, 29(2):258-266. 3. Lo HP, Cooper ST, Evesson FJ, Seto JT, Chiotis M, Tay V, Compton AG, Cairns AG, Corbett A, MacArthur DG et al: Limb-girdle muscular dystrophy: diagnostic evaluation, frequency and clues to pathogenesis. Neuromuscul Disord 2008, 18(1):34-44. 4. van der Kooi AJ, Frankhuizen WS, Barth PG, Howeler CJ, Padberg GW, Spaans F, Wintzen AR, Wokke JH, van Ommen GJ, de Visser M et al: Limb-girdle muscular dystrophy in the Netherlands: gene defect identified in half the families. Neurology 2007, 68(24):2125-2128. 5. Zatz M, Vainzof M, Passos-Bueno MR: Limb-girdle muscular dystrophy: one gene with different phenotypes, one phenotype with different genes. Curr Opin Neurol 2000, 13(5):511-517. 6. Richard I, Broux O, Allamand V, Fougerousse F, Chiannilkulchai N, Bourg N, Brenguier L, Devaud C, Pasturaud P, Roudaut C et al: Mutations in the proteolytic enzyme calpain 3 cause limb-girdle muscular dystrophy type 2A. Cell 1995, 81(1):27-40. 7. Sorimachi H, Kinbara K, Kimura S, Takahashi M, Ishiura S, Sasagawa N, Sorimachi N, Shimada H, Tagawa K, Maruyama K et al: Muscle-specific calpain, p94, responsible for limb girdle muscular dystrophy type 2A, associates with connectin through IS2, a p94-specific sequence. J Biol Chem 1995, 270(52):31158-31162. 8. Keira Y, Noguchi S, Minami N, Hayashi YK, Nishino I: Localization of calpain 3 in human skeletal muscle and its alteration in limb-girdle muscular dystrophy 2A muscle. J Biochem 2003, 133(5):659-664. 9. Fanin M, Fulizio L, Nascimbeni AC, Spinazzi M, Piluso G, Ventriglia VM, Ruzza G, Siciliano G, Trevisan CP, Politano L et al: Molecular diagnosis in LGMD2A: mutation analysis or protein testing? Hum Mutat 2004, 24(1):52-62. 10. Piluso G, Politano L, Aurino S, Fanin M, Ricci E, Ventriglia VM, Belsito A, Totaro A, Saccone V, Topaloglu H et al: Extensive scanning of the calpain-3 gene broadens the spectrum of LGMD2A phenotypes. J Med Genet 2005, 42(9):686- 693. 11. Saenz A, Leturcq F, Cobo AM, Poza JJ, Ferrer X, Otaegui D, Camano P, Urtasun M, Vilchez J, Gutierrez-Rivas E et al: LGMD2A: genotype-phenotype correlations based on a large mutational survey on the calpain 3 gene. Brain 2005, 128(Pt 4):732-742. 12. Brockington M, Blake DJ, Prandini P, Brown SC, Torelli S, Benson MA, Ponting CP, Estournet B, Romero NB, Mercuri E et al: Mutations in the fukutin-related protein gene (FKRP) cause a form of congenital muscular dystrophy with secondary laminin alpha2 deficiency and abnormal glycosylation of alphadystroglycan. Am J Hum Genet 2001, 69(6):1198-1209. 13. Mercuri E, Brockington M, Straub V, Quijano-Roy S, Yuva Y, Herrmann R, Brown SC, Torelli S, Dubowitz V, Blake DJ et al: Phenotypic spectrum associated with mutations in the fukutin-related protein gene. Ann Neurol 2003, 53(4):537-542. 27 14. Walter MC, Petersen JA, Stucka R, Fischer D, Schroder R, Vorgerd M, Schroers A, Schreiber H, Hanemann CO, Knirsch U et al: FKRP (826C>A) frequently causes limb-girdle muscular dystrophy in German patients. J Med Genet 2004, 41(4):e50. 15. Frosk P, Greenberg CR, Tennese AA, Lamont R, Nylen E, Hirst C, Frappier D, Roslin NM, Zaik M, Bushby K et al: The most common mutation in FKRP causing limb girdle muscular dystrophy type 2I (LGMD2I) may have occurred only once and is present in Hutterites and other populations. Hum Mutat 2005, 25(1):38-44. 16. Angelini C, Fanin M, Freda MP, Duggan DJ, Siciliano G, Hoffman EP: The clinical spectrum of sarcoglycanopathies. Neurology 1999, 52(1):176-179. 17. Straub V, Bushby K: The childhood limb-girdle muscular dystrophies. Semin Pediatr Neurol 2006, 13(2):104-114. 18. Jarry J, Rioux MF, Bolduc V, Robitaille Y, Khoury V, Thiffault I, Tetreault M, Loisel L, Bouchard JP, Brais B: A novel autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy with quadriceps atrophy maps to 11p13-p12. Brain 2007, 130(Pt 2):368-380. 19. Bolduc V, Marlow G, Boycott KM, Saleki K, Inoue H, Kroon J, Itakura M, Robitaille Y, Parent L, Baas F et al: Recessive mutations in the putative calciumactivated chloride channel Anoctamin 5 cause proximal LGMD2L and distal MMD3 muscular dystrophies. Am J Hum Genet 2010, 86(2):213-221. 20. Tsutsumi S, Kamata N, Vokes TJ, Maruoka Y, Nakakuki K, Enomoto S, Omura K, Amagasa T, Nagayama M, Saito-Ohara F et al: The novel gene encoding a putative transmembrane protein is mutated in gnathodiaphyseal dysplasia (GDD). Am J Hum Genet 2004, 74(6):1255-1261. 21. Schroeder BC, Cheng T, Jan YN, Jan LY: Expression cloning of TMEM16A as a calcium-activated chloride channel subunit. Cell 2008, 134(6):1019-1029. 22. Yang YD, Cho H, Koo JY, Tak MH, Cho Y, Shim WS, Park SP, Lee J, Lee B, Kim BM et al: TMEM16A confers receptor-activated calcium-dependent chloride conductance. Nature 2008, 455(7217):1210-1215. 23. Stephan AB, Shum EY, Hirsh S, Cygnar KD, Reisert J, Zhao H: ANO2 is the cilial calcium-activated chloride channel that may mediate olfactory amplification. Proc Natl Acad Sci U S A 2009, 106(28):11776-11781. 24. Hicks D, Sarkozy A, Muelas N, Koehler K, Huebner A, Hudson G, Chinnery PF, Barresi R, Eagle M, Polvikoski T et al: A founder mutation in Anoctamin 5 is a major cause of limb-girdle muscular dystrophy. Brain 2011, 134(Pt 1):171-182. 25. Chrobakova T, Hermanova M, Kroupova I, Vondracek P, Marikova T, Mazanec R, Zamecnik J, Stanek J, Havlova M, Fajkusova L: Mutations in Czech LGMD2A patients revealed by analysis of calpain3 mRNA and their phenotypic outcome. Neuromuscul Disord 2004, 14(10):659-665. 26. Hermanova M, Zapletalova E, Sedlackova J, Chrobakova T, Letocha O, Kroupova I, Zamecnik J, Vondracek P, Mazanec R, Marikova T et al: Analysis of histopathologic and molecular pathologic findings in Czech LGMD2A patients. Muscle Nerve 2006, 33(3):424-432. 27. Stehlikova K, Zapletalova E, Sedlackova J, Hermanova M, Vondracek P, Marikova T, Mazanec R, Zamecnik J, Vohanka S, Fajkus J et al: Quantitative analysis of CAPN3 transcripts in LGMD2A patients: involvement of nonsense-mediated mRNA decay. Neuromuscul Disord 2007, 17(2):143-147. 28. Magri F, Del Bo R, D'Angelo MG, Sciacco M, Gandossini S, Govoni A, Napoli L, Ciscato P, Fortunato F, Brighina E et al: Frequency and characterisation of 28 anoctamin 5 mutations in a cohort of Italian limb-girdle muscular dystrophy patients. Neuromuscul Disord 2012, 22(11):934-943. 29. Sveen ML, Schwartz M, Vissing J: High prevalence and phenotype-genotype correlations of limb girdle muscular dystrophy type 2I in Denmark. Ann Neurol 2006, 59(5):808-815. 30. van der Kooi AJ, Ten Dam L, Frankhuizen WS, Straathof CS, van Doorn PA, de Visser M, Ginjaar IB: ANO5 mutations in the Dutch limb girdle muscular dystrophy population. Neuromuscul Disord 2013, 23(6):456-460. 31. Sarkozy A, Hicks D, Hudson J, Laval SH, Barresi R, Hilton-Jones D, Deschauer M, Harris E, Rufibach L, Hwang E et al: ANO5 gene analysis in a large cohort of patients with anoctaminopathy: confirmation of male prevalence and high occurrence of the common exon 5 gene mutation. Hum Mutat 2013, 34(8):1111- 1118. 32. Krahn M, Beroud C, Labelle V, Nguyen K, Bernard R, Bassez G, Figarella-Branger D, Fernandez C, Bouvenot J, Richard I et al: Analysis of the DYSF mutational spectrum in a large cohort of patients. Hum Mutat 2009, 30(2):E345-375. 33. De Luna N, Freixas A, Gallano P, Caselles L, Rojas-Garcia R, Paradas C, Nogales G, Dominguez-Perles R, Gonzalez-Quereda L, Vilchez JJ et al: Dysferlin expression in monocytes: a source of mRNA for mutation analysis. Neuromuscul Disord 2007, 17(1):69-76. 34. Matsuda C, Hayashi YK, Ogawa M, Aoki M, Murayama K, Nishino I, Nonaka I, Arahata K, Brown RH, Jr.: The sarcolemmal proteins dysferlin and caveolin-3 interact in skeletal muscle. Hum Mol Genet 2001, 10(17):1761-1766. 35. Tagawa K, Ogawa M, Kawabe K, Yamanaka G, Matsumura T, Goto K, Nonaka I, Nishino I, Hayashi YK: Protein and gene analyses of dysferlinopathy in a large group of Japanese muscular dystrophy patients. J Neurol Sci 2003, 211(1-2):23- 28. 36. Rosales XQ, Gastier-Foster JM, Lewis S, Vinod M, Thrush DL, Astbury C, Pyatt R, Reshmi S, Sahenk Z, Mendell JR: Novel diagnostic features of dysferlinopathies. Muscle Nerve 2010, 42(1):14-21. 37. Cagliani R, Magri F, Toscano A, Merlini L, Fortunato F, Lamperti C, Rodolico C, Prelle A, Sironi M, Aguennouz M et al: Mutation finding in patients with dysferlin deficiency and role of the dysferlin interacting proteins annexin A1 and A2 in muscular dystrophies. Hum Mutat 2005, 26(3):283. 38. Ueyama H, Kumamoto T, Nagao S, Masuda T, Horinouchi H, Fujimoto S, Tsuda T: A new dysferlin gene mutation in two Japanese families with limb-girdle muscular dystrophy 2B and Miyoshi myopathy. Neuromuscul Disord 2001, 11(2):139-145. 39. Fanin M, Nascimbeni AC, Aurino S, Tasca E, Pegoraro E, Nigro V, Angelini C: Frequency of LGMD gene mutations in Italian patients with distinct clinical phenotypes. Neurology 2009, 72(16):1432-1435. 40. Fanin M, Nascimbeni AC, Tasca E, Angelini C: How to tackle the diagnosis of limb-girdle muscular dystrophy 2A. Eur J Hum Genet 2009, 17(5):598-603. 41. Boito CA, Melacini P, Vianello A, Prandini P, Gavassini BF, Bagattin A, Siciliano G, Angelini C, Pegoraro E: Clinical and molecular characterization of patients with limb-girdle muscular dystrophy type 2I. Arch Neurol 2005, 62(12):1894- 1899. 42. Hanisch F, Grimm D, Zierz S, Deschauer M: Frequency of the FKRP mutation c.826C>A in isolated hyperCKemia and in limb girdle muscular dystrophy type 2 in German patients. J Neurol 2010, 257(2):300-301. 29 Table 1. Mutations identified in Czech LGMD2A probands No. Mutations (cDNA level) Mutations (protein level) 1 - 23 c.550delA/c.550delA p.(Thr184Argfs*36)/p.(Thr184Argfs*36) 24, 25 c.550delA/c.245C>T p.(Thr184Argfs*36)/p.(Pro82Leu) 26 c.550delA/c.328C>T p.(Thr184Argfs*36)/p.(Arg110*) 27 c.550delA/c.509A>G p.(Thr184Argfs*36)/p.(Tyr170Cys) 28 c.550delA/c.598_612del p.Thr184Argfs*36/p.Phe200_Leu204del 29 c.550delA/c.1043delG p.(Thr184Argfs*36)/p.(Gly348Valfs*4) 30 c.550delA/c.1069C>T p.(Thr184Argfs*36)/p.(Arg357Trp) 31 c.550delA/c.1451T>C p.(Thr184Argfs*36)/p.(Leu484Pro) 32 c.550delA/c.1465C>T p.(Thr184Argfs*36)/p.(Arg489Trp) 33, 34 c.550delA/c.1468C>T p.Thr184Argfs*36/p.(Arg490Trp) 35 c.550delA/c.1470delG p.(Thr184Argfs*36)/p.(Arg490Argfs*6) 36, 37 c.550delA/c.1722delC p.Thr184Argfs*36/p.Ser575Leufs*20 38 c.550delA/c.1823G>A p.(Thr184Argfs*36)/p.(Arg608Lys) 39 c.550delA/c.1981delA p.Thr184Argfs*36/p.Ile661* 40 c.550delA/c.2245A>C p.(Thr184Argfs*36)/p.(Asn749His) 41 c.1A>G/c.865C>T p.(Met1Val)/p.(Arg289Trp) 42 c.133G>A/c.133G>A p.Ala45Thr/p.Ala45Thr 43 c.146G>A/c.1069C>T p.(Arg49His)/p.(Arg357Trp) 44 c.224A>G/c.224A>G p.Tyr75Cys/p.Tyr75Cys 45 c.245C>T/c.245C>T p.Pro82Leu/p.Pro82Leu 46 c.245C>T/c.1800+1G>A p.(Pro82Leu)/splicing 47 c.245C>T/c.1855C>T p.(Pro82Leu)/p.(Gln619*) 48 c.245C>T/c.2314_2317del p.Pro82Leu/p.Asp772Asnfs*3 49 c.509A>G/c.509A>G p.(Tyr170Cys)/p.(Tyr170Cys) 50 c.598_612del/c.598_612del p.(Phe200_Leu204del)/p.(Phe200_Leu204del) 51 c.598_612del/c.640G>A p.(Phe200-Leu204del)/p.(Gly214Ser) 52 c.598_612del/c.2245A>C p.Phe200-Leu204del/p.Asn749His 53 c.1043delG/c.1094G>A p.(Gly348Valfs*4)/p.(Trp365*) 54 c.1043delG/c.1343G>A p.(Gly348Valfs*4)/p.(Arg448His) 55 c.1194-9A>G/c.1800+1G>A splicing/splicing 56 c.1194-9A>G/c.2393C>A splicing/p.(Ala798Glu) 30 57 c.1250C>T/c.1250C>T p.(Thr417Met)/p.(Thr417Met) 58 c.1322G>A/c.1322G>A p.Gly441Asn/p.Gly441Asn 59 c.1322delG/c.2114A>G p.(Gly441Valfs*22)/p.(Asp705Gly) 60 c.1343G>A/c.2093G>A p.(Arg448His)/p.(Arg698His) 61 c.1468C>T/c.2314_2317del p.(Arg490Trp)/p.(Asp772Asnfs*3) 62 c.1788_1793del/c.2242C>T p.Lys597_Lys598del/p.Arg748* 63 - 66 c.598_612del/c.1746-20C>G p.(Phe200_Leu204del)/splicing 67 c.614T>C/c.1746-20C>G p.(Leu205Pro)/splicing 68, 69 c.550delA/- p.(Thr184Argfs*36)/- 70, 71 c.598_612del/- p.(Phe200_Leu204del)/Mutations in bold letters were detected only in Czech LGMD2A patients. Table 2. Mutations identified in Czech LGMD2I, 2D, 2L, 2B, and 2E probands No. Gene Mutation (cDNA level) Mutation (protein level) 72 - 78 FKRP c.826C>A/c.826C>A p.(Leu276Ile)/p.(Leu276Ile) 79 FKRP c.826C>A/c.947C>G p.(Leu276Ile)/p.(Pro316Arg) 80 FKRP 826C>A/c.1076G>C p.(Leu276Ile)/p.(Trp359Ser) 81 SGCA c.229C>T/c.229C>T p.(Arg77Cys)/p.(Arg77Cys) 82, 83 SGCA c.157+1G>A/c.850C>T splicing/p.(Arg284Cys) 84 SGCA c.229C>T/c.739G>A p.(Arg77Cys)/p.(Val247Met) 85 SGCA c.290A>G/c.303dupA p.(Asp97Gly)/p.(Gln101Glnfs*4) 86 SGCA c.229C>T/c.308T>C p.(Arg77Cys)/p .(Ile103Thr) 87 ANO5 c.191dupA/c.966A>T p.(Asn64Lysfs*15)/p.(Leu322Phe) 88, 89 ANO5 c.191dupA/c.2272C>T p.(Asn64Lysfs*15)/p.(Arg758Cys) 90 DYSF c.3832C>T/c.5509G>T p.(Gln1278*)/p.(Asp1837Tyr) 91 DYSF c.509C>A/c.5907G>C c.610C>T/c.1120G>C/ p.(Ala170Glu)/p.(Trp1969Cys) p.(Arg204*)/p.(Val374Leu)/ 92 SGCB c.341C>T/c.341C>T p.(Ser114Phe)/p.(Ser114Phe) Mutations in bold letters were detected only in Czech LGMD2 patients. The variant c.966A>T written in italics is probably a nucleotide polymorphism (LMDP, dbSNP- rs7481951). 31 Table 3. Frequency of LGMD2A, 2I, 2D, 2L in European countries Litera- ture Population Number of patients analysed in the study Number and percentage of patients with LGMD2A Number and percentage of patients with LGMD2I Number and percentage of patients with LGMD2D Number and percentage of patients with LGMD2L This study Czech 218 LGMD2 probands 71 (67 had two mutations, 4 one); 32.6% 9; 4.1% 6; 2.8% 3; 1.4% [28] Italy 190 LGMD probands 59; 31.1% 14; 7.4% 16; 8.4% 4; 2.1% [2] Italy 155 LGMD probands 44 (30 had two mutations, 14 one); 28.4% 10; 6.4% 13; 8.4% NI [39] Italy 550 patients with LGMD, myopathy, or asymptomatic hyperCKemia 102; 18.5% 16; 2.8% 37; 6.7% NI [40] Italy 519 patients with LGMD, myopathy, or asymptomatic hyperCKemia 94 (76 had two mutations, 18 one); 18.1% NI NI NI [10] Italy 530 patients with muscular dytrophy 141 (104 had two mutations and 37 one); 26.6% NI NI NI [41] Italy 214 probands with muscular dystrophy or myopathy NI 13 (9 had two mutations, 4 one); 6.1% NI NI [42] Germany 98 probands with LGMD2 and 102 probands with asymptomatic or minimally symptomatic hyperCKemia NI 7; 3.5% NI NI [29] Denmark 99 LGMD2 patients 12; 12.1% 38; 38.4% NI NI [4] Dutch 67 LGMD probands 14; 20.9% 5; 7.5% NI NI [30] Dutch 68 LGMD probands NI NI NI 11; 16.2% NI: no information 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 3 Dědičné kožní nemoci Genodermatózy jsou dědičná onemocnění kůže, která jsou charakterizována velkou klinickou a genetickou variabilitou. V CMBGT se molekulárně genetickou diagnostikou genodermatóz zabýváme od roku 2005, kdy jsme zavedli diagnostiku epidermolysis bullosa dystrophica (analýza mutací v genu COL7A1) a epidermolysis bullosa simplex (analýza mutací v genech KRT5 a KRT14). V roce 2013 jsme pak začali s molekulárně genetickou diagnostikou ichtyózy vulgaris (analýza mutací v genu FLG), X-vázané ichtyózy (stanovení delece genu STS), autozomálně recesivních kongenitálních ichtyóz (analýza mutací v genech ALOX12B, ALOXE3, NIPAL4, CYP4F22, TGM1) a incontinentia pigmenti (analýza mutací v genu NEMO). Nejčastějšími metodickými přístupy v genetické diagnostice genodermatóz jsou PCR a sekvenční analýza. V současné době se snažíme problematiku dědičných onemocnění kůže postihnout v co možná nejširším měřítku a zavádíme, podobně jako v případě neuromuskulárních nemocí, techniky sekvenování nové generace (SeqCap-TR) pro analýzu všech genů asociovaných s vybranými typy nemocí. V oblasti genodermatóz spolupracujeme především s Kožním oddělením Pediatrické kliniky Fakultní nemocnice Brno, Oddělením lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno a 1. Patologicko-anatomickým ústavem Fakultní nemocnice u sv. Anny. V těsné spolupráci s uvedenými pracovišti provádíme genetickou analýzu pacientů s podezřením na některou z výše uvedených nemocí a následně korelace mezi genetickými, klinickými a patologickými nálezy. 72 Obrázek 1: Schématické znázornění lokalizace proteinů asociovaných s onemocněním epidermolysis bullosa a ichtyóza v kožním řezu; obrázky klinických projevů epidermolysis bullosa a ichtyóza 3.1 Epidermolysis bullosa Epidermolysis bullosa (EB) je onemocnění charakterizované extrémně křehkou kůží a puchýři. EB je tradičně dělena do tří hlavních typů v závislosti na lokalizaci místa vzniku puchýře: EB simplex (EBS, puchýř vzniká v epidermis), junkční EB (JEB, puchýř vzniká na úrovni bazální membrány), dystrofická EB (DEB, puchýř vzniká v dermis těsně pod bazální membránou). Vzhledem k tomu, že se v současné době zabýváme molekulárně genetickou diagnostikou pouze DEB a EBS, další část bude podrobněji pojednávat jen o těchto typech EB. 73 Dystrofická EB může být děděna autosomálně dominantně nebo recesivně. Oba typy dědičnosti DEB jsou spojeny s mutacemi v genu, který kóduje kolagen typu VII (COL7A1) [42]. Fenotypové projevy onemocnění mají rozsah od mírné “nail-only” dominantní DEB až po nejzávažnější recesivní DEB s generalizovanými puchýři a jizvením, které vede k fúzi prstů na rukou a nohou, kromě kožních projevů mohou být postiženy i sliznice [43]. U dominantní DEB patogenní mutace zahrnují heterozygotní, dominantně negativní substituce glycinu. Recesivní DEB je způsobena kombinací mutací typu nonsense, splicing, frame-shift, missense. Některé případy recesivní DEB jsou také spojeny se substitucemi glycinu, které ale nemají klinický dopad, pokud druhá alela nenese mutaci [44],[45]. Kolagen typu VII vytváří kotvící fibrily, které spojují dermis s bazální membránou. Gen COL7A1 kóduje alfa1-řetězec prokolagenu typu VII [proa1(VII)]. Tři řetězce proa1(VII) vytváří monomer uspořádaný do trojité kolagenní šroubovice s nekolagenními N- a Ckoncovými doménami, následuje vznik antiparalelního dimeru ze dvou monomerů, odštěpení C-koncových domén a laterální agregace dimerů za vzniku kotvících fibril [46],[47]. Pro kolagenní trojšroubovici je charakteristická opakující se sekvence Glycin-XY, kde X a Y představují často lyzin nebo prolin. Přesné zachování glycinu v každé třetí pozici je požadováno z důvodu těsného sbalení tří řetězců proa1(VII). Glycin, jako nejmenší aminokyselina, je ukrytý ve středu trojšroubovice a jakákoli záměna této aminokyseliny vede k narušení struktury [48]. Kolagenní doména je několikrát přerušena krátkými nonhelikálními úseky, které jsou důležité pro intramolekulární flexibilitu proteinu. Klinicko-genetické korelace popsané v literatuře i provedené u našich 61 pacientů s mutacemi v genu COL7A1 většinou odpovídají předpokládu, že kombinace dvou mutací vytvářejících předčasný terminační kodón (PTC) má závažnější klinický dopad než kombinace missense a PTC mutace. V případě srovnání klinických projevů pacientů se substitucí glycinu a PTC mutací a pacientů s missense mutací (jiná než substituce glycinu) a PTC mutací závažnější klinický projev mají pacienti nesoucí záměnu glycinu [publikace J Dermatol Sci. 2010 Aug;59(2)]. EB simplex je způsobena cytolýzou bazálních keratinocytů. Na základě závažnosti klinických příznaků jsou rozlišovány tři základní autosomálně dominantní subtypy EBS. U lokalizované EBS se puchýře často nachází jen na dlaních a ploskách nohou. U vzácné generalizované EBS se puchýře vyskytují po celém těle, ale průběh onemocnění je mírnější 74 než u nejzávažnější formy EBS Dowling-Meara. Všechny subtypy EBS jsou způsobeny mutacemi v genu kódujícím keratin 5 (KRT5) nebo keratin 14 (KRT14) [49],[50],[51]. Keratin 5 a keratin 14 jsou strukturní proteiny vytvářející keratinová intermediární filamenta [49],[52], která poskytují buňce mechanickou pevnost. Na základě fyzikálních a chemických vlastností jsou keratiny rozděleny do dvou skupin: keratiny typu I (KRT9KRT24) a keratiny typu II (KRT1-KRT8) [53]. Základní strukturní jednotkou intermediárních filament je heterodimer složený z keratinu typu I a keratinu typu II [54] . V bazálních keratinocytech jsou přirozenými partnery pro vznik heterodimeru keratin 5 a keratin 14 stáčející se kolem sebe za vzniku paralelního dimeru, ten vytváří antiparalelní tetramer, následuje vznik protofilament, protofibril a intermediárních filament. Charakteristickým rysem všech keratinů je jejich centrální alfa-helikální tyčinková doména rozdělená do čtyř helikálních segmentů (1A, 1B, 2A, 2B) třemi nonhelikálními úseky a ohraničená N- a C-koncovými globulárními doménami. Na počátku segmentu 1A a na konci segmentu 2B se vyskytují dvě vysoce konzervované oblasti, helix initiation peptide a helix termination peptide, mutace lokalizované v těchto sekvencích jsou spojeny s nejzávažnější formou EBS-DM. Naproti tomu mutace v nonhelikálních oblastech jsou asociovány spíše s mírnějšími formami EBS [55],[56] . Klinicko-genetické korelace zjištěné u našich 28 pacientů s mutacemi v genu KRT5 nebo KRT14 odpovídají těmto předpokladům [publikace Br J Dermatol. 2010 May;162(5)]. Publikace 1) Analysis of the COL7A1 gene in Czech patients with dystrophic epidermolysis bullosa reveals novel and recurrent mutations. Jerábková B, Kopecková L, Bucková H, Veselý K, Valícková J, Fajkusová L. J Dermatol Sci. 2010 Aug;59(2):136-40.(L. Fajkusová jako korespondující autor) 2) Keratin mutations in patients with epidermolysis bullosa simplex: correlations between phenotype severity and disturbance of intermediate filament molecular structure. Jerábková B, Marek J, Bucková H, Kopecková L, Veselý K, Valícková J, Fajkus J, Fajkusová L. Br J Dermatol. 2010 May;162(5):1004-13.(L. Fajkusová jako korespondující autor) 75 3.2 Ichtyózy Ichtyózy jsou heterogenní skupinou nemocí charakterizovanou abnormálním šupinatěním kůže. Šest hlavních klinických subtypů je známo u nesyndromatických ichtyóz; počínaje nejzávažnější formou zvanou harlekýnská ichtyóza (HI), přes lamelární ichtyózu (LI), nebulózní kongenitální erytrodermickou ichtyózu (CIE), bulózní kongenitální erytrodermickou ichtyózu (BCIE), X-vázanou ichtyózu (XLI), až po nejmírnější ichtyózu vulgaris (IV). HI, CIE a LI se společně řadí do skupiny zvané autozomálně recesivní kongenitální ichtyózy (ARCI). Je známo několik genů odpověných za toto onemocnění: TGM1 (transglutaminase-1) [57],[58], ABCA12 (ATP-binding binding cassette, subfamily A, member 12) [59], NIPAL4 (NIPA-like domain-containing 4) [60], CYP4F22 (cytochrome P450, family 4, subfamily F, polypeptide 22) [61], ALOX12B (12-lipoxygenase, R type), ALOXE3 (lipoxygenase-3) [62]; v poslední době byl tento seznam rozšířen o další nové geny: PNPLA1 (patatin-like phospholipase domain-containing protein 1) [63], LIPN (lipase family, member N) [64], CERS3 (ceramide synthase 3) [65]. BCEI je puchýřnatá ichtyóza s autosomálně dominantní dědičností a mutacemi v genech KRT1 (keratin 1), KRT10 (keratin 10), KRT2 (keratin 2) [66], [67]. Publikovaná prevalence v evropských populacích a Severní Americe je u ARCI i BCIE 1⁄200000. XLI a IV se s prevalencí 1/2000-6000 resp. 1/250-1000 řadí mezi tzv. běžné ichtyózy. XLI postihuje mužské pohlaví, molekulární příčinou jsou mutace v genu STS (steroidní sulfatáza) [68]. IV je autozomálně semidominantní onemocnění, molekulární příčinou jsou mutace v genu FLG (filaggrin) [69]. Patologické mechanismy ichtyóz jsou spojeny s poruchou kožní bariéry, tato funkce kůže je lokalizovaná v nejvrchnější vrstvě, tzv. stratum corneum (SC). Keratinocyty jsou dominujícím typem buněk v epidermis, proliferují v bazální vrstvě epidermis (stratum basale) a v průběhu epidermální diferenciace postupují rozdílnými epidermálními vrstvami (stratum spinosum, stratum granulosum) směrem k povrchu (stratum corneum). Keratinocyty lokalizované ve SC nazýváme korneocyty. Prostor mezi jednotlivými korneocyty je vyplněn intercelulárními lipidy (ceramidy, cholesterol, volné mastné kyseliny), které jsou organizovány do lamelárních vrstev [70],[71],[72]. Intercelulární lipidové vrstvy brání nadměrnému odpařování a jejich narušení vede k patologickému 76 nárustu transepidermální ztráty vody [73]. Funkce kůže jako ochranné bariéry před vnějšími vlivy a pro zabezpečení vhodného vnitřního prostředí je umožněna třemi hlavními komponentami SC. Mezi tyto komponenty se řadí již zmíněné intercelulární lipidové vrstvy, dále pak zrohovatělá buněčná obálka korneocytu a degradační produkty keratinu a filaggrinu vyplňující cytoplazmu korneocytu. Je velmi zajímavé sledovat vzájemné propojení jednotlivých genů resp. proteinových produktů těchto genů v jejich funkčních drahách, které se podílejí na epidermální diferenciaci. Významnou úlohu při tvorbě intercelulárních lipidových vrstev hrají proteiny ABCA12, ALOX12R, ALOXE3, CYP4F22, NIPAL4, STS, které přímo souvisejí s transportem a/nebo metabolismem lipidů v epidermis. Vytváření intercelulárních lipidových vrstev je vysoce komplikovaná série procesů. Lipidy jsou baleny do lamelárních tělísek ve stratum granulosum a předány exocytózou do mezibuněčného prostoru SC. Důležitou molekulou hrající roli při transportu lipidů v lamelárních tělískách je ATP-vázající kazetový transporter ABCA12 [74],[75],[76],[77]. Lipoxygenázy ALOX12B a ALOXE3 jsou dioxygenázy oxidující komplexní lipidy: ALOX12B oxiduje O-linoleoyl-ω-hydroxyacyl-sphingosin (ceramid 1) na hydroperoxidový derivát, který je následně konvertován prostřednictvím ALOXE3 na 9R,10R-epoxy-11E-13Rhydroxylinoleoyl-ω-hydroxyacyl-sphingosin, následuje hydrolýza na ω-hydroxyacylsphingosin (ω-hydroxyceramid). Některé ω-hydroxyceramidy jsou dále hydrolyzovány na ω-hydroxy-mastné kyseliny [78]. Produkty uvedné metabolické dráhy (ω-hydroxyceramid a ω-hydroxy-mastné kyseliny) jsou pak prostřednictvím transglutaminázy-1 vázány k cytoplazmatické vrstvě zrohovatělé buněčné obálky (viz. níže). Dalšími proteiny hrajícími roli v metobolismu lipidů v epidermis jsou NIPAL4 a CYP4F22. NIPAL4 je pravděpodobně membránový receptor pro další produkty metabolických drah ALOX12B a ALOXE3, pro tzv. hepoxiliny, které hrají roli v mnoha buněčných procesech [78],[79],[80], rovněž se spekuluje o podílu NIPAL4 na fúzi lamelárních tělíšek s plazmatickou membránou [81],[82]. CYP4F22 je součástí široké rodiny cytochromů P450. Tato monooxygenáza pravděpodobně katalyzuje hydroxylaci metabolických produktů hepoxylinu a předpokládá se, že výsledné látky hrají roli v hydrataci kůže. Transglutamináza-1 je odpovědná za vzájemné provázání (croslink) proteinů v cytoplazmatické vrstvě zrohovatělé buněčné obálky a rovněž za tvorbu lipidové obálky, tj. 77 vazbu ω-hydroxyceramidů a ω-hydroxy-mastných kyselin k proteinům zrohovatělé buněčné obálky [83],[84],[85]. TGM1 se tedy podílí na tvorbě zrohovatělé buněčné obálky korneocytu a lipidové obálky korneocytu, které jsou současně strukturami, na podkladě kterých se formují interbuněčné lipidové vrstvy [86]. Pacienti s mutací v genech ABCA12, ALOX12R, ALOXE3, CYP4F22, NIPAL4, TGM1 trpí většinou lamelární ichtyózou nebo kongenitální erytrodermickou ichtyózou. Fenotypové projevy LI a CIE se ale mohou vzájemně překrývat a nebyly nalezeny ani silnější korelace mezi genotypem a fenotypem. Postižené děti se často rodí obaleny tzv. koloidní mebránou. Poté co se koloidní membrana sloupne (během prvních týdnů života), projeví se šupinatění kůže, které se u jednotlivých pacientů odlišuje rozsahem, barvou a stupněm přilnavosti. Spektrum klinického obrazu je v rozmezí od jemných, bílých šupin na erytrodermické kůži (CIE) po tmavé, velké šupiny s téměř neviditelnou kožní erytrodermií (LI). Dalšími klinickými projevy mohou být alopecie, hyperkeratóza, hyperlinearita dlaní a plosek nohou, postižení nehtů, hypohydróza, netolerance k teplu. Navíc se fenotypy mohou měnit v průběhu času a v odpovědi na léčbu [87]. Klinicky mohou být rozlišovány další minoritní subtypy ARCI. X-vázaná ichtyóza je spojena s defekty genu STS [68] a s abnormální akumulací cholesterolsulfátu ve SC. Steroidní sulfatáza je koncentrována v lamelárních tělískách a sekretována do intercelulárního prostoru SC spolu s dalšími lipidovými hydrolázami [88]. V intercelulárním prostoru STS degraduje cholesterolsulfát a vytváří cholesterol. Progresivní úbytek cholesterolsulfátu umožňuje degradaci korneodesmosomu a normální odlupování kůže [88]. Deficit STS vede k malformaci interbuněčných lipidových vrstev a omezuje degradaci korneodesmozomu, což má za následek zadržování korneocytů a následnou hyperkeratózu [88]. Keratin1 a keratin 10 jsou strukturní proteiny vytvářející intermediární filamenta epiteliálních buněk. Mutace v genech KRT1 a KRT10 způsobují bulózní kongenitální erytrodermickou ichtyózu [89],[90],[66]. BCIE má autosomálně dominantní model dědičnosti. Většina kauzálních mutací je typu missense a jsou lokalizovány na začátku nebo na konci alfa-helikální tyčinkové domény, tzv. helix initiation and helix termination peptide (viz. epidermolysis bullosa simplex). BCIE je typ ichtyózy, který se vyznačuje vznikem puchýřů na erytrodermickém podkladě. Po perinatálním období, tvorba puchýřů 78 ustupuje a je patrná generalizovaná hyperkeratóza. Podobný, ale mírnější průběh má BCIE způsobená mutacemi v genu KRT2 [67],[91], [92]. V granulární vrstvě epidermis se vytvářejí keratohyalinní granula obsahující velký polyprotein profilaggrin (>400 kDa). N-terminální doména profilaggrinu hraje roli během terminální epidermální diferenciace, kdy je odštěpena a transportována do jádra, kde se podílí na enukleaci keratinocytu ve SC. Přesná funkce C-terminální domény nejí známa, ale zřejmě bude souviset s metabolismem profilaggrinu. Profilaggrin obsahuje 10-12 téměř identických filaggrinových repetic (každá o velikosti 324 aminokyselin). V průběhu terminální diferenciace keratinocytu je profilaggrin v SC štěpen na 10-12 filaggrinových peptidů, které následně agregují s keratinovými filamenty. V důsledku těchto pochodů korneocyt získává zpolštěný tvar. Filaggrin dále degraduje na jednotlivé aminokyseliny. Histidin, aminokyselina vyskytující se ve filaggrinu s vysokou frekvencí, je metabolizován na trans-urokanovou kyselinu a ta společně s dalšími organickými kyselinami pomáhá udržovat kyselé pH vrchní vrstvy kůže, což je důležité pro funkční aktivitu řady enzymů [93],[94]. Gen FLG kódující profilaggrin má velikost 23 kb, cDNA tohoto genu je rozložena do 3 exonů. Exon 3 je velmi těžké analyzovat z důvodu jeho velikosti a vysoce repetitivní povahy (obsahuje 10-12 repeticí, velikost jedné repetice je 1.2 kb) [95] . Ichtyóza vulgaris je autozomálně semidominantní onemocnění s nekompletní penetrancí a variabilní expresivitou, klinické projevy jsou velmi různé i v rámci rodiny. Jedinci se dvěma mutacemi v genu FLG mají závažnější klinické projevy než s jednou mutací. IV se projevuje v časném dětství, progreduje do puberty, pak je většinou tendence ke zlepšování klinických projevů. Onemocnění je charakterizováno jemnými, mírně adherentními šupinami, bílé nebo šedé barvy, závažnost klinických příznaků je závislá i na prostředí. Často se vyskytuje hyperlinearita dlaní plosek nohou. V CMBGT jsme začali s molekulárně genetickou diagnostikou ichtyóz v roce 2013 a postupně jsme zavedli analýzu genů ALOX12B, ALOXE3, TGM1, NIPAL4, CYP4F22 (autosomálně recesivní kongenitální ichtyózy); STS (X-vázaná ichtyóza); FLG (ichtyóza vulgáris). V současné době máme 41 nepříbuzných pacientů s identifikovanými kauzálními mutacemi: 10 pacientů má mutace v ALOX12B (27,7%), 5 pacientů v ALOXE3 (13,8%), 4 pacienti v NIPAL4 (11,1%), 4 pacienti v CYP4F22 (11,1%) a 2 pacienti v TGM1 (5,6%) genech. Mutace v genu STS spojené s XLI byly zjištěny u 6 pacientů (11,1%) a mutace v genu FLG spojené s IV u 9 pacientů (19,4%). Vzhledem k tomu, že řada mutací identifikovaných u českých pacientů je nová, v literatuře nepopsaná, provádíme v současné 79 době podrobnou analýzu korelace genetických, klinických a patologických nálezů. Výsledky získané na základě interdisciplinární spolupráce mezi molekulárními biology, dermatology a patology jsou velmi hodnotné a zatím nebylo publikováno mnoho prací zabývajících se touto problematikou v oblasti ichtyóz. Doposud bylo popsáno 10 rozdílných typů mutací v genu NIPAL4. My jsme v souboru našich pacientů našli 5 typů mutací, z toho 4 nové, včetně delecí a duplikací, které ještě v genu NIPAL4 nebyly u žádné populace identifikovány, podobná situace je i v případě genu CYP4F22. Věříme, že výsledky získané u našeho souboru pacientů významně přispějí k rozšíření dosavadních znalostí v této oblasti. 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 4 Dědičné metabolické nemoci V této části habilitační práce jsou prezentovány publikace týkající se familiální hypercholesterolémie, hyperfenylalaninémie a kongenitální adrenální hyperplazie. Ve všech případech se jedná o závažná onemocnění, u nichž včasná intervence umožňuje účinné blokování rozvinutí asociovaných klinických příznaků. Pro všechny uvedené nemoci je CMBGT jediným pracovištěm v ČR, které provádí jejich molekulárně genetickou diagnostiku. Problematice metabolických nemocí se L. Fajkusová věnuje od roku 2007, po tragické smrti kolegy Libora Kozáka. Výsledky molekulárně genetické diagnostiky familiální hypercholesterolémie (FH) jsou prezentovány ve dvou publikacích [Atherosclerosis. 2012 Aug;223(2) a Atherosclerosis. 2011 May;216(1)]. V publikaci „Genomic characterization of large rearrangements of the LDLR gene in Czech patients with familial hypercholesterolemia“ [BMC Med Genet. 2010 Jul 27;11] jsou charakterizovány body zlomu u 8 rozsáhlých genových delecí/duplikací identifikovaných v genu pro LDL receptor (LDLR). Výsledky ukázaly, že 6 přeuspořádání je výsledkem nealelické homologní rekombinace (nonallelic homologous recombination, NAHR) mezi Alu sekvencemi a 2 přeuspořádání jsou výsledkem nehomologního spojování konců (nonhomologous end joining, NHEJ). Naše práce jako první popisuje NHEJ jako mechanismus vzniku delecí/duplikací v genu LDLR. Výsledky molekulárně genetické diagnostiky hyperfenylalaninémie (HPA) jsou shrnuty v práci „Hyperphenylalaninemia in the Czech Republic: genotype-phenotype correlations and in silico analysis of novel missense mutations“ [Clin Chim Acta. 2013 Apr 18;419]. Kromě spektra mutací identifikovaných u pacientů s HPA a jejich klinických projevů, jsou provedeny i podrobné in silico analýzy zjištěných missense mutací a korelace výsledků těchto analýz s klinickou závažností dané mutace. V případě kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) jsou prezentovány dvě práce [Eur J Med Genet. 2011 Mar-Apr;54(2) a Int J Mol Med. 2010 Oct;26(4)], které jednak shrnují výsledky molekulárně genetických analýz a korelace zjištěných genetických a klinických nálezů a dále identifikují nové typy chimérních genů vzniklých rekombinací mezi genem CYP21A2 a pseudogenem CYP21A1P. 95 Publikace 1) The molecular basis of familial hypercholesterolemia in the Czech Republic: spectrum of LDLR mutations and genotype-phenotype correlations. Tichý L, Freiberger T, Zapletalová P, Soška V, Ravčuková B, Fajkusová L. Atherosclerosis. 2012 Aug;223(2):401-8. (L. Fajkusová jako korespodující autor) 2) An APEX-based genotyping microarray for the screening of 168 mutations associated with familial hypercholesterolemia. Dušková L, Kopečková L, Jansová E, Tichý L, Freiberger T, Zapletalová P, Soška V, Ravčuková B, Fajkusová L. Atherosclerosis. 2011 May;216(1):139-45. (L. Fajkusová jako korespondující autor) 3) Genomic characterization of large rearrangements of the LDLR gene in Czech patients with familial hypercholesterolemia. Goldmann R, Tichý L, Freiberger T, Zapletalová P, Letocha O, Soska V, Fajkus J, Fajkusová L. BMC Med Genet. 2010 Jul 27;11:115. (L. Fajkusová jako korespondující autor) 4) Hyperphenylalaninemia in the Czech Republic: genotype-phenotype correlations and in silico analysis of novel missense mutations. Réblová K, Hrubá Z, Procházková D, Pazdírková R, Pouchlá S, Zeman J, Fajkusová L. Clin Chim Acta. 2013 Apr 18;419:1- 10.(L. Fajkusová jako korespondující autor) 5) Chimeric CYP21A1P/CYP21A2 genes identified in Czech patients with congenital adrenal hyperplasia. Vrzalová Z, Hrubá Z, Hrabincová ES, Vrábelová S, Votava F, Koloušková S, Fajkusová L. Eur J Med Genet. 2011 Mar-Apr;54(2):112-7. (L. Fajkusová jako korespondující autor) 6) Identification of CYP21A2 mutant alleles in Czech patients with 21-hydroxylase deficiency. Vrzalová Z, Hrubá Z, St'ahlová Hrabincová E, Pouchlá S, Votava F, Kolousková S, Fajkusová L. Int J Mol Med. 2010 Oct;26(4):595-603. (L. Fajkusová jako korespondující autor) 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 5 Závěr Habilitační práce předložená formou komentovaného souboru publikací se věnuje molekulárně genetické diagnostice dědičných nemocí. Uvedené výsledky byly získány v Centru molekulární biologie a genové terapie IHOK LF MU a Fakultní nemocnice Brno, výsledky před rokem 2002 ve Výzkumném ústavu zdraví dítětě. V současné době se v Sekci vrozených genetických chorob CMBGT provádí standardně 44 genetických vyšetření, z toho 30 unikátně v rámci ČR. Kromě standardních metod DNA diagnostiky (PCR, klasická sekvenační analýza, fragmentační analýza, kvantitativní PCR) jsou do diagnostické praxe zavedeny i techniky jako pulzní gelová elektroforéza spojená se Southern blotem a hybridizací, amplikonové sekvenování nové generace nebo sequence capture a cílené re-sekvenování. S rozvojem technik sekvenování nové generace stale aktuálněji vyvstává potřeba ověření kauzality identifikovaných mutací. Jednou z možností jak zjistit, jestli nalezená mutace souvisí s nemocí, je její analýza in silico přístupy jako jsou predikční programy (Polyphen- 2, SIFT,SNPs3D and FOLDX) a molekulární modelování na základě známých krystalových struktur. Další možností je pak exprese mutantních proteinů a následná analýza jejich funkce. I tyto metodiky jsou na pracovišti rozvíjeny, protože spolu s výsledky klinickými, biochemickými, patologickými vytvářejí komplexní obraz o dané nemoci a její molekulární podstatě. Poznatky a zkušenosti z oblasti výzkumu a diagnostiky vrozených poruch jsou využívány rovněž v teoretické i praktické výuce na Masarykově universitě, především v rámci semestrálního kurzu Molekulární diagnostika dědičných nemocí, a jsou předmětem závěrečných prací studentů magisterských a doktorských studijních programů. Publikace uvedené v habilitační práci prezentují výsledky získané analýzou DNA/mRNA genů asociovaných s daným typem nemoci a korelace těchto výsledků s klinickými, biochemickými a patologickými nálezy. Vzhledem k tomu, že molekulárně genetická diagnostika těchto nemocí se provádí v CMBGT jako v jediné laboratoři v rámci ČR, výsledky mapují mutační spektrum a frekvenci výskytu jednotlivých typů mutací v České republice. Zjištěné genotypy a asociované fenotypy jsou prezentovány i v mezinárodních databázích mutací a přispívají tak k utvoření celkového obrazu o složitosti dané nemoci. 144 6 Použitá literatura 1. Kissel JT (1999) Facioscapulohumeral dystrophy. Seminars in Neurology 19: 35-43. 2. van Deutekom JCT, Wijmenga C, Vantienhoven EAE, Gruter AM, Frants RR, et al. (1993) Fshd Associated DNA Rearrangements Are Due to Deletions of Integral Copies of a 3.2 Kb Tandemly Repeated Unit. Human Molecular Genetics 2: 2037-2042. 3. Gilbert JR, Stajich JM, Wall S, Carter SC, Qiu H, et al. (1993) Evidence for Heterogeneity in Facioscapulohumeral Muscular-Dystrophy (Fshd). American Journal of Human Genetics 53: 401-408. 4. Gabriels J, Beckers MC, Ding H, De Vriese A, Plaisance S, et al. (1999) Nucleotide sequence of the partially deleted D4Z4 locus in a patient with FSHD identifies a putative gene within each 3.3 kb element. Gene 236: 25-32. 5. Lyle R, Wright TJ, Clark LN, Hewitt JE (1995) Fshd-Associated Repeat, D4z4, Is a Member of a Dispersed Family of Homeobox-Containing Repeats, Subsets of Which Are Clustered on the Short Arms of the Acrocentric Chromosomes. Genomics 28: 389-397. 6. Tupler R, Berardinelli A, Barbierato L, Frants R, Hewitt JE, et al. (1996) Monosomy of distal 4q does not cause facioscapulohumeral muscular dystrophy. Journal of Medical Genetics 33: 366-370. 7. Lemmers RJLF, de Kievit P, Sandkuijl L, Padberg GW, van Ommen GJB, et al. (2002) Facioscapulohumeral muscular dystrophy is uniquely associated with one of the two variants of the 4q subtelomere. Nature Genetics 32: 235-236. 8. de Greef JC, Frants RR, van der Maarel SM (2008) Epigenetic mechanisms of facioscapulohumeral muscular dystrophy. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 647: 94-102. 9. Bickmore WA, van der Maarel SM (2003) Perturbations of chromatin structure in human genetic disease: recent advances. Human Molecular Genetics 12: R207-R213. 10. Gabellini D, Green MR, Tupler R (2002) Inappropriate gene activation in FSHD: A repressor complex binds a chromosomal repeat deleted in dystrophic muscle. Cell 110: 339-348. 11. Tam R, Smith KP, Lawrence JB (2004) The 4q subtelomere harboring the FSHD locus is specifically anchored with peripheral heterochromatin unlike most human telomeres. Journal of Cell Biology 167: 269-279. 12. van Geel M, Dickson MC, Beck AF, Bolland DJ, Frants RR, et al. (2002) Genomic analysis of human chromosome 10q and 4q telomeres suggests a common origin. Genomics 79: 210-217. 13. van Overveld PGM, Lemmers RJFL, Sandkuijl LA, Enthoven L, Winokur ST, et al. (2003) Hypomethylation of D4Z4 in 4q-linked and non-4q-linked facioscapulohumeral muscular dystrophy. Nature Genetics 35: 315-317. 14. Jiang GC, Yang F, van Overveld PGM, Vedanarayanan V, van der Maarel S, et al. (2003) Testing the position-effect variegation hypothesis for facioscapulohumeral muscular dystrophy by analysis of histone modification and gene expression in subtelomeric 4q. Human Molecular Genetics 12: 2909-2921. 15. Yang F, Shao CB, Vedanarayanan V, Ehrlich M (2004) Cytogenetic and immunoFISH analysis of the 4q subtelomeric region, which is associated with facioscapulohumeral muscular dystrophy. Chromosoma 112: 350-359. 16. Deschamps J, Meijlink F (1992) Mammalian homeobox genes in normal development and neoplasia. Crit Rev Oncog 3: 117-173. 17. Dixit M, Ansseau E, Tassin A, Winokur S, Shi R, et al. (2007) DUX4, a candidate gene of facioscapulohumeral muscular dystrophy, encodes a transcriptional activator of 145 PITX1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104: 18157-18162. 18. Kowaljow V, Marcowycz A, Ansseau E, Conde CB, Sauvage S, et al. (2007) The DUX4 gene at the FSHDIA locus encodes a pro-apoptotic protein. Neuromuscular Disorders 17: 611-623. 19. Gabellini D, D'Antona G, Moggio M, Prelle A, Zecca C, et al. (2006) Facioscapulohumeral muscular dystrophy in mice overexpressing FRG1. Nature 439: 973- 977. 20. Osborne RJ, Welle S, Venance SL, Thornton CA, Tawil R (2007) Expression profile of FSHD supports a link between retinal vasculopathy and muscular dystrophy. Neurology 68: 569-577. 21. Laoudj-Chenivesse D, Carnac G, Bisbal C, Hugon G, Bouillot S, et al. (2005) Increased levels of adenine nucleotide translocator 1 protein and response to oxidative stress are early events in facioscapulohumeral muscular dystrophy muscle. Journal of Molecular Medicine-Jmm 83: 216-224. 22. Deak KL, Lemmers RJLF, Stajich JM, Klooster R, Tawil R, et al. (2007) Genotypephenotype study in an FSHD family with a proximal deletion encompassing p13E-11 and D4Z4. Neurology 68: 578-582. 23. Lemmers RJLF, Osborn M, Haaf T, Rogers M, Frants RR, et al. (2003) D4F104S1 deletion in facioscapulohumeral muscular dystrophy - Phenotype, size, and detection. Neurology 61: 178-183. 24. Cabianca DS, Casa V, Bodega B, Xynos A, Ginelli E, et al. (2012) A Long ncRNA Links Copy Number Variation to a Polycomb/Trithorax Epigenetic Switch in FSHD Muscular Dystrophy. Cell 149. 25. Cabianca DS, Casa V, Gabellini D (2012) A novel molecular mechanism in human genetic disease A DNA repeat-derived lncRNA. Rna Biology 9: 1211-1217. 26. Lemmers RJ, Tawil R, Petek LM, Balog J, Block GJ, et al. (2012) Digenic inheritance of an SMCHD1 mutation and an FSHD-permissive D4Z4 allele causes facioscapulohumeral muscular dystrophy type 2. Nature Genetics 44: 1370-1374. 27. Jones TI, Chen JC, Rahimov F, Homma S, Arashiro P, et al. (2012) Facioscapulohumeral muscular dystrophy family studies of DUX4 expression: evidence for disease modifiers and a quantitative model of pathogenesis. Human Molecular Genetics 21: 4419-4430. 28. Stadler G, Rahimov F, King OD, Chen JC, Robin JD, et al. (2013) Telomere position effect regulates DUX4 in human facioscapulohumeral muscular dystrophy. Nat Struct Mol Biol 20: 671-678. 29. Zubrzycka-Gaarn EE, Bulman DE, Karpati G, Burghes AH, Belfall B, et al. (1988) The Duchenne muscular dystrophy gene product is localized in sarcolemma of human skeletal muscle. Nature 333: 466-469. 30. Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, Monaco AP, Feener C, et al. (1987) Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell 50: 509-517. 31. Monaco AP, Kunkel LM (1988) Cloning of the Duchenne/Becker muscular dystrophy locus. Adv Hum Genet 17: 61-98. 32. Guglieri M, Magri F, D'Angelo MG, Prelle A, Morandi L, et al. (2008) Clinical, molecular, and protein correlations in a large sample of genetically diagnosed Italian limb girdle muscular dystrophy patients. Hum Mutat 29: 258-266. 33. Fanin M, Nascimbeni AC, Aurino S, Tasca E, Pegoraro E, et al. (2009) Frequency of LGMD gene mutations in Italian patients with distinct clinical phenotypes. Neurology 72: 1432-1435. 146 34. van der Kooi AJ, Frankhuizen WS, Barth PG, Howeler CJ, Padberg GW, et al. (2007) Limb-girdle muscular dystrophy in the Netherlands: gene defect identified in half the families. Neurology 68: 2125-2128. 35. Richard I, Broux O, Allamand V, Fougerousse F, Chiannilkulchai N, et al. (1995) Mutations in the proteolytic enzyme calpain 3 cause limb-girdle muscular dystrophy type 2A. Cell 81: 27-40. 36. Brockington M, Blake DJ, Prandini P, Brown SC, Torelli S, et al. (2001) Mutations in the fukutin-related protein gene (FKRP) cause a form of congenital muscular dystrophy with secondary laminin alpha2 deficiency and abnormal glycosylation of alphadystroglycan. Am J Hum Genet 69: 1198-1209. 37. Frosk P, Weiler T, Nylen E, Sudha T, Greenberg CR, et al. (2002) Limb-girdle muscular dystrophy type 2H associated with mutation in TRIM32, a putative E3-ubiquitinligase gene. Am J Hum Genet 70: 663-672. 38. Kirschner J, Lochmuller H (2011) Sarcoglycanopathies. Handb Clin Neurol 101: 41- 46. 39. Liu J, Aoki M, Illa I, Wu C, Fardeau M, et al. (1998) Dysferlin, a novel skeletal muscle gene, is mutated in Miyoshi myopathy and limb girdle muscular dystrophy. Nat Genet 20: 31-36. 40. Haravuori H, Vihola A, Straub V, Auranen M, Richard I, et al. (2001) Secondary calpain3 deficiency in 2q-linked muscular dystrophy: titin is the candidate gene. Neurology 56: 869-877. 41. Sarkozy A, Hicks D, Hudson J, Laval SH, Barresi R, et al. (2013) ANO5 gene analysis in a large cohort of patients with anoctaminopathy: confirmation of male prevalence and high occurrence of the common exon 5 gene mutation. Hum Mutat 34: 1111-1118. 42. Christiano AM, Hoffman GG, Chung-Honet LC, Lee S, Cheng W, et al. (1994) Structural organization of the human type VII collagen gene (COL7A1), composed of more exons than any previously characterized gene. Genomics 21: 169-179. 43. Fine JD, Eady RA, Bauer EA, Bauer JW, Bruckner-Tuderman L, et al. (2008) The classification of inherited epidermolysis bullosa (EB): Report of the Third International Consensus Meeting on Diagnosis and Classification of EB. J Am Acad Dermatol 58: 931- 950. 44. Dang N, Murrell DF (2008) Mutation analysis and characterization of COL7A1 mutations in dystrophic epidermolysis bullosa. Exp Dermatol 17: 553-568. 45. Almaani N, Liu L, Dopping-Hepenstal PJ, Lai-Cheong JE, Wong A, et al. (2011) Identical glycine substitution mutations in type VII collagen may underlie both dominant and recessive forms of dystrophic epidermolysis bullosa. Acta Derm Venereol 91: 262- 266. 46. Burgeson RE (1993) Type VII collagen, anchoring fibrils, and epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol 101: 252-255. 47. Kivirikko KI (1993) Collagens and their abnormalities in a wide spectrum of diseases. Ann Med 25: 113-126. 48. Persikov AV, Pillitteri RJ, Amin P, Schwarze U, Byers PH, et al. (2004) Stability related bias in residues replacing glycines within the collagen triple helix (Gly-Xaa-Yaa) in inherited connective tissue disorders. Hum Mutat 24: 330-337. 49. Hovnanian A, Pollack E, Hilal L, Rochat A, Prost C, et al. (1993) A missense mutation in the rod domain of keratin 14 associated with recessive epidermolysis bullosa simplex. Nat Genet 3: 327-332. 147 50. Rugg EL, Morley SM, Smith FJ, Boxer M, Tidman MJ, et al. (1993) Missing links: Weber-Cockayne keratin mutations implicate the L12 linker domain in effective cytoskeleton function. Nat Genet 5: 294-300. 51. Stephens K, Ehrlich P, Weaver M, Le R, Spencer A, et al. (1997) Primers for exonspecific amplification of the KRT5 gene: identification of novel and recurrent mutations in epidermolysis bullosa simplex patients. J Invest Dermatol 108: 349-353. 52. Bolling MC, Lemmink HH, Jansen GH, Jonkman MF (2011) Mutations in KRT5 and KRT14 cause epidermolysis bullosa simplex in 75% of the patients. Br J Dermatol 164: 637-644. 53. Schweizer J, Bowden PE, Coulombe PA, Langbein L, Lane EB, et al. (2006) New consensus nomenclature for mammalian keratins. J Cell Biol 174: 169-174. 54. Fuchs E (1996) The cytoskeleton and disease: genetic disorders of intermediate filaments. Annu Rev Genet 30: 197-231. 55. Herrmann H, Aebi U (2000) Intermediate filaments and their associates: multitalented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. Curr Opin Cell Biol 12: 79-90. 56. Wu KC, Bryan JT, Morasso MI, Jang SI, Lee JH, et al. (2000) Coiled-coil trigger motifs in the 1B and 2B rod domain segments are required for the stability of keratin intermediate filaments. Mol Biol Cell 11: 3539-3558. 57. Huber M, Rettler I, Bernasconi K, Frenk E, Lavrijsen SP, et al. (1995) Mutations of keratinocyte transglutaminase in lamellar ichthyosis. Science 267: 525-528. 58. Russell LJ, DiGiovanna JJ, Rogers GR, Steinert PM, Hashem N, et al. (1995) Mutations in the gene for transglutaminase 1 in autosomal recessive lamellar ichthyosis. Nat Genet 9: 279-283. 59. Lefevre C, Audebert S, Jobard F, Bouadjar B, Lakhdar H, et al. (2003) Mutations in the transporter ABCA12 are associated with lamellar ichthyosis type 2. Hum Mol Genet 12: 2369-2378. 60. Lefevre C, Bouadjar B, Karaduman A, Jobard F, Saker S, et al. (2004) Mutations in ichthyin a new gene on chromosome 5q33 in a new form of autosomal recessive congenital ichthyosis. Hum Mol Genet 13: 2473-2482. 61. Lefevre C, Bouadjar B, Ferrand V, Tadini G, Megarbane A, et al. (2006) Mutations in a new cytochrome P450 gene in lamellar ichthyosis type 3. Hum Mol Genet 15: 767-776. 62. Jobard F, Lefevre C, Karaduman A, Blanchet-Bardon C, Emre S, et al. (2002) Lipoxygenase-3 (ALOXE3) and 12(R)-lipoxygenase (ALOX12B) are mutated in nonbullous congenital ichthyosiform erythroderma (NCIE) linked to chromosome 17p13.1. Hum Mol Genet 11: 107-113. 63. Grall A, Guaguere E, Planchais S, Grond S, Bourrat E, et al. (2012) PNPLA1 mutations cause autosomal recessive congenital ichthyosis in golden retriever dogs and humans. Nat Genet 44: 140-147. 64. Israeli S, Khamaysi Z, Fuchs-Telem D, Nousbeck J, Bergman R, et al. (2011) A mutation in LIPN, encoding epidermal lipase N, causes a late-onset form of autosomalrecessive congenital ichthyosis. Am J Hum Genet 88: 482-487. 65. Eckl KM, Tidhar R, Thiele H, Oji V, Hausser I, et al. (2013) Impaired epidermal ceramide synthesis causes autosomal recessive congenital ichthyosis and reveals the importance of ceramide acyl chain length. J Invest Dermatol 133: 2202-2211. 66. Rothnagel JA, Dominey AM, Dempsey LD, Longley MA, Greenhalgh DA, et al. (1992) Mutations in the rod domains of keratins 1 and 10 in epidermolytic hyperkeratosis. Science 257: 1128-1130. 148 67. Rothnagel JA, Traupe H, Wojcik S, Huber M, Hohl D, et al. (1994) Mutations in the rod domain of keratin 2e in patients with ichthyosis bullosa of Siemens. Nat Genet 7: 485- 490. 68. Webster D, France JT, Shapiro LJ, Weiss R (1978) X-linked ichthyosis due to steroidsulphatase deficiency. Lancet 1: 70-72. 69. Smith FJ, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Sandilands A, Campbell LE, et al. (2006) Loss-of-function mutations in the gene encoding filaggrin cause ichthyosis vulgaris. Nat Genet 38: 337-342. 70. Bouwstra JA, Ponec M (2006) The skin barrier in healthy and diseased state. Biochim Biophys Acta 1758: 2080-2095. 71. Iwai I, Han H, den Hollander L, Svensson S, Ofverstedt LG, et al. (2012) The human skin barrier is organized as stacked bilayers of fully extended ceramides with cholesterol molecules associated with the ceramide sphingoid moiety. J Invest Dermatol 132: 2215- 2225. 72. Masukawa Y, Narita H, Sato H, Naoe A, Kondo N, et al. (2009) Comprehensive quantification of ceramide species in human stratum corneum. J Lipid Res 50: 1708-1719. 73. Meguro S, Arai Y, Masukawa Y, Uie K, Tokimitsu I (2000) Relationship between covalently bound ceramides and transepidermal water loss (TEWL). Arch Dermatol Res 292: 463-468. 74. Akiyama M, Sugiyama-Nakagiri Y, Sakai K, McMillan JR, Goto M, et al. (2005) Mutations in lipid transporter ABCA12 in harlequin ichthyosis and functional recovery by corrective gene transfer. J Clin Invest 115: 1777-1784. 75. Kelsell DP, Norgett EE, Unsworth H, Teh MT, Cullup T, et al. (2005) Mutations in ABCA12 underlie the severe congenital skin disease harlequin ichthyosis. Am J Hum Genet 76: 794-803. 76. Akiyama M, Dale BA, Smith LT, Shimizu H, Holbrook KA (1998) Regional difference in expression of characteristic abnormality of harlequin ichthyosis in affected fetuses. Prenat Diagn 18: 425-436. 77. Akiyama M, Yoneda K, Kim SY, Koyama H, Shimizu H (1996) Cornified cell envelope proteins and keratins are normally distributed in harlequin ichthyosis. J Cutan Pathol 23: 571-575. 78. Zheng Y, Yin H, Boeglin WE, Elias PM, Crumrine D, et al. (2011) Lipoxygenases mediate the effect of essential fatty acid in skin barrier formation: a proposed role in releasing omega-hydroxyceramide for construction of the corneocyte lipid envelope. J Biol Chem 286: 24046-24056. 79. Krieg P, Furstenberger G (2014) The role of lipoxygenases in epidermis. Biochim Biophys Acta 1841: 390-400. 80. Munoz-Garcia A, Thomas CP, Keeney DS, Zheng Y, Brash AR (2014) The importance of the lipoxygenase-hepoxilin pathway in the mammalian epidermal barrier. Biochim Biophys Acta 1841: 401-408. 81. Dahlqvist J, Klar J, Hausser I, Anton-Lamprecht I, Pigg MH, et al. (2007) Congenital ichthyosis: mutations in ichthyin are associated with specific structural abnormalities in the granular layer of epidermis. J Med Genet 44: 615-620. 82. Dahlqvist J, Westermark GT, Vahlquist A, Dahl N (2012) Ichthyin/NIPAL4 localizes to keratins and desmosomes in epidermis and Ichthyin mutations affect epidermal lipid metabolism. Arch Dermatol Res 304: 377-386. 83. Hohl D (1990) Cornified cell envelope. Dermatologica 180: 201-211. 84. Greenberg CS, Birckbichler PJ, Rice RH (1991) Transglutaminases: multifunctional cross-linking enzymes that stabilize tissues. FASEB J 5: 3071-3077. 149 85. Nemes Z, Marekov LN, Fesus L, Steinert PM (1999) A novel function for transglutaminase 1: attachment of long-chain omega-hydroxyceramides to involucrin by ester bond formation. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 8402-8407. 86. Elias PM, Schmuth M, Uchida Y, Rice RH, Behne M, et al. (2002) Basis for the permeability barrier abnormality in lamellar ichthyosis. Exp Dermatol 11: 248-256. 87. Vahlquist A, Ganemo A, Virtanen M (2008) Congenital ichthyosis: an overview of current and emerging therapies. Acta Derm Venereol 88: 4-14. 88. Elias PM, Crumrine D, Rassner U, Hachem JP, Menon GK, et al. (2004) Basis for abnormal desquamation and permeability barrier dysfunction in RXLI. J Invest Dermatol 122: 314-319. 89. Chipev CC, Korge BP, Markova N, Bale SJ, DiGiovanna JJ, et al. (1992) A leucine--- -proline mutation in the H1 subdomain of keratin 1 causes epidermolytic hyperkeratosis. Cell 70: 821-828. 90. Cheng J, Syder AJ, Yu QC, Letai A, Paller AS, et al. (1992) The genetic basis of epidermolytic hyperkeratosis: a disorder of differentiation-specific epidermal keratin genes. Cell 70: 811-819. 91. McLean WH, Morley SM, Lane EB, Eady RA, Griffiths WA, et al. (1994) Ichthyosis bullosa of Siemens--a disease involving keratin 2e. J Invest Dermatol 103: 277-281. 92. Kremer H, Zeeuwen P, McLean WH, Mariman EC, Lane EB, et al. (1994) Ichthyosis bullosa of Siemens is caused by mutations in the keratin 2e gene. J Invest Dermatol 103: 286-289. 93. Sandilands A, Sutherland C, Irvine AD, McLean WH (2009) Filaggrin in the frontline: role in skin barrier function and disease. J Cell Sci 122: 1285-1294. 94. Rawlings AV, Harding CR (2004) Moisturization and skin barrier function. Dermatol Ther 17 Suppl 1: 43-48. 95. Sandilands A, Terron-Kwiatkowski A, Hull PR, O'Regan GM, Clayton TH, et al. (2007) Comprehensive analysis of the gene encoding filaggrin uncovers prevalent and rare mutations in ichthyosis vulgaris and atopic eczema. Nat Genet 39: 650-654.