IVWBioinformatika I -Přednáška 3 IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Katedra informačních technologií Masarykova Univerzita Brno Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Příště Analýza sekvencí Jaro 2010 □ rS1 :|= -O^O Před týdnem IVWBioinformatika I -Přednáška 3 DNA nepřímo (přes proteiny) řídí většinu procesů v buňce. Její struktura vykazuje všechny potřebné rysy. Je nositelem genů. Exprese genů ► transkripce ► translace Struktura proteinů ► primární (sekvence aminokyselin) ► sekundární (a, ß, etc.) ► terciární (3-D) ► kvartérní (makromolekulami komplexy) Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonová Syntéza, kopírování a PCR clizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí □ rS1 :|= -O^O http://www.molviz.org/ IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Hemoglobin Chime An introductory presentation sliíMIť fcr lectures or individual study. ■ ĽŤUtKh. Parti ig uěs) MHC Chime The Major Histocompatibility Complex i • presents peptides from foreign proteins to T S lymphocytes, crucial to disease immunity, Molecular Vibrations: IR Spectrum________ by Motyka, Lahti S Lancashire. Lac repressor Chime ľŤiiíliiv"! Hi-? DNA operon from nonspecific to specific DNA binding. DNA Structure Chime An introductory level, nonlinear self-pact tutorial. [Deutsch, Espanol, Portuqués) 'Wln-IEG-Compatible* Antibody Chime An introductory presentation suitable for lectures or individual study, (Deutsch) \ Lipid Bilayers and Membrane Channel Chime Introduces cholesterol and phospholipids, then proceeds to lipid bilayer and the gramicidin membrane channel embedded within the bilayer. Includes molecular dynamics simulations of both gel and fluid IÖ membrane states. By Eric Mart; and Angel Herráez. (Espanol) Water Chime 1 Theoretical simulation of 10 water molecules condensing into a hyd rage n-bonded droplet. Includes challenge questions for students, -Wln-IEG-Compallble' j wmb\ Bacterial Flaqellar Hook Chime Bacterial flagella are whip-like organelles that bacteria use to swim about. The hook acts as a molecular universal joint. It's composed of over 100 protein subunits. Wf^Jr^^y^^M 'W in-IE6-Compatible' | Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Příště Analýza sekvencí Schéma 1 IV107Bioinformatika I -Přednáška 3 ACGU oucfeotjdes double h&liří base pairing RNA structure regulatory elemenis itfuctureol ENA S RNA spiking enom trmslstivn from DNA i-^^^^^b- tO protein transcription mRNA genetic code Makromolekuly V laboratoři DNA Rekombin klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) íridizací a sekvenován DNA Analýza sekvencí □ rS :|= -O^O Schéma 2 amin n adds have preferred conformations proteFn structure lů^ene^y itáte IV107Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonová Syntéza, kopírovaní a PCR amino adds primary chain of ď mino acids í (.-helix secondary (tatrand p-turn Joops tertiary f tmcUcirlďry - olds/domains rlultiplr folds. Příště Analýza sekvencí rS1 :|= -O^O Outline Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Analýza sekvencí IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště i/encí -š = ^)Q,0 Techniky manipulující DNA a RNA IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Rekombinace DNA a klonování - izolace z buněk - štěpení restrikčními endonukleázami - rekombinace (ligace) - transformace organizmů rekombinantní DNA ► Syntéza, kopírování a amplifikace DNA - syntéza oligonukleotidů - transkripce in vitro - syntéza cDNA amplifikace pomocí PCR ► Detekce, analýza a sekvenace - elektroforéza (dělení podle velikosti) - hybridizace se značenými sondami *■ určování sekvence Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Příště Analýza sekvencí □ g t\= -O". O Reštrikční endonukleázy IV107Bioinformatika I -Přednáška 3 enzym zdroj reštrikční místo fragment[kbp] Alul Arthrobacter luteus AGjCT TCTGA 0.3 BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GJ.GATC C C CTAGtG 7.0 EcoRI Escherischia coli R GJ.AATT C C TTAAtG 3.1 Haelll Haemophilus aegyptus GGjCC CCtGG 0.6 Notl Norcadia otitidis-caviarum GCtGGCC GC CG CCGGtCG <9700 Pstl Providencia stuartii C TGCAtG GtACGT C 7.0 Taql Thermus aquaticus TiCG A A GCtT 1.4 Hindlll Haemophilus influenzae Rd AiAGCT T T TCGAiA 3.1 Makromolekuly v laboratoři Rekombinace DNA a klonová Syrtéza. kof i vän\ a PCR idizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí □ rS1 - :|= -O^O Rekombinace a klonování IV107Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Sad Smál Xbaí Pstl HindH GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT Rekombinace DNA a klonová Syrtéza. kopírováni a PCR Příště Analýza sekvencí □ g - _= = ^<\(y Rekombinace DNA a klonování EcoRI IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Rekombinace DNA a klonování .vdiiiaPCR Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště i/encí ^) C\ Q- Identifikace DNA na agarózovém gelu IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Rekombinace DNA a klonování rváni a PCR Detekce hybridizácií a sekvenování DNA Proteiny Příště velicí □ g - _= = >T)(\(y V laboratoři http://www.ct.gov/dps/cwp/view.asp?a=2155&q=314998 s y f * Ô % □ S1 IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Rekombinace DNA a klonová Syrtéza. kopírováni a PCR Příště Analýza sekvencí :|= -O^O PCR (polymerázová řetězová reakce) IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři PCR : Polymerase Chain Reaction 30-40 eveles of?* Slep I : de rial lira iioi 5' nTTn#wiffTWiwTníTi^^^ y step i ■ an I,1! 45 seconds 54 °C 'SľÄ^/^^^^, ™d» íMlIlP^ll^^ Syntéza, kopírovaní a PCR (amplifikace) Příště Analýza sekvencí □ g - .= = '*)ci4rv PCR (polymerázová řetězová reakce) •—a Forwad primpr Melt Anneal Extend ^---------------v---------------> First 1JI cycle Second cycle IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Syntéza, kopíro1 (amplifikace) Příště Analýza sekvencí Third cycle □ gl - = _^ = ■ť^Q.O PCR (polymerázová řetězová reakce) IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Veríficatiuri ůf PCR product trn agarose or scpaiidc geJ Hit»» -----1857 lkbz —1058 -----929 5ÍH-30(1- -----383 ladder PCR j ragmen Is Syntéza, kopírovaní a PCR (amplifikace) Příště Analýza sekvencí □ rji - _= = ^<\(y PCR (polymerázová řetězová reakce) IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři Syntéza, kopíro1 (amplifikace) Příště Analýza sekvencí □ g - _= = ^<\(y Sekvence DNA IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Pořadí nukleotidů ve směru 5' —> 3' uloženo pro budoucí generace jako dlouhý řetězec symbolů A, C, GaT Dobrá zpráva pro budoucnost bioinformatiků: zatím je osekvenováno jenom asi 1000 organizmů, data budou přibývat - Polymorfizmus: Rozdíl mezi jedinci Homo sapiens sapiens 1/1000 baží - Personal Genomics Project (PGP) Příště Analýza seiend □ g t\= -00,0 Sekvence DNA IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont ► Sekvenace se dělá ve dvou fázích - Za použití DNA polymerázy a směsi normálních a modifikovaných deoxyribonukleotidů se syntetizují vlákna DNA (imitace replikace), templátem je sekvenovaná molekula DNA - Produkty polymerizace se v automatických strojích chromatograficky dělí podle velikosti a vypovídají o sekvenci ► Jedna reakce podá informaci o 500-1000 bazích Příště Analýza seiend □ g t\= -00,0 Dideoxynukleotid neumožňuje navázání dlaších nukleotidů IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Příště Analýza sekvencí □ g - _= = ^<\(y Polymeráza se zastaví při použití ddNTP IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Dhtt F*^rw<^ffrT)(\(y Microarray IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Příště Analýza sekvencí □ ö :|= -O^O Techniky manipulující proteiny IVWBioinformatika I -Přednáška 3 ► izolace z buněk ► elektroforeza (dělení podle velikosti) ► zjištování aktivity ► štěpení peptidázami ► určování sekvence ► generování protilátek pro daný protein ► ELISA a podobné testy ► produkce rekombinantních proteinů (např lacZ, GFP) ► krystalizace a určování struktury ► hmotnostní spektrometrie Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonová Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí □ rS1 :|= -O^O SDS-PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovém gelu) Electrode Samples Well Larger „ fragments Smaller fragments Plastic frame — Buffer Electrode IV107Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonovä Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí Sodium dodecyl sulfát denaturuje proteiny a dává vzniklým -= Pole na bázi proteinů Y Y »,„ ,..,,.. , A A irirfi ? ■ ^ <$ # Cafbohytkiile Chip IV107Bioinformatika I -Prednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Syntéza, kopírování a PCF (amplifikace) Příště Analýza sekvencí □ ťlP - -= = ^}Q^ Biosenzory v proteinových čipech □ ö - IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonová Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí :|= -O^O ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ELISA testing of western flower thrips for INI (red color is a postive result) v«e • • •• •• 0*1 >•••© • « v • • • •• » t» •• • • £ r €•••• •• «• C« • • • s Target Protein f Cacture Antibody IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí □ říj - = -^=-0^0" Slovní pojmů molekulární biologie central dogma gene RNA genome ORF transcription DNA gene structure mRNA nucleotide promoter gene expression 375' intron microarray hybridization exon probe replication pro kary ote EST DNA polymerase ATG translation vector GC content codon plasmid eukaryote protein sequence alignment TATA PCR enhancer mass spectrometry DNA sequence silencer signal transduction IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Syntéza, kopírování a PCF proteome restriction enzyme antibody endonudease DNA Proteiny Příště Analýza sekvencí try on western blot phylogenetics □ rS1 :|= -O^O Příště IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Příště Analýza sekvencí Analýza sekvencí □ ö :|= -O^O Outline IVWBioinformatika I -Přednáška 3 Dodatek For Further Reading Dodatek □ g - _= = ^<\(y For Further Reading IV107Bioinformatika I -Prednáška 3 Dodatek For Further Reading X □ gi - _= = ^<\(y