Diagnostika prionů
Vladislava Růžičková
XVI. ročník kurzu pro učitele 2014, Brno
Diagnostika prionů
Prion (PrPSc-patologická forma prionového proteinu (Pr
Vyznačují se přenositelností z buňky do buňky. Ovlivňují fenotyp buňky, nikoli její genotyp
Výskyt prionu u člověka
mozek
L tonsily
periferní nervy
PRIONÓZY u lidí
- neurodegenerativní změny v mozku astrocytech a v
mikrogliích člověka
Dlouhá inkubační doba (měsíce až roky), pak kóma a smrt.
KURU u etnika Fore na Nové Guineji
Creutzfeldtova-Jakobova nemoc (C J D)
Nová forma vCJD (v 1996) (humánní BSE)
Fatální familiální insomnie (FFI)
Gerstmannův- Strausslerův- Scheinkerův syndrom (GSS)
Není humorální nebo celulární imunologická odezva.
Creutzfeldtova-Jakobova nemoc (C J D)
tvoří 85 % všech prionóz
- Celosvětová incidence 1-2 případy/ milion obyvatel/rok
- věk nad 65 let.
- průměrné trvání nemoci je 8 měsíců.
-85-90 % pacientů umírá do 1 roku od klinické manifestace.
- obě pohlaví jsou postižena stejně.
Výskyt 3 forem CJD
1. sporadická - nejvíce případů (příčina je neznámá)
2. genetická - 10 -15 %,mutace v genu prpn
3. náhodně přenesená - 5 %
Pacienti obvykle umírají na pneumonii
Dva typy CJD dle příznaků
Onemocnění CJD se projevuje ve věku 55 - 70 let.
typickým projevem je rychle postupující demence spojená s poruchami pohybové činnosti, ztrátou paměti a stavy zmätenosti, jako důsledek degenerativních změn v mozku. Proto je většinou rozpoznána až v značně pokročilém stádiu nemoci.
U vCJD jsou charakteristickými znaky:
- raný věk 19-39 let
- psychické projevy - úzkost, deprese,
- nechtěné svalové kontrakce a zhoršená svalová koordinace
- neuropatologické spongiformní změny, ztráta neuronů,
- zbytnění gliové tkáně (patrno v bazálních gangliích a v thalamu)
Diagnostická kriteria WHO pro sCJD z roku 2002
Diagnóza sCJD možná
Rychlý průběh demence (kratší než 2 roky)+ 2 další príznaky:
Myoklonie (záškuby svalů); zrakové/mozečkové projevy a kinetický mutismus (psychicky podmíněná němota)
Diagnóza pravděpodobná
Klinický obraz jako výše uvedeno plus znaky: Přítomnost proteinu 14-3-3 v likvoru
Typické EEG projevy (periodicky se opakující generalizující trifazické nebo polyfazické vlny)
Diagnóza sCJD jistá
Průkaz patogenního prionu v mozkové tkáni
Histologický nález (spongiformní dystrofie, atrofie neuronů a glióza)
Imunohistochemický nález (použití protilátek prokazujících výskyt prionu ve tkáni
Westernův přenos (WB) (specifický průkaz prionu)
Genetické vyšetření (určení polymorfismu kodonu 129 genu Prnp)
Laboratorní diagnostika SE založena na EEG a MR:
U klasické formy CJD je typický nález na EEG (elektroencefalogram)
na MR (magnetická rezortěrí^fe^j^Js j^.I^lr^^^
bazálních ganglií, atrofie
a v likvoru lze prokázat protein 14-3-3
(důkaz westernovým přenosem). \
U variantní formy CJD lze
- priony prokázat v tonzilách, apendixu nebo ve slezině;
- na MR je postižení zejména v thalamu,
- likvor je negativní na protein 14-3-3.
- EEG typický pro CJD chybí.
LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA:
Neurohistopatologie - vzorky z pitevního materiálu spongiformní změny (opticky prázdné prostory - vzhled mycí houby), úbytek neuronů a zmnožení astrocytů (astrocytózu) amyloidní plaky.
Degenerace mozkové tkáně při CJD.
Mikroskopická detekce
V první fázi se v mozkové tkáni tvoří vakuoly (díry) 5-20 mm velké, spongiformní změny (opticky prázdné prostory - vzhled mycí houby), úbytek neuronů a zmnožení astrocytů (astrocytózu).
V závěrečné fázi (spodní obrázek) jsou vakuoly velké 5-70 mm.
http://www.osel. cz/index.php?clanek=1004
Imunohistochemie - přímá detekce PrPSc ve tkáni
Obecný protokol
• odběr a fixace tkáně
• krájení a napínání histologických
v o
rezu
• optimalizace prezentace antigénu
• vazba primární protilátky
• detekční systém
protilátka j-^W značená kovem Vf^ nebo y_ fluoresceinem
Rez
http://www. abcam. com/prion-protein-prp-antibody-ab6664. html
štěpení proteinázou K
přidání pufru k natrávenému vzorku        vizuální        a PC detekce prionu
Prionics-Check LIA test -detekce PrPSc
1. SAMPLING + HOMOGENIZATION
45 sec
Obex 2. DIGESTION
Brainstem I
+50fil Digestion Solution
a. PREINCUBATION
+
+ 150(.il Assay Buffer
PrioCLIP™
proužek membrány s navázanými protilátkami anti PrPSc
60 min
4. DETECTION
20 min
Digested homo Renate
Capture antibody
Control antibody
IS min
+
0
Pre intubated (3S^    homo senate
+S0 llI Conjugate
AP (o-npp)
Negative  Initially reactive/ positive
homogenát    OOq° O + normálního °09,Qp?0 mozku
PrPc
PrPsc
Cyklická amplifikace prionového proteinu
(PMCA)
Detekce WB
h 37°C
Itrazvuk
- 37°C
Itrazvuk
Molekulární diagnostika prionů
Genetické vyšetření familiálních SE.
U Familiální CJD lze diagnostikovat inzert 144 bp v genu Prnp (6 repeticí) u kodonu 53
1	50            90 102   ala , 5xR       pro • •		178 198 asp phe	210 val	2
!    i Mil		i -1			i-
CJD
oktapeptidové repetice PHGGGWGQ
253
Genetická analýza mutací v genu prpn u familiálních SE
Spontánní mutace se dědí jako dominantní autozomální znak
přenášený mendelisticky
129 11T m et 102 ala pro
102    ala  , 178
1 5*r pro * asp
i i  mm/-] I j l
c,,hotlt„^t,or   leu      ▼ val asn
200 glu
232 met
198 phe
210 val
£ 5 3
substituce T za C  LEU    ' val    asn ser*
val j\ i lys
Alys arg Ij I J
gss ffi       cxjo (;ss
(1í9 (139 met) val)
Pokusy na zvířatech
Další vyšetřovací metodou pro detekci prionů je očkování laboratorních hlodavců domnělým infekčním materiálem
Výskyt prionóz v CR
FFI (celosvětově asi 8 - 10 případů, v ČR žádný případ)
GSSS (5ti-letý průběh) v ČR jedna rodina, u níž nebylo provedeno genetické vyšetření.
CJD (dědičné případy známo asi 20) rodokmeny v oblastech na severozápadním Slovensku (Kysuce a na Oravě s přesahem na severovýchodní část Moravy a na jižním Slovensku s přesahem do Maďarska.
vCJD - většina obětí cca 200 případů tvořili Britové.
CJD	2002	2003	2004	2005	2006
Genetická	2	3	0	1	0
Sporadická	5	8	11	9	11
Celkem	7	11	11	10	11