IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí Katedra informačních technologií Masarykova Univerzita Brno Jaro 2009 □ rS" :|= -O^O Před týdnem IV107 Bioinformatika Přednáška 3 DNA nepřímo (přes proteiny) řídí většinu procesů v buňce. Její struktura vykazuje všechny potřebné rysy. Je nositelem genů. Exprese genů ► transkripce ► translace Struktura proteinů ► primární (sekvence aminokyselin) ► sekundární (a, ß, etc.) ► terciární (3-D) ► kvartérní (makromolekulami komplexy) Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR '. -"-■ . clizací a sekvenc DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí http://www.molviz.org/ IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Hemoqlobin Chime An introductory presentation suitable far lectures or individual study. (Deutsch, Portuqués) Sijf MHC Chime Jí, The Major Histocompatibility Complex | . presents peptides from foreign prot*im [■:■ T lymphocytes, crucial to disease immunity. Molecular Vibrations: IR Spectrum by Motyka, Lahti S Lancashire. Lac repressor Chime bending the DNAoperon as it goes from nonspecific to specific DNA binding. 'Win -IE6 -Compatible' DNA Structure Chime An introductory level, nonlinear self-paced iiiMi.u ií. - ui-:-';i;. F.s|.oňoi. F'.-.ľumŕ:! 'Wln-IEG-Compatlble' Lipid Bilayers and Membrane Channel Chime Introduces cholesterol and phospholipids, then proceeds to lipid bilayer and the gramicidin membrane channel embedded within the bilayer. Includes molecular dynamics simulations of both gel and fluid membrane states. By Eric Marb and Angel Herráeľ. (Espanol) Antibody Chime * An introductory presentation suitable far V lectures or individual study, u (Deutsch) S Water Chime Theoretical simulation of 10 water molecules condensing into a hydrogen-bonded droplet. Includes challenge questions for students, 'Win-IES-Compatible' 1 «Hl#| Bacterial Flagellar Hook Chime Bacterial flagella air .■iii|-lil-.--/i-i,ii:-ll-o II i íl ľ.i í-:i.i 'ľ-.- '■.■ :.,vini akut. The hook acts as a molecular uiiívťio.í! jiiiil. W: ■:■ ■ni|>.'.-:i ■:■[■:■■«!' I >.".' |:rol-?in subunits. Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinao Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Příště Analýza sekvencí □ rS1 ■f}<\(\ Schéma 1 IVWBioinformatikal -Přednáška 3 ACGU nucleotides double he-lijc base pairing regulatory elements splicing ^truĽlureol DNA A RNA J----- exoni loproleJri (fauMripliůri mRNŮ genetktode Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí RNA structure □ ť5> :|= -O^O Schéma 2 amino adds have preferred conformations n low energy state four Jevelj of structure protein structure IVWBioinformatikal -Prednáška 3 amino adds primary chain of amino acids a-helix secondary |i-slrand fi-turn loops tertiary f quaternary i olds/domains lull \\i e fůldi Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí rS1 M= -00,0 Outline Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Analýza sekvencí IVWBioinformatikal -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí -š = ^)Q,0 IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Techniky manipulující DNA a RNA ► Rekombinace DNA a klonování - izolace z buněk - štěpení restrikčními endonukleázami - rekombinace (ligace) - transformace organizmů rekombinantní DNA ► Syntéza, kopírování a amplifikace DNA - syntéza oligonukleotidů - transkripce in vitro - syntéza cDNA amplifikace pomocí PCR ► Detekce, analýza a sekvenace - elektroforéza (dělení podle velikosti) - hybridizace se značenými sondami *■ určování sekvence Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí □ g t\= -00,0 IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Reštrikční endonukleazy enzym zdroj reštrikční místo fragment[kbp] Alul Arthrobacter luteus AGjCT TCTGA 0.3 BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GJ.GATC C C CTAGtG 7.0 EcoRI Escherischia coli R GJ.AATT C C TTAAtG 3.1 Haelll Haemophilus aegyptus GGiCC CCtGG 0.6 Notl Norcadia otitidis-caviarum GC|GGCC GC CG CCGGtCG <9700 Pstl Providencia stuartii C TGCAtG GtACGT C 7.0 Taql Thermus aquaticus TiCG A A GCtT 1.4 Hindlll Haemophilus influenzae Rd AiAGCT T T TCGAiA 3.1 Makromolekuly v laboratoři Rekombinace DNA a klonovár «clizací a sekvenovár DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí □ rS1 - :|= -O^O IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Rekombinace a klonování Sad Smál Xbaí Pstl HindH GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT Makromolekuly v laboratoři Rekombinace DNA a klonovár Příště Analýza sekvencí □ g t\= -00,0 Rekombinace DNA a klonování JVEsmattli Inserting a DNR Sample into a Plasmid IVWBioinformatikal -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Rekombinace DNA a klonování Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí ^) C\ Q- IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Identifikace DNA na agarózovém gelu Makromolekuly v laboratoři Rekombinace DNA a klonovár Příště Analýza sekvencí □ ö :|= -O^O V laboratoři http://www.ct.gov/dps/cwp/view.asp?a=2155&q=314998 IVWBioinformatikal -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Rekombinace DNA a klonovár Příště Analýza sekvencí http://www.sme.Sk/c/3753490/Genetika-nadej-pre-pacientov.html u g - = jš|= ^)q,o IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 PCR (polymerázová řetězová reakce) PCR : Polymerase Chain Reaction 30 - 40 cycles of 3 steps : TT- nrrľľ Slep ] : denauiraiion 5'%#WIffTmnTrnrirnnTnr^^ y Step 2 - annealing ,■„. > ,]iiuiiiiiiiiář ^"-"Wls1 ar %, 45 seconds 54 'C ■Ä^ i'r*ii™(ľ!l,'i:'iin[iľ*'1 mi -" - n * forward and reverse primers ľ!! 2 mímites 72 °C unfy ilNTPs Makromolekuly v laboratoři Syntéza, kopírovaní a PCR (amplifikace) Příště Analýza sekvencí □ g - _= = '*)ci4r> IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 PCR (polymerázová řetězová reakce) Makromolekuly v laboratoři Third cycle □ g - _= = >T)(\(y PCR (polymerázová řetězová reakce) lkbz 5ÍH-30(1- -----1857 —1058 -----929 ----- 3S3 Verification ůf PCR product on agarose or scpaiidc gcJ ladder PCR fragments □ rS1 - IVWBioinformatikal -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Syntéza, kopirc (amplifikace) Příště Analýza sekvencí :|= -O^O PCR (polymerázová řetězová reakce) IVWBioinformatikal -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Syntéza, kopirc (amplifikace) Příště Analýza sekvencí □ Ö - :|= -O^O IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Sekvence DNA Pořadí nukleotidů ve směru 5' —> 3' uloženo pro budoucí generace jako dlouhý řetězec symbolů A, C, GaT ► Dobrá zpráva pro budoucnost bioinformatiků: zatím je osekvenovano jenom asi 280 organizmů, data budou přibývat - Polymorfizmus: Rozdíl mezi jedinci Homo sapiens sapiens 1/1000 baží - Personal Genomics Project (PGP) Makromolekuly v laboratoři DNA Příště Analýza sekvencí □ g t\= -00,0 IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Sekvence DNA ► Sekvenace se dělá ve dvou fázích - Za použití DNA polymerázy a směsi normálních a modifikovaných deoxyribonukleotidů se syntetizují vlákna DNA (imitace replikace), templátem je sekvenovaná molekula DNA - Produkty polymerizace se v automatických strojích chromatograficky dělí podle velikosti a vypovídají o sekvenci ► Jedna reakce podá informaci o 500-1000 bazích Makromolekuly v laboratoři DNA Příště Analýza sekvencí □ ö :|= -O^O IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Dideoxynukleotid neumožňuje navázání dlaších nukleotidů Makromolekuly v laboratoři DNA Příště Analýza sekvencí □ g - _= = ^<\(y Polymeráza se zastaví při použití ddNTP IV107Bioinformatikal -Přednáška 3 Dm Ps brrosíicff rvuti th» ttn>plä*c siranJ und synthiisiřft > ihw sKon-d slrsnd lo m.-ic n í ~/ 51 - TPřecr,r,TBňr™TiiriiTTC6ňccCTTTfioeTfiCMn 3- - flľíCSC£nTT6CÉľaincnflr,CTGr.c*ňiiTtGflTfii;£TRl7 XCfl« - 5" Makromolekuly v laboratoři DNA ff S)S«T)(\(y Micro array IVWBioinformatikal -Přednáška 3 * f- •*« »■■• ■ *• ■ *« ■ ■*■»* B.É-P » _ .*_*«* 441 * ■■ f - * -;;;..........'"* * •■■ » ■ Vi » É* * * ■ ■ I -- . 11 ,4#| B ** »»»Ä 4« -I »Ir.«■*■•■ ■ 1 1-1 ,«- ,. , , M r ....I ... . I. .. J.:,;:;;; -J;},;-;,: ;.«». :...... A* . _»* i)i< , * • ** »■•>*• » ■ Makromolekuly v laboratoři DNA 1>l ■ ■■»■*■ » ■■ ■ « ■ »-+-É*! ■»■+ _•■ ■ aT ••* 1* ■ ■•■ *4" .**!■»■ m # ft, ||f, I V4 Příště Analýza sekvencí □ rS1 ~ M= -O^O IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Techniky manipulující proteiny izolace z buněk ► elektroforeza (dělení podle velikosti) ► zjišíování aktivity ► štěpení peptidázami ► určování sekvence ► generování protilátek pro daný protein ELISA a podobné testy ► produkce rekombinantních proteinů (např lacZ, GFP) ► krystalizace a určování struktury ► hmotnostní spektrometrie Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí □ rS1 :|= -O^O SDS-PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovem gelu) IVWBioinformatikal -Přednáška 3 Electrode I Samples Well. Larger „ fragments Smaller-^ fragments Plastic frame - Buffer Electrode Sodium dodecyl sulfát denaturuje proteiny a dává vzniklým komplexům záporný náboj Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí □ rS1 :|= -O^O Pole na bázi proteinů Antigen-? n libody Pioleirv-li pesom« ču im ť*nm n enwiKa 6aojí IV107Bioinformatikal -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí □ g - _= = ^<\(y IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Biosenzory v proteinových čipech Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí □ g - _= = ^<\(y ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) IV107 Bioinformatika I -Prednáška 3 ELISA testing of western flower thrips for INSV (red color is a postive result) ,k i li > v s i ? r i i. " « *«• • • •• •• /_]••••• • « * •: • • •• » • •• • • f r €•••• •• • • • • ..* > i •> v t LT n ■ Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí Sandwich Elisa □ říj - = -^=-0^0 Slovní pojmů molekulární biologie central dogma gene genome ORF DNA gene structure nucleotide promoter 375' intron hybridization exon replication pro kary ote DNA polymerase ATG vector GC content plasmid eukaryote sequence alignment PCR enhancer DNA sequence silencer IVWBioinformatikal -Přednáška 3 RNA transcription mRNA gene expression micro array probe EST translation codon protein TATA proteome mass spectrometry signal transduction Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR '. -"-■ . clizací a sekvenc DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí rS1 M= -O^O IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Příště Analýza sekvencí Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí □ g - _= = ^<\(y IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Dodatek For Further Reading Outline Dodatek □ g - _= = ^<\(y IV107 Bioinformatika I - Přednáška 3 Dodatek For Further Reading For Further Reading X □ ö :|= -O^O