Strukturní variabilita genomu a „vzácná“ chromozomová onemocnění Petr Kuglík Ústav experimentální biologie PřF MU v Brně Oddělení lékařské genetiky FN Brno 1956 - 2006 Joe Hin Tjio (1919 - 2001) Tjio, T.H., Levan, A.: The chromosome number of man. Hereditas 42:1, 1956 Člověk má v jádře každé své tělní buňky 23 párů chromozomů, celkem má tedy 46 chromozomů Albert Levan (1905 -1998) 1956 - spočítání lidských chromozomů Počátky klinické cytogenetiky Jerome LeJeune Trizomie 21 - 1959 Cri du chat delece 5p- 1963 (5-40 Mb) 1:10 - až 15 000 dětí Vývoj cytogenetických technik od chromozomů k DNA čipům a NGS 1971 G-pruhování (5 – 10 Mb) 1981 Molekulární cytogenetika FISH (100 kb) 1996 array-CGH (oligo 0,06 kb) 2002 MLPA 50kb 2003 NGS 1bp Od chromozomů k nukleotidům… DNA mikročipy – revoluce v cytogenetice Array CGH: ~1000-krát větší rozlišení než konvenční cytogenetika !!! Tradiční karyotypování 5-10 Mb NA14117 46,XY,del(5)(qter>p14:) Microarray CGH 50-100 kb 2004 – objev CNVs u zdravých jedinců pomocí array-CGH ! Array-CGH a objev nové genomové variability - CNVs – variabilní počet kopií Segmenty DNA vyskytující se v různém počtu kopií Sebat et al 2004 Science 305: 525 Iafrate et al 2004 Nat Genet 36: 949 CNVs v lidském genomu – první informace Variabilní počet kopií (CNVs) - příklady Variabilní počet kopií (CNVs) - segmenty DNA větší než 1 kb přítomné ve variabilním počtu kopií v porovnání s referenčním genomem A copy number variation map of human genome (Database of Genomic Variants (DGV) Zarrei et al. 2015 • cca 100 genes can be completely deleted ! Variabilní počet kopií - význam  CNVs – variabilní počet kopií ovlivňuje 4,8–9,5% genomu člověka ! Význam:  variabilita lidského genomu (fenotypu)  polymorfismus – genetická diverzita mezi jedinci  evoluce  genomová onemocnění CNVs a nový pohled na variabilitu lidského genomu Scherer 2007 Nat Genet 39: s7 Spektrum genetické variability člověka CNVs sekvenční x strukturní 1-20 bp Genetická variabilita u člověka a SNP 0.1% difference among people 1/1000 pb cca 10 miliónů GATTTAGATCGCGATAGAG GATTTAGATCTCGATAGAG Single nucleotide polymorphisms (SNPs) Variabilita lidského genomu - CNVs mají větší význam než SNP ! • typical genome differs from the reference human genome at 4.1 million to 5.0 million sites • although 99.9% of variants consist of SNPs and short indels, structural variants affect more bases: the typical genome contains anestimated 2,100 to 2,500 structural variants: • cca 1,000 large deletions, 160 copy-number variants, 915 Alu insertions, 128 L1 insertions, 51 SVA insertions, 4 NUMTs and 10 inversions affecting cca 20 million bases of sequence ! Nature 256, October 2015 osekvenování 2504 genomů člověka z různých oblastí….(26 populací) Význam CNVs v evoluci hominidů • osekvenován genom 97 lidoopů (orangutan, gorila, šimpanz) • 469 Mb pokryto CNVs vs. 167 Mb SNP • 3x větší počet pb ovlivněn CNVs než SNP ! • nalezeno celkově 340 delecí a 450 duplikací genů • 13, 5 Mb sekvencí, které se nevyskytují v lidském genomu Great Ape Genome Project CNVs a genomová onemocnění Genomová onemocnění u člověka  od poč. 21. století dochází ke změně pohledu na příčinu některých genetických onemocnění…  genocentrický vs. genomický přístup  CNVs - genomová onemocnění (genomic disorders) - 1.7 ×10−6 to 1.0 × 10−4 per locus per generation  onemocnění vzniklá bodovými mutacemi - 1.8–2.5 × 10−8 per base pair per generation Genomová onemocnění u člověka vznikají 1000 až 10 000 častěji než onemocnění vyvolaná bodovými mutacemi ! Četnosti: CNVs a genomová onemocnění Genomové choroby (genomic disorders) – onemocnění vznikající v důsledku přestaveb genomu způsobujících zisky či ztráty genů (CNVs) Evoluce lidského genomu duplikace genů, genových segmentů a repetitivních sekvencí Tato architektura genomu vytváří vhodné podmínky pro homologní rekombinaci, při níž může docházet k přestavbám chromozomů (NAHR) Genomic rearrangements resulting from recombination between repeated sequences. Rozložení intrachromozomálních a interchromozomálních SDs (≥10 kb; ≥95%) v genomu Jeffrey A. Bailey et al. Science 2002;297:1003-1007 Lidský genom je náchylný k strukturní variabilitě v důsledku existence SDs ! • SDs – až 8000 substrát pro nealelickou homologní rekombinaci – (NAHR) nerovnoměrný crossing-over • divergence genomu • genomová onemocnění Nerovnoměrný crossing-over, duplikace genu a mutace Bar u drozofily Duplikace Bar u Drosophily B+,B ovlivňuje počet facet u složených očí CNVs a příklady genomových onemocnění Mikrodeleční/mikroduplikační syndromy… pacienti s PMR, autismem, schizofrenií, obezitou, epilepsií… Vzácná chromozomová onemocnění (1 : 4 000 – 15 000) Genetické choroby a vzácná onemocnění  Onemocnění je v rámci EU definováno jako vzácné, pokud postihuje méně než 5 osob z každých 10 000, (tj. méně než 1 pacienta na 2 000 jedinců). Existuje více než 8 000 různých vzácných onemocnění, což znamená, že souhrnný počet pacientů je nezanedbatelný.  Vzácná onemocnění se nejčastěji projevují brzy po narození a postihují 4-5 % novorozenců a kojenců (například některé vrozené vývojové vady, dědičné poruchy metabolismu, geneticky podmíněná onemocnění a vzácné nádory). Mohou se však projevit i později v průběhu dětství či v dospělosti.  Asi 80% vzácných onemocnění má genetické původ, nicméně u většiny pacientů zůstává příčina jejich choroby neodhalena. CNVs a mikrodeleční syndromy rekurentní CNVs Mikrodeleční/mikroduplikační syndromy  skupina geneticky podmíněných chorob, jejichž příčinou jsou drobné delece DNA segmentů (2-4 Mb), které nejsou detekovatelné klasickými cytogenetickými metodami  pacienti mají specifické klinické příznaky  častý výskyt MR (mentální retardace)  nebalancované chromozomové přestavby patogenní CNVs  rekurentní ( mikrodelece vznikají ve stejném místě na chromozomu)  nerekurentní – mohou vzniknout kdekoliv v genomu Nejčatější rekurentní mikrodelece - některé rozpoznatelné fenotypy – syndromy „phenotype first“ • růstová retardace • dysmorfismus • stigmata • mentální retardace • malformace • cca 20 od roku 2006 Obecné příznaky: Mechanismus vzniku rekurentních mikrodelečních/duplikačních syndromů při meióze – nealelická homologní rekombinace Architektura genomu - LCR či SDs spojená s delecemi/duplikacemi: sekvenční homologie >95%, oddělené 50 kb -10 Mb úsekem DNA, v přímé orientaci Rekurentní mikrodelece/duplikace 17p jako model pro genomové choroby  oblast chromozomu 17p obsahuje 7,5 Mb dlouhý úsek bohatý na LCR  častý výskyt NAHR….  reciproké mikroduplikace /mikrodelece chromozomu 17p11.2p12 způsobují 4 genetická onemocnění: a) Charcot-Marie-Tooth typ 1A - mikroduplikace genu PMP22 b) hereditární neuropatie s tendecí k tlakovým parézám mikrodelece genu PMP22 c) Smith-Magenisův syndrom - mikrodelece genu RAI1 d) Potockého-Lupského syndrom - mikroduplikace RAI1 Reciproká rekombinace jako příčina CMT1A a hereditární neuropatie Lupski, 2009 Mikrodelece 22q11 DiGeorgeův/VCFS syndrom  pacienti s mikrodelecí se vyskytují v populaci s četností 1: 4000 až 1: 6000 živě narozených dětí  Velo - Kardio- Faciální syndrom  CATCH 22  typické vrozené srdeční vady  (zjišťují se i prenatálně !)  faciální dysmorfie  hypoplasie - aplasie brzlíku (gen Tbx1) event. příštitných tělísek nedostatek vápníku, křeče  imunodefekty (absence T-lymfocytů) Fallotova tetralogie: A: stenóza plicnice B: dextropozice aorty C: defekt komorového septa D: hypertrofie pravé komory CATCH 22 - del(22)(q11)  Cardiac defect – typické srdeční vady  Abnormal facies – brada  Thymic hypoplasia – poruchy imunity, infekce  Cleft palate - roštěp  Hypocalcemia - křeče  75 % pacientů - delece 22q11  výjimečně – delece 10p  (DiGeorge II) Ukázka pacientů s VCFS prominující brada, výrazný nos Mikrodelece 22q11 DiGeorgeův/VCFS syndrom – vyšetřovací metody  přibližně 90 % probandů má de novo deleci 22q11, asi u 6% se jedná o familiární přenos Vyšetření:  a) vyšetření karyotypu – G-pruhování  b) cílené vyšetření mikrodelece 22q11 – FISH, MLPA  c) rozšířené vyšetření pomocí DNA mikročipů Klinické projevy CATCH 22 – variabilní expresivita Frekvence jednotlivých typů vrozených vad : 75% vývojové srdeční vady 60% hypokalcémie 49% otolaringologické malformace (9% rozštěp patra, 32% velofaryngeální insuficience) 38% poruchy vývoje psychomotoriky 36% konstitučně nízký vzrůst pod 3 percentil 36% urogenitální anomálie 17% malé anomálie kostry 8% letalita do 6. měsíců věku postnatálně 8% neurologické anomálie Popsáno celkem až 180 různých příznaků, velká variabilita…? • rozsah a umístění mikrodelece (chybí 20-60 genů) • haploinsuficience • teorie II. zásahu • genetické pozadí Mikrodelece mohou být různě umístěné… Korelace mezi genotypem a fenotypem - postižení pacientů s mikrodelecí oblasti 22q11  Mikrodelece proximální (HIRA, TBX1, COMT) – imunodeficience, kardiovaskulární vady, abnormality patra, poruchy řeči, hypotonie, mentální retardace a vývojové opožďování, hypokalcémie, psychiatrické onemocnění a faciální stigmata  Mikrodelece centrální (CRKL) – nízký vzrůst, vývojové opožďování, mentální retardace, poruchy řeči a faciální stigmata, od proximální mikrodelece se liší významně nižším výskytem imunodeficiencí, hypotonie, abnormalit patra a poruch chování  Mikrodelece distální (typ I. - MAPK1/ERK2, typ III. - SMARCB1) Typ I. – faciální stigmata, nízký vzrůst, kardiovaskulární vady, abnormality kostry a vývojové opožďování, prematurita (polovina případů) Typ II. – vývojové opožďování, faciální stigmata, mentální retardace a poruchy řeči Typ III. – rhabdoidní tumory, opožďování vývoje, kardiovaskulární vady a faciální stigmata Rozsah mikrodelece 22q11 u 24 pacientů vyšetřených na OLG FN Brno Vystavělová D. Diplomová práce, 2016 CNVs a mentální retardace Mentální retardace (MR)  Heterogenní manifestace dysfunkce CNS charakterizovaná signifikantně podprůměrnými intelektuálními funkcemi  Mírná MR (IQ 50 – 70)  Střední MR (IQ 35 – 50)  Těžká MR (IQ 20 – 35) (Battaglia et al.. 1999)  Postihuje 2 až 3 % populace,  Často doprovázena růstovou retardací, opožděním vývoje, faciální dysmorfií aj.  Poměr pohlaví 2M:1F ! Příčiny mentálních retardací  komplexní etiologie; asi u 50 % případů nelze zjistit kauzální příčinu (narušení vývoje mozku)  negenetické příčiny  genetické příčiny  monogenní choroby (metabolické: fenylketonurie, galaktosemie)  choroby s nemendelistickým typem dědičnosti (syndrom Fragilního X)  choroby způsobené chromozomovými aberacemi:  početní:  +21 (Downův sy), +18 (Edwardův sy), +13 (Pataův sy),  aberace pohlavních chromozomů XXY, XXX, XYY  strukturní:  rozsáhlé balancované i nebalancované přestavby  CNV - známé mikrodelece/mikroduplikace (PWS/AS, DGS aj.)  další submikroskopické změny chromozomů (delece, duplikace, inverze) Příčiny MR 30% 15% 55% faktory genetické vliv prostředí neznámá příčina Současný algoritmus genetického vyšetření pacientů s PMR na OLG FN Brno normální MLPA array-CGH FISHFISH,QF-PCR Specifický syndrom aberace Karyotyp G-pruhování normální potvrzení NGS Celkový přehled vyšetření pacientů s PMR na OLG FN Brno v letech 2007-2015  Celkově 275 vyšetření pomocí array-CGH  144 chlapců, 131 dívek  164 vyšetření s normálním karyotypem  111 vyšetření s pozitivním nálezem, tj. 40,4 %  51 patogenních nálezů CNVs = 18,5 % ze všech vyšetření  10 nálezů nejasného významu  36 benigních nálezů  15 nálezů dosud nedošetřeno Patogenní CNVs detekované pomocí DNA mikročipů u dětí s PMR del 17q11.2-q12 7,25 Mb mikrodeleční sy. dup 22q11.21 2,91 Mb mikroduplikační sy. del Xq22.3-q23 3 Mb dup 16p12.3-p13.12 3,40 Mb 16p13.11 rekurentní mikroduplikace del 1q21.1 334 kb mikrodeleční sy. dup 2q12.1-q13 8,98 Mb del 9q34.3-qter 1,70 Mb 9q deleční sy. dup 15q11.2-q13.1 4,87 Mb mikroduplikační sy. del 11q24.1-q25 10,69 Mb mnohočetná LOH konsanguinita rodičů del 9q34.11 891 kb del 12p13.31-p13.32 5,23 Mb nebalancovaná translokacedel 7q11.23 (2x) 1,41 Mb Williams-Beuren sy. dup 18p11.21-p11.32 14,83 Mb del 7q11.23-q21.1 3,66 Mb del X/r(x) karyotyp 45,X/46,X,r(X) dup 17q12 (2x) 1,58 Mb mikroduplikační sy. del 17p13.3 1,35 Mb nebalancovaná translokacedel 15q11.1-q13.1 8,47 Mb PWS/AS dup 22q13.2-q13.33 7,57 Mb del 5q14.3-q15 5,84 Mb mikrodeleční sy. del 8p23.1-p23.3 10,11 Mb 8p23 deleční sy. del 1q23.3-q24.2 6,19 Mb del 22q12.3-q13.1 1,67 Mb Waardenburgův sy. dup 17p13.3 2,40 Mb nebalancovaná translokace dup 2p25.1-p25.3 9,40 Mb nebalancovaná translokacedel 22q13.32 1,89 Mb del 5p15.33 2,05 Mb del 18p11.21-p11.32 14 Mb 18p deleční sy. dup 16p11.2 544 kb mikroduplikační sy. dup 14q32.2-q32.33 10,52 Mb dup 1q21.1-q21.2 3,50 Mb mikroduplikační sy. del 4q13.32-q21.22 16,14 Mb del 1q21.1-q21.2 2,78 Mb mikrodeleční sy. del 3p25.3-p26.3 (2x) 9,60 Mb nebalancovaná translokace del 2p11.1-p11.2 3,92 Mb dup 18p11.21-p11.32 8,29 Mb dup 18p11.21-p11.32 14,87 Mb karyotyp 46,XX,der(18) mnohočetná LOH (2x) sourozenci konsanguinita rod. dup 18q11.1-q12.1 7,61 Mb del 13q14.13-q22.3 31,03 Mb del 18q22.2-q23 10,99 Mb del 22q11.21-q11.22 1,43 Mb distální 22q11.2 mikrodelece del 1q43-q44 1,73 Mb mikrodeleční sy. dup 1q21.1-q21.2 1,67 Mb mikroduplikační sy. del 16p11.2 534 kb mikrodeleční sy. del 9q22.3-q31.3 6,20 Mb dup 2q11.1-q11.2 1,27 Mb LOH na chr. 1q, 11q, 19q konsanguinita rodičůdup Xp21.1 171 kb gen DMD del 1q43-q44 4,68 Mb mikrodeleční sy. dup 20p11.1-p13 22,10 Mb karyotyp Cytogenetika 60. let po spočítání lidských chromozomů I přes stále větší rozvoj moderních genomických technik (NGS) zůstává cytogenetika stále jedním z nosných pilířů moderních vyšetřovacích metod využívaných v oblasti lékařské genetiky a dalších medicínských oborů Děkuji za pozornost !!!