IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Katedra informačních technologií Masarykova Univerzita Brno Jaro 2008 IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Před týdnem DNA nepřímo (přes proteiny) řídí většinu procesů v buňce. Její struktura vykazuje všechny potřebné rysy. Je nositelem genů. Exprese genů transkripce translace Struktura proteinů primární (sekvence aminokyselin) sekundární (, , etc.) terciární (3-D) kvartérní (makromolekulární komplexy) IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí http://www.molviz.org/ IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Schéma 1 IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Schéma 2 IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Outline Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Analýza sekvencí IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Techniky manipulující DNA a RNA Rekombinace DNA a klonování izolace z buněk štěpení restrikčními endonukleázami rekombinace (ligace) transformace organizmů rekombinantní DNA Syntéza, kopírování a amplifikace DNA syntéza oligonukleotidů transkripce in vitro syntéza cDNA amplifikace pomocí PCR Detekce, analýza a sekvenace elektroforéza (dělení podle velikosti) hybridizace se značenými sondami určování sekvence IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Restrikční endonukleázy enzym zdroj restrikční místo fragment[kbp] AluI Arthrobacter luteus AGCT TCGA 0.3 BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GGATC C C CTAGG 7.0 EcoRI Escherischia coli R GAATT C C TTAAG 3.1 HaeIII Haemophilus aegyptus GGCC CCGG 0.6 NotI Norcadia otitidis-caviarum GCGGCC GC CG CCGGCG <9700 PstI Providencia stuartii C TGCAG GACGT C 7.0 TaqI Thermus aquaticus TCG A A GCT 1.4 HindIII Haemophilus influenzae Rd AAGCT T T TCGAA 3.1 IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Rekombinace a klonování IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Rekombinace DNA a klonování IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Identifikace DNA na agarózovém gelu IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí V laboratoři A http://www.ct.gov/dps/cwp/view.asp?a=2155&q=314998 B http://www.sme.sk/c/3753490/Genetika-nadej-pre-pacientov.html IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí PCR (polymerázová řetězová reakce) IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí PCR (polymerázová řetězová reakce) IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí PCR (polymerázová řetězová reakce) IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí PCR (polymerázová řetězová reakce) IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Sekvence DNA Pořadí nukleotidů ve směru 5 3 uloženo pro budoucí generace jako dlouhý řetězec symbolů A, C, G a T Dobrá zpráva pro budoucnost bioinformatiků: zatím je osekvenováno jenom asi 280 organizmů, data budou přibývat Polymorfizmus: Rozdíl mezi jedinci Homo sapiens sapiens 1/1000 bazí Personal Genomics Project (PGP) IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Sekvence DNA Sekvenace se dělá ve dvou fázích Za použití DNA polymerázy a směsi normálních a modifikovaných deoxyribonukleotidů se syntetizují vlákna DNA (imitace replikace), templátem je sekvenovaná molekula DNA Produkty polymerizace se v automatických strojích chromatograficky dělí podle velikosti a vypovídají o sekvenci Jedna reakce podá informaci o 500-1000 bazích IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Dideoxynukleotid neumožňuje navázání dlaších nukleotidů IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Polymeráza se zastaví při použití ddNTP IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Výsledek automatického sekvenování IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Výsledek automatického sekvenování IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Sekvenace hybridizací je založena na vázání se DNA na destičku s různými oligonukleotidy IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Přechod DNA pórem v membráně nitridu silikonu generuje elektrický signál, který by mohl umožnit sekvenování IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Historie sekvenace genomů 1975 bakteriofag MS2 1977 bakteriofag PhiX174 5,375 bp 1982 bakteriofag Lambda 1984 HIV-1 1990 virus HCMV 230 Kbp 1995 H. influenzae 1,83 Mbp 1996 E. coli 4,60 Mbp 1996 S. cerevisiae 12,00 Mbp 1998 C. elegans 96 Mbp 2000 D. melanogaster 120 Mbp 2000 A. thaliana 130 Mbp 2001 H. sapiens 3 000 Mbp 2001 M. musculus 3 000 Mbp IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Microarray IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Microarray IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Techniky manipulující proteiny izolace z buněk elektroforéza (dělení podle velikosti) zjišťování aktivity štěpení peptidázami určování sekvence generování protilátek pro daný protein ELISA a podobné testy produkce rekombinantních proteinů (např lacZ, GFP) krystalizace a určování struktury hmotnostní spektrometrie IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí SDS-PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovém gelu) Sodium dodecyl sulfát denaturuje proteiny a dává vzniklým komplexům záporný náboj IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Pole na bázi proteinů IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Biosenzory v proteinových čipech IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Slovní pojmů molekulární biologie central dogma gene RNA genome ORF transcription DNA gene structure mRNA nucleotide promoter gene expression 3/5 intron microarray hybridization exon probe replication prokaryote EST DNA polymerase ATG translation vector GC content codon plasmid eukaryote protein sequence alignment TATA proteome PCR enhancer mass spectrometry DNA sequence silencer signal transduction IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencíPříště Analýza sekvencí IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Dodatek For Further Reading Outline Dodatek IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Dodatek For Further Reading For Further Reading X