Vybrané experimentální postupy pro manipulaci 
s DNA a proteiny
segmentace enzymy a rekombinace DNA
transformace organizmů cizí DNA
klonování DNA
cDNA knihovny
elektroforéza DNA
hybridizace se značenými sondami
PCR (Polymerase Chain Reaction)
určování sekvence DNA
produkce rekombinantních proteinů
určování struktury proteinů (X­ray, NMR)
Restrikcni endonukleazy
Vektor pro rekombinantni DNA (klonovani DNA)
Manipulace DNA
Elektroforeza DNA
+
­
PCR
Sekvence DNA
ˇ Pořadí nukleotidů ve směru 5' k 3' uloženo pro 
budoucí generace jako dlouhý řetězec symbolů A, 
C, G a T
ˇ Dobrá správa pro budoucnost bioinformatiků: zatím 
je osekvenováno jenom asi 150 organizmů, data 
budou přibývat
ˇ Polymorfizmus: Rozdíl mezi jedinci Homo sapiens 
sapiens 1/1000 bazí
Sekvence DNA
ˇ Sekvenace se dělá ve dvou fázích
ˇ Za použití DNA polymerázy a směsi normálních a 
modifikovaných deoxyribonukleotidů se syntetizují vlákna 
DNA, templátem je sekvenovaná molekula DNA
ˇ Produkty polymerizace se v automatických strojích 
chromatograficky dělí podle velikosti a vypovídají o 
sekvenci
ˇ Jedna reakce podá informaci o 500­1000 bazích
Sekvence DNA
Sekvence DNA
1975 bakteriofag MS2
1977 bakteriofag PhiX174      5,375 bp
1982 bakteriofag Lambda
1984 HIV­1
1990 virus HCMV      230 Kbp
1995 H. influenzae     1,83 Mbp
1996 E. coli     4,60 Mbp
S. cerevisiae   12,00 Mbp
1998 C. elegans      96 Mbp
2000 D. melanogaster    120 Mbp
A. thaliana    130 Mbp
2001 H. sapiens 3 000 Mbp
M. musculus 3 000 Mbp
2004­5 R. norvegicus, A. melifera, G. gallus, C. familiaris, B. taurus
DNA Microarray
DNA Chip
Každé pole (sonda) nese tisíce oligonukleotidů
Destička o rozměrech 1.28 cm x 1.28+ cm, sklo, silikon
Destičky s nanášenými oligonukleotidy mají pole asi 100 
mikrometrů, řádově 10000 oligonukleotidových sond o 60 
bází
Destičky s oligonukleotidy syntetizovanými na místě 
(DNA čipy Affymetrix) mají pole 25 mikrometrů, řádově 
100000 sond 25 bází
Cells
Poly­A
RNA
AAAA
cDNA
L L L
L
IVT
10% Biotin­labeled Uracil
Antisense cRNA
L
Fragment (heat, Mg2+
)
Labeled
fragments
Hybridize Wash/stain Scan
L
(In­vitro 
Transcription)
65187552104
9314024655
8716538247
329611283
S jakou frekvencí se bude v dostatečně dlouhé náhodné 
sekvenci DNA vyskytovat sekvence AAGT? 
S jakou frekvencí se bude v dostatečně dlouhé molekule
DNA vyskytovat sekvence AAGT, pokud víme, že obsah 
C + G je 2/3 (cca 66%)? 
S jakou frekvencí se bude v dostatečně velkém genomu 
vyskytovat sekvence AAGT, pokud víme, že obsah 
C+G je 2/3 (cca 66%)? 
central dogma
genome
DNA
nucleotide
3' / 5'
hybridization
replication
DNA polymerase
vector
plasmid
sequence alignment
PCR
DNA sequence
contig
gene
ORF
gene structure
promoter
intron
exon
prokaryote
ATG
GC content
eukaryote
TATA
enhancer
silencer
RNA
transcription
mRNA
gene expression
microarray
probe
EST
translation
codon
protein
proteome
mass spectrometry
signal transduction