Vybrané experimentální postupy pro manipulaci 
s DNA a proteiny
segmentace enzymy a rekombinace DNA
transformace organizmů cizí DNA
klonování DNA
cDNA knihovny
elektroforéza DNA
hybridizace se značenými sondami
PCR (Polymerase Chain Reaction)
určování sekvence DNA
produkce rekombinantních proteinů
určování struktury proteinů (X­ray, NMR)
PCR
Sekvence DNA
ˇ Poradi nukleotidu ve smeru 5' k 3' ulozeno pro budouci 
generace jako dlouhy retezec symbolu A, C, G a T
ˇ Dobra sprava pro budoucnost bioinformatiku: zatim je 
osekvenovano jenom asi 150 organizmu, data budou pribyvat
ˇ Polymorfizmus: Rozdil mezi jedinci Homo sapiens sapiens 
1/1000 bazi
Sekvence DNA
ˇ Sekvenace se dela ve dvou fazich
ˇ Za pouziti DNA polymerazy a smesi normalnich a modifikovanych 
deoxyribonukleotidu se syntetizuji vlakna DNA, templatem je 
sekvenovana molekula DNA
ˇ Produkty polymerizace se v automatickych strojich chromatograficky 
deli podle velikosti a vypovidaji o sekvenci
ˇ Jedna reakce poda informaci o 500­1000 bazich
Sekvence DNA
Sekvence DNA
1975 bakteriofag MS2
1977 bakteriofag PhiX174      5,375 bp
1982 bakteriofag Lambda
1984 HIV­1
1990 virus HCMV      230 Kbp
1995 H. influenzae     1,83 Mbp
1996 E. coli     4,60 Mbp
S. cerevisiae   12,00 Mbp
1998 C. elegans      96 Mbp
2000 D. melanogaster    120 Mbp
A. thaliana    130 Mbp
2001 H. sapiens 3 000 Mbp
M. musculus 3 000 Mbp
2004­5 R. norvegicus, A. melifera, G. gallus, C. familiaris, B. taurus
DNA Microarray
DNA Chip
Kazde pole (sonda) nese tisice oligonukleotidu
Desticka o rozmerech 1.28 cm x 1.28+ cm, sklo, silikon
Desticky s nanasenymi oligonukleotidy maji pole asi 100 
mikrometru, radove 10000 oligonukleotidovych sond o 60 
bazi
Desticky s oligonukleotidy syntetizovanymi na miste 
(DNA cipy Affymetrix) maji pole 25 mikrometru, radove 
100000 sond 25 bazi
Cells
Poly­A
RNA
AAAA
cDNA
L L L
L
IVT
10% Biotin­labeled Uracil
Antisense cRNA
L
Fragment (heat, Mg2+
)
Labeled
fragments
Hybridize Wash/stain Scan
L
(In­vitro 
Transcription)
65187552104
9314024655
8716538247
329611283
S jakou frekvencí se bude v dostatečně dlouhé náhodné 
sekvenci DNA vyskytovat sekvence AAGT? 
S jakou frekvencí se bude v dostatečně dlouhé molekule
DNA vyskytovat sekvence AAGT, pokud víme, že obsah 
C + G je 2/3 (cca 66%)? 
S jakou frekvencí se bude v dostatečně velkém genomu 
vyskytovat sekvence AAGT, pokud víme, že obsah 
C+G je 2/3 (cca 66%)? 
central dogma
genome
DNA
nucleotide
3' / 5'
hybridization
replication
DNA polymerase
vector
plasmid
sequence alignment
PCR
DNA sequence
contig
gene
ORF
gene structure
promoter
intron
exon
prokaryote
ATG
GC content
eukaryote
TATA
enhancer
silencer
RNA
transcription
mRNA
gene expression
microarray
probe
EST
translation
codon
protein
proteome
mass spectrometry
signal transduction