IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonova Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza šěkvěncí amplitikace) venovan DNA Proteiny Katedra informaCních technologií Masarykova Univerzita Brno Jaro 2011 Před týdnem DNA nepřímo (přes proteiny) řídí většinu procesů v buňce. Její struktura vykazuje všechny potřebné rysy. Je nositelem genů. Exprese genů ► transkripce ► translace Struktura proteinů ► primární (sekvence aminokyselin) ► sekundární (a, (3, etc.) ► terciární (3-D) ► kvartérní (makromolekulami komplexy) http://www.molviz.org/ IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Hemoqlobin Chime An introductory presentation suitable (or lectures or individual study. iDiHifcdi. FviUiqU'?:! f HHC Chime The Major Histocompatibility Complex presents peptides from foreign proteins to T DNA Structure Chime -i' infeiirclory level, nonlinear self-paced tutorial, (Paul Win-IE6 Compatible* Antibody Chime An introductory presentation suitable for lectures or individual study, (Deutsch) Lipid BHavers and Membrane Channel Chime Introduces cholesterol and phospholipids, then proceeds to lipid bilayer and the gramicidin membrane channel embedded within the bilayer. Includes molecular dynamics simulations of both gel and fluid membrane states. By Eric MarL> and Angel Herraez. (Espariol) Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonova Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí amphtikace) /enovan DNA Proteiny Molecular Vibrations: IR Spectrum_ Water Chime by Motyka, Lahti S Lancashire. 'Win-IEfi-Compatible' Theoretical simulation of 10 water molecules condensing into a hydrogen-bonded droplet. Includes challenge questions for students, 'Win-IES-Compatible" Lac repressor Chime bending the DNAoperon as it goes from nonspecific to specific DNA binding. Bacterial Flagellar Hook Chime i-.ivih! iI-MtII-' oit Ti i p -1 i 1-:^- ■:■ i-:i :"i n-r 11~Hi H h-i krb lo swim about. The hook acts a molecular universal joint. It's composed of over 100 protein subunits. *Win-IE6-CompatiblB* SchéľTici *1 Přednáška 3 ACGT —I double h&iík ban* pairing RNA strutture regulatory elemenis itfuctufe ol ĽNA& RNA ^- trjní.1 titiori from DNA to prolan transcription mRNA genet h code protein ribmomos Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonová Syntéza, kopírovaní a PCR Příště Analýza šěkvěncí amplirikace) venovan DNA Proteiny SchéľTici 2 Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonová Syntéza, kopírovaní a PCR amino adds have preferred conformations amino adds Proteiny chain of Příště primary amino acids Analýza sekvencí protein structure secondary tertiary c:.ii!i,-!ii,irv multiple folds amplirikace) venovan DNA □ |3 - - .3 = Outline IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a CR (amplifikace) Detekce hybridi DNA Makromolekuly v laboratoři Proteiny Příště DNA Rekombinace DNA a klonovaní Synteza, kopírovaní a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenovaní DNA Proteiny Analyza sekvencí □ Ö - - 4 = ■ot\cv Techniky manipulující DNA a RNA IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Rekombinace DNA a klonování + izolace z buněk + štěpení restrikčními endonukleázami + rekombinace (ligace) + transformace organizmů rekombinantní DNA ► Syntéza, kopírování a amplifikace DNA + syntéza oligonukleotidů + transkripce in vitro + syntéza cDNA amplifikace pomocí PCR ► Detekce, analýza a sekvenace + elektroforéza (dělení podle velikosti) + hybridizace se značenými sondami »- určování sekvence Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Příště Analýza sekvencí Reštrikční endonukleázy enzym zdroj restrikčnf místo fragment[kbp] Alul Arthrobacter luteus AGJ.CT TCtGA 0.3 BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GJ.GATC C C CTAGtG 7.0 EcoRI Escherischia coli R GJ.AATT C C TTAAtG 3.1 Haelll Haemophilus aegyptus GGiCC CCtGG 0.6 Notl Norcadia otitidis-caviarum GC|GGCC GC CG CCGGtCG <9700 Pstl Providencia stuartii C TGCA|G GtACGT C 7.0 Taql Thermus aquaticus TiCG A A GCtT 1.4 Hindlll Haemophilus influenzae Rd AiAGCT T T TCGAiA 3.1 IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny Příště Rekombinace a klonování IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v Rekombinace DNA a klonování IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v Identifikace DNA na agarózovém gelu IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v □ rS1 ~ - V laboratoři IV107 Bioinformatika I -Přednaška 3 PCR (polymerazova řetezova reakce) IV107 Bioinformatika I -Prednaška 3 Makromolekuly v laboratori PCR : Polymerase Chain Reaction 30 - 40 cycles of 3 steps * JT_ t i 1 minut 94 "C ''nrmuTMwriMiTmi Step 2 : annealing 45 seconds 54 °C 1 ^imniwrínmmTOiiiriT^^ ľ s ,. cx„nsion *| f J- - jljllWillllQJumUlMiní' sttpl'"™l I V' sN| O ^ ^ I - I ' X Ll'/^ ''i 7 2 niinuks 72 °C í'm%m 3' uloženo pro budoucí generace jako dlouhý řetězec symbolů A, C, G aT Dobrá zpráva pro budoucnost bioinformatiků: zatím je osekvenováno jenom asi 1000 organizmů, data budou přibývat + Polymorfizmus: Rozdíl mezi jedinci Horno sapiens sapiens 1/1000 bazí + Personál Genomics Project (PGP) Příště Analýza setoencí Sekvence DNA IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinac ► Sekvenace se dělá ve dvou fázích ^.^.^ Proteiny »- Za použití DNA polymerázy a směsi normálních a modifikovaných deoxyribonukleotidů se syntetizují Analýza sekvencí vlákna DNA (imitace replikace), templátem je sekvenovaná molekula DNA + Produkty polymerizace se v automatických strojích chromatograficky dělí podle velikosti a vypovídají o sekvenci ► Jedna reakce podá informaci o 500-1000 bazích Dideoxynukleotid neumožňuje navázání dlaších nukleotidu IV107 Bioinformatika I -Prednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont H H Dideoxylhymiciine tripfrosphate (ddTTP) príšte Analýza sekvencí a PCR Detekce hybndizaci a šekvenovan DNA Proteiny Polymeráza se zastaví při použití ddNTP IV107 Bioinformatika I -PrednáSka 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klone 5' - TPOGCGMftňCGfiTflTÍÍTTCeňCCCTTTň&CTňnif.ňfí 3' - ATCCPCĚíITTGCCaTncnflOCTeíCftpiHCGBTeGCrfl!; PríSte Analýza sekvencí a PCR Detekce hybridizaci a sekvenovan DNA Proteiny tF Sítd trw I nucKsotidcG arosctually didraryT lhán qachrirnnd wilI temnirc*o v - rnťGCGtiiftnciiii in in n cchucij 111 ni>c r mrcbn i - 5' - TflfecefiinflCGMRTSTTcg ne ce n rn uc t* rr - THCbCĚcmncG,rri(iTHTCCBCCĚrir» 5' - TrncĽcc? iirntcc ni [<; n ľíiiíľľí; ri» i1 - TnťSC5ciHnc56ihi(iTicemji:i](- 5' - TfiCSCeCinflCetTflTGTT* S' - rnrr,niLi;f nniir.íiiiríir. £! TFlLGtGGinHCG&lltr' V - tflcstRoiHfiĽSor- S' - Tfiíeceoi- Výsledek automatického sekvenování IV107 Bioinformatika I -PrednáSka 3 Výsledek automatického sekvenování IV107 Bioinformatika I -PrednáSka 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Príšte Analýza sekvencí CG CG <; CCGC GGCG G GGCGGGCCGGG GC GC C CCGC a PCR Detekce hýbndizaci a sekvenovan DNA Proteiny Sekvenace hybridizací je založena na vázání se DNA na destiCku s různými oligonukleotidy IV107 Bioinformatika I -PřednaSka 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont príste Analýza sekvencí :l= -O a. O a PCR Detekce hybridizací a sekvenovan DNA Proteiny Přechod DNA pórem v membráně nitridu silikonu generuje elektrický signál, který by mohl umožnit sekvenování IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klont Příště Analýza sěkvěncí - 3 "S ^)q^o á PCR Detekce hybndizaci a šekvenovan DNA Proteiny Historie sekvenace genomů IV107 Bioinformatika I -PrednaSka 3 Makromolekuly v laboratoři 1975 bakteriofag MS2 DNA Rekombinace DNA a klonování 1977 bakteriofag PhiX174 5,375 bp kopím™™ a pCR 1982 bakteriofag Lambda Detekce hybridizací a sekvenovan DNA 1984 HIV-1 Proteiny Pnstě Analýza sekvencí 1990 virus HCMV 230 Kbp 1995 H. influenzae 1,83 Mbp 1996 E. coli 4,60 Mbp 1996 S. cerevisiae 12,00 Mbp 1998 C. elegans 96 Mbp 2000 D. melanogaster 120 Mbp 2000 A. thaliana 130 Mbp 2001 H. sapiens 3 000 Mbp 2001 M. můscůlůs 3 000 Mbp Microarray IV1O7 Bioinformatika I -Pšednaška S Cancer Cells Normal Cells Combine Targets 1 Hybridize to Mlcroarray Makromolekuly v laboratoši DNA Rekombinace DNA a kloní Príšte Analyza šekvencí a PCR Detekce hybridizací a šekvenovan DNA Proteiny Microarray IV107 Bioinformatika I -Přednaska S Techniky manipulující proteiny IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 ► izolace z buněk ► elektroforéza (dělení podle velikosti) ► zjištování aktivity ► štěpení peptidázami ► určování sekvence ► generování protilátek pro daný protein ► ELISA a podobné testy ► produkce rekombinantních proteinů (např lacZ, GFP) ► krystalizace a určování struktury ► hmotnostní spektrometrie Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonová Syntéza, kopírování a PCR Příště Analýza sekvencí SDS-PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovém gelu) Electrode Samples Well Larger fragments Smaller fragments Plastic frame — Buffer Electrode IV107 Bioinformatika I -Prednaška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonova Syntéza, kopírovaní a PCR prište Analýza sekvencí Sodium dodecyl sulfat denaturuje proteiny a dava vzniklým amphrikace) venovan DNA Proteiny Pole na bázi proteinů IV107 Bioinformatika I -Prednaška 3 Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonova Syntéza, kopírovaní a PCR (arnplifikace) Príšte Analýza sekvencí JE_£_ venovan DNA Proteiny Biosenzory v proteinových cipech IV107 Bioinformatika I -Přednaska S ELISA (enzyme-linked immunošorbent aššay) ELISA testing of western flower thrips for IN! (red color is a postive result) r%m • • • . (:•••• • • > 1 » V f L ■? / 1_, : HRP-Linked Antibody/ t Detect on \ i Ä Jkr ^ Antibody J ^jjfylf. real Capture Antibody IV1Q7 Bioinformatika I -Přednaška S Makromolekuly v laboratoři DNA Rěkombinacě DNA a klonovaní Sýntěza, kopírovaní a PCR (amplifikacě) Dětěkcě hýbridizací a šěkvěnovaní DNA Protěiný Příště Analýza šěkvěncí Slovní pojmů molekulární biologie IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 central dogma gene RNA genome ORF transcription DNA gene structure mRNA nucleotide promoter gene expression 1 375' intron microarray hybridization exon probe replication pro kary ote EST DNA polymerase ATG translation vector GC content codon plasmid eukaryote protein sequence alignment TATA PCR enhancer mass spectrometry DNA sequence silencer signal transduction proteome antibody western blot restriction enzyme endonuclease phylogenetics Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klone Syntéza, kopírování a PCF Příště Analýza sekvencí Příště IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Analýza šěkvěncí Makromolekuly v laboratoři DNA Rekombinace DNA a klonovaní CR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenovaní DNA Proteiny príste Analyza sekvencí Outline IV107 Bioinformatika I -Přednáška 3 Dodatek For Further Reading Dodatek For Further Reading IV107 Bioinformatika I -Prednaška 3 Dodatek For Further Reading X