Diagnostika retroviru Lentiviry - HIV Vladislava Růžičková VI. Třída RNA-viry se zpětnou transkriptázou - RT Čeleď: Retroviridae (hostitelé: Obratlovci) Rody: ^ Alpharetrovirus ^^^^^^^^ I ^^^^^^ Gammaretrovirus Jednoduché onkogenní retroviry Deltaretrovirus Epsilonretrovirus ^^^^^^^ Lentivirus Human immunodeficiency virus 1 Spumavirus Izolát z opic - nepatogenní Původ HIV- přenos z opic na člověka Důkaz: shoda v sekvencích humánního HIV a SIV Vzplanutí pandemie AIDS v 1. polovině 70 let současně v USA a Střední Africe Centra pandemie HIV ■T Průběh infekce HIV Počet Th-lymfocytů Akutní AIDS infekce 4-8 2-12 let 2-4 roky týdnů Vyšetření na HIV-1 Děti • první vyšetření - během 48 hodin po narození dále - za 2 týdny života - za 4 až 6 týdnů života - za 4 až 6 měsíců života | /■.^^K- i • Dospělý pacient - sérologické vyšetření opakované za 2 - 3 týdny po pozitivním jestu na virus HIV. Diagnostika HIV- vyšetřovaný materiál Krev plasma (sérum) moc Odběr vzorků a kultivace retroviru HIV-1 viriony rychle odumírají Zpracování plasmy během 6 hodin po odběru. Úchova vzorku po oddělení plasmy a buněk při 4° C 24 - 30 hod. nebo déle při -80 °C Inkubace mononukleárních krevních buněk pacienta s buňkami HlV-negativního jedince. Supernatant ze směsného vzorku je testován na přítomnost antigénu p24 (CA/gag). Pozitivní „kultura" je znovu testovaná po 1 měsíci. Sledované markery - proteiny HIV Genom = RNA 11 kb Diagnostika HIV- metody Detekce přítomnosti: - protilátek proti antigenům HIV, - RNA/DNA Sérologické metody - standard v diagnostice HIV enzymoimunologická metoda ELISAtest (využití polyklonálních a nebo monoklonálních protilátek). Molekulární metody 1. průkaz vertikálního přenosu (z matky na dítě) 2. monitorování dávky viru u pacienta (během léčby). 3. molekulární epidemiologie výskytu typů kmenů HIV-1 Studium evoluce HIV - oblast výzkumu ELISA test 'OOO oooo OOO HIV antigen ft-* Pozitivní výsledek ověřit Westernovým přenosem detekce gp160, gp41 a p24. OOOOO OOOO HIV antigen přichycený k matrici serum pacienta s anti HIV protilátka anti HU navázaná na peroxidázu se připojí k anti HIV přidání peroxidu a fenyl diaminu katalyzujícího přítomnost antiHIV 4 s barevná reakce vyhodnocena spektrofotometricky Westernový přenos (WB) gpi60 gpi20 p66 p55 p51 elektroforetická separace směsi HIV antigénu gp41 p31 p24 p17 přenos na nitrocelulóžovou membránu nádobka se sérem pacienta (inkubace) nitrocelulózový filtrační papír s HIV antigény (proužky neviditelné) konjugát HIV/antiHIV/enzym (AP) HIV protilátka HIV antigen 8-8 inkubace proužku se substrátem (fenylfosfát) odečet barevného signálu u pozitivního vzorku pacienta Molekulární analýza genomu viru •Detekce cílových oblastí genomu a charakterizace genomu •Typizace a stanovení příbuznosti kmenů HIV • Stanovení nukleotidového složení genomu RNA viry jsou mnohem citlivější k mutacím než DNA viry. DŮVOD = RNA-polymerázy nemají 3' - 5' exonukleázovou aktivitu nemohou opravovat chyby vzniklé při replikaci. Izolace RNA Zajištění ochrany RNA před rozkladem RNázou. Nejčastěji se jako inhibitor RNázy používá guanidin thiokyanát (GTC). Úchova RNA o velikosti větší než 1 kb v etanolu při nízkých teplotách. Manipulace s RNA ledová lázeň, za aseptických podmínek. Krev lýze buněčného materiálu I sražené nukleové kyseliny a nanášení na kolonku od středě U pro mývaní enzymové odstranění nežádoucí nukleové kyseliny odstředění ^-í---▼ vymytí nukleové kyseliny od střed ěi roztok čisté nukleové kyseliny MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÉ METODY v diagnostice HIV Techniky založené na detekci RNA/DNA 1. PCR - amplifikace specifických sekvencí 2. RT-PCR pro analýzu polymorfismů nukleové kyseliny 3. PCR v reálném čase (Real time PCR) 4. Hybridizační metoda bDNA (branched Chain DNA) 5. Analýza pohyblivosti heteroduplexů (HMA) 6. Sekvenování a analýza virového genomu Deoxyribonukleozid trifosfáty PCR-polymerázová řetězová reakce á DNi O Matricová DNA 3 dCTP JL dGTP JL dTTP JL dATP JL Pufr + MgCl2 ^ • Taq polymeráza Denaturace DNA při 94 - 95 °C/1 - 5 min připojeni pnmeru ňnnftffWfttfttBK Taq polymeráza prodlužuje komplementární DNA řetězce ^ S 1 2 3 Zpětná transkripce (RT-PCR) a hybridizace 1. izolace RNA z krevní plazmy pacienta 2. RT- PCR 3. Amplifikace cDNA 4. detekce - hodnocení RT+PCR odečet absorbance ■V, biotin-dUTP- cDNA a amplikony denaturace a hybridizace zastavení reakce promytí a přidání konjugátu Avidin-HRP substrát H202+ TMB flSJJ, 6fcJ| EK3A/ promytí II Av-HRP \ ^^v-HRP 1= FĎ'^i Bj^ TMB-tetrametylbenzidin Real-time PCR - Technologie TaqMan • kvantitativní analýza cDNA • množství amplifikované cDNA je detekováno intenzitou fluorescenčního záření v reálném čase během každého cyklu reakce • metoda umožňuje rychlou detekci konkrétního genu a stanovení množství amplikonu ve vzorku Hybridizační metoda (bDNA) Versant HIV-1 RNA Assay (Bayer,Tarrytown, NY) Komerčně dostupné kity na detekci HIV-1 Producent Název metoda cílový gen skupina Roche Group M: A-H Diagnostics Amplicor HIV-1 Monitor RT-PCR gag COBAS Amplicor HIV-1 Monitor RT-PCR gag Group M: A-H COBAS AmpliPrep/COBAS Group M: A-H Amplicor HIV-1 Monitor RT-PCR gag COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test RT-PCR gag Group M: A-H Bayer branched Healthcare Versant HIV-1 RNA (bDNA) DNA pol Group M: A-H Abbott LCx HIV RNA Quantitative competetive pol Group M: A-G Laboratories Assay RT-PCR (integr) Group 0 Abbott pol Group M: A-G Laboratories RealTime HIV-1 Assay RT-PCR (integr) Group 0 COBAS - comprehensive bioanalytical systems (jsou robotické systémy) ANALÝZA POHYBLIVOSTI HETERODUPLEXŮ (H M A) Metoda: 1. PCR amplifikace cílové sekvence 2. Elektroforéza- separace PCR produktů 3. Hodnocení: v agarózovém gelu se směs nedenaturovaných heteroduplexů i homoduplexů pohybuje stejnou rychlostí a zastaví se v jedné pozici, v polyakrylamidovém gelu se heteroduplexy obsahující výdutě způsobené delecí nukleotidů pohybují pomaleji než homoduplexy provirová DNA izolovaná z mononukleárních buněk pacienta 11111111111111111111111111111111 ................................ amplifikace sekvencí variabilní oblasti DNA produkty PCR 2,5% agarózový gel homoduplex heteroduplex 5% polyakrylamidový gel heteroduplexy homoduplex STANOVENÍ PŘÍBUZNOSTI KMENŮ HIV METODOU (HMA) standardní kmen provirová DNA izolovaná z pacientů B iiiimiiiiiiiiiiiiiiiiimimi ■■■■■■■■■■...................... m i mim imunními m n m ................................ mmiimiiiiiiiimiiiiiiiiiiiiii ................................ amplifikace s použitím stejných primerů produkty PCR produkty PCR produkty PCR (0,5 - 1,0 kbp) vytvoření směs amplikonů A+B a A+C A + B elektroforéza v neutrálním 5% polyakrylamidovém gelu denaturace a hybridizace A + C heteroduplexy A + B homoduplex heteroduplexy A + C homo SEKVENOVÁNÍ GENOMŮ U RNA genomů se použitím RT nejprve přepíše do DNA Klasická je Sangerova metoda s terminačními ddNTP 1984 poprvé sekvenování genomu HIV SEKVENOVÁNÍ PCR PRODUKTU PCR + sekvenování - pro úseky (1 kb). Nejčastěji jsou to geny pro Ag epitopy povrchových proteinů. Význam: pro epidemiologii a výzkum evoluce HIV Sangerova metoda sekvenování DNA Připojení značeného primem k matricové DNA DHA-pol. dNTP ddATP DNA-pol. dNTP ddGTP DNA-pol. dNTP ddTTP DNA-pol. dNTP ddCTP Z- ".A. .a. A. 13 3 1:13 T GATT C »3 A GC CGTGATTCG QOCGTGATTC GOCGTGATT GCCGTGA, GCCGTG OOCGT GCCG GOC GC = 2= Příbuznost lentivirů - dle sekvenční „homologie" v genech gag a env Skupiny lentiviru rozlišené na základě sekvenční podobnosti IV -1 50% podobnost HIV - 1 roup fi Group O Group jen v Kamerunu jen ve střed. Africe v 2009 u goril I http://www.avert.org/hiv-types.htm -t— cirkulující rekombinantní formy např. A/B Geografická distribuce subtypů skupiny M (HIV-1) celosvětově ■ on EE&CA Východní Evropa Střední Asie LA Latinská Amerika NA Ä ME Afrika Severní střední východní S & SEA Jižní a jihovýchodní Asie WE Západní Evropa SSA Sub- saharská Afrika Případy HIV- pozitivních v ČR Měsíc/Rok- HIV pozitivních AIDS Úmrtí na AIDS ČR/ cizinci/ červen/2008 1120/294 252/22 137/10 květen/2014 2233/384 408/42 209/15 Muži > ženy, homosexuální > heterosexuální jedinci Asi 1/6 tvoří cizinci