IV107 Bioinformatika I
Přednáška 3
Katedra informačních technologií Masarykova Univerzita Brno
Jaro 2012
Před týdnem
DNA nepřímo (přes proteiny) řídí většinu procesů v buňce. Její struktura vykazuje všechny potřebné rysy. Je nositelem genů.
Exprese genů
► transkripce
► translace Struktura proteinů
► primární (sekvence aminokyselin)
► sekundární (a, [3, etc.)
► terciární (3-D)
► kvartérní (makromolekulami komplexy)
http://www.molviz.org/
Hemoglobin Chime
An introductory presentation suitable for lectures or individual study.
i['-iir/:l'l. i-"lli.HU*f,i
DNA Structure Chime
An introductory level, nonlinear self-pace tutorial. (Deutsch, Espanol. Portuques)
Antibody Chime
An introductory presentation suitable for lectures or individual study, (Deutsch I
■Wm-IE6-C o inpatibte*
MHC Chime
The Major Histocompatibility Complex presents peptides from foreign proteins to T ( lymphocytes, crucial to disease immunity.
Lipid Bilayers and Membrane Channel Chime
Introduces cholesterol and phospholipids, then proceeds to lipid bilayer and the gramicidin membrane channel embedded within the bilayer. Includes molecular dynamics simulations of both gel and fluid membrane states. By Eric Martz and Angel Herraez. (Espariol)
Molecular Vibrations; IR Spectrum Chi			Water Chime
by Motyka, Lahti 8 Lancashire.	■ t		Theoretical simulation of 10 water molecules condensing into a
			hydrogen-bonded droplet. Includes challenge questions for students,
'Win-IEG-Coinpatible'	YYY		
			-Wln-IEG-Compatlble'
from nonspecific to specific DNA binding,
-Win-IE6-Comr»tlble-
Bacterial flagella are whip-like organelles that bacteria use to swim about. The hook acts as a molecular universal joint. It's composed of over 100 protein subunits.
Schéma 1
regulator
eřements splictng
—I	
	stf ueture of
helix   base pairing	DNA Ä RNA
RNA structure	
exorii
Írom DMA	Uäniŕíitiufi	
to protein       nsí option mRNA	genetk cede	protein
	ribosomes	
Schéma 2
amino acids
amino acids have preferred conformations
evolution
lowenergy state
protein structure
	primary	chain of amino acids
		c-helix
four levels	secondary	p-strand
of Structure		p-turn
		loops
	tertiary folds/domains	
	quaternary i	nuttiple folds
Outline
Makromolekuly v laboratoři
Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny
Analýza sekvencí
niky manipulující DNA a RNA
► Rekombinace DNA a klonování
► izolace z buněk
► štěpení restrikčními endonukleázami
► rekombinace (ligace)
► transformace organizmů rekombinantní DNA
► Syntéza, kopírování a amplifikace DNA
► syntéza oligonukleotidů
► transkripce in vitro
► syntéza cDNA
► amplifikace pomocí PCR
► Detekce, analýza a sekvenace
► elektroforéza (dělení podle velikosti)
► hybridizace se značenými sondami určování sekvence
Reštrikční endonukleázy
enzym	zdroj	reštrikční místo	fragment[kbp]
Alul	Arthrobacter luteus	AGJ.CT TCTGA	0.3
Bam Hl	Bacillus amyloliquefaciens H	GJ.GATC C C CTAGTG	7.0
EcoRI	Escherischia coli R	GJ.AATT C C TTAATG	3.1
Haelll	Haemophilus aegyptus	GGTCC CCTGG	0.6
Notl	Norcadia otitidis-caviarum	GCTGGCC GC CG CCGGTCG	<9700
Pstl	Providencia stuartii	C TGCATG GTACGT C	7.0
Taql	Thermus aquaticus	TTCG A A GCTT	1.4
Hindlll	Haemophilus influenzae Rd	ATAGCT T T TCGATA	3.1
Rekombinace a klonování
Rekombinace DNA a klonování
Identifikace DNA na agarózovém gelu
V laboratoři
httD://www.sme.sk/c/3753490/Genetika-nadei-Dre-Daciento\^.rfín,il
PCR (polymerázová řetězová
reakce)
PCR : Polymerase Chain Reaction
30 - 40 cycles of 3 sieps I »        J I i 1 minul 94 °C
irnrimwniMTwnrT^^
l mi im^Uiujiiui %Ai%j«wui%jA
' ITlMITWirn^TirTWrWrnmTl^^ I   Step 2 : annealing
'iimiiriiiwiimriiFrTTn^^               >. st ,, c„cn4i0„
sj I-?   v   I   „-    ^JIUUJJJ.^LLLiLUlmLUJJllJ-51 '
I V-' L"'l O '     I - I ' x Ll' / "*     1 ' 2 minutes 72 °C
r"TnrhTrf|"liir-riiii«'"        f-  '4 *
3-llJlljJjlMli!^^ (^v_
PCR (polymerázová řetězová reakce)
Third cycle
PCR (polymerázová řetězová reakce)
		Verification of PCR product on agarose or scparidc gci	
	-1857 -1058 -		
			
]kb ;			
300-	- 383		
		ladder         PCR fragments	
PCR (polymerázová řetězová reakce)
Sekvence DNA
► Pořadí nukleotidů ve směru 5' —> 3' uloženo pro budoucí generace jako dlouhý řetězec symbolů A, C, G a T
► Dobrá zpráva pro budoucnost bioinformatiků: zatím je osekvenováno jenom asi 1000 organizmů, data budou přibývat
► Polymorfizmus: Rozdíl mezi jedinci Horno sapiens sapiens 1/1000 bazí
► Personál Genomics Project (PGP)
Sekvence DNA
► Sekvenace se dělá ve dvou fázích
► Za použití DNA polymerázy a směsi normálních a modifikovaných deoxyribonukleotidů se syntetizují vlákna DNA (imitace replikace), templátem je sekvenovaná molekula DNA
► Produkty polymerizace se v automatických strojích chromatograficky dělí podle velikosti a vypovídají o sekvenci
► Jedna reakce podá informaci o 500-1000 bazích
Dideoxynukleotid neumožňuje navázání dlaších nukleotidů
(pXEKE)—?5 o Tbvmine
H H
Dideoxythymidine triphosphate (ddTTP)
Polymeráza se zastaví při použití ddNTP
DH*. Po      íss ivhíí th» Uaurlsis Urtíid snů1 sřnthusiřft a n*w f »:ond sírami Iv r i.-f i. a
III i: li i:.....il ntihc TTC6BC-CÍ ITTflfteT HCCGII^Hh *
s1 ■ cite; esce n r t G-ccnrncnnnc t gi; cn nu tc en ri: iíc t ■ilSfiaSTÍ: rn n
IF SXt* ttw T nucksptidw aroactually ídfiSffiíLlheowcN strand wilItpmiliwiUi
i' ■	■ flÍC6ťCi(j|rtnCS6Tf)T61TC(iflCC6nf(iĎCt(iCĚIJflt-
J' -	■ TflCSCSOTflflCEOTBTSTTCeflCteITIfl Kr»
5 1	■   THfGCGCTnflCGGTRTDl TCCBCrfiTT I-
S' ■	'   THi'DCGGTnHCHGTfll{i I tCEJICLUN*
i> ■	■ THĽtji;scmňCG6iRi&íic6nccei-
	■ TflC6CS0TflflCS6I0T8TT*
í' ■	■ riiřiii:r.n:nrii:r.iiiiiri;i«
s> ■	■ THFECECTnHCECTnTi
v	111ĽUFU-US IIHťCJli 1-
	.........- -
Výsledek automatického sekvenování
Výsledek automatického sekvenování
40 50 60 70 BO 90
TÄ!G rCG Alt; STTTřCřCGCATG TG C TG AAAGTTG GC GGTGCCGG AG TGC GC XCAC C G C
Sekvenace hybridizací je založena na vázání se DNA na destičku s různými oligonukleotidy
Přechod DNA pórem v membráně nitridu silikonu generuje elektrický signál, který by mohl umožnit sekvenování
Historie sekvenace genomů
1975	bakteriofag MS2	
1977	bakteriofag PhiX174	5,375 bp
1982	bakteriofag Lambda	
1984	HIV-1	
1990	virus HCMV	230 Kbp
1995	H. influenzae	1,83 Mbp
1996	E. coli	4,60 Mbp
1996	S. cerevisiae	12,00 Mbp
1998	C. elegans	96 Mbp
2000	D. melanogaster	120 Mbp
2000	A. thaliana	130 Mbp
2001	H. sapiens	3 000 Mbp
2001	M. musculus	3 000 Mbp
Microarray
Cancer Cells Normal Cells
"R*d Fluorescent" Targets "Green Fiiiöieseam" Tai-göta
Combine Targets	
Hybridize tö	
Microarray	
Microarray
Techniky manipulující proteiny
izolace z buněk
► elektroforéza (dělení podle velikosti)
► zjišiování aktivity
► štěpení peptidázami
► určování sekvence
► generování protilátek pro daný protein
► ELISA a podobné testy
► produkce rekombinantních proteinů (např lacZ, GFP)
► krystalizace a určování struktury
► hmotnostní spektrometrie
SDS-PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovém gelu)
Pole na bázi proteinů
#	
i i	
	
	
	
" mTi ■ j-J ir 111 f': ■ I.
JE_£_
% %
Biosenzory v proteinových čipech
a □ ►   4 (5? ►   4 š ►   < -Š ►   -šl= -O^O
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Slovní pojmů molekulární biologie
central dogma	gene	RNA
genome	ORF	transcription
DNA	gene structure	mRNA
nucleotide	promoter	gene expression
375'	intron	microarray
hybridization	exon	probe
replication	prokaryote	EST
DNA polymerase	ATG	translation
vector	GC content	codon
plasmid	eukaryote	protein
sequence	alignment	TATA
PCR	enhancer	mass spectrometry
DNA sequence	silencer	signal transduction
proteome	antibody	western blot
restriction enzyme	endonuclease	phylogenetics
Analýza sekvencí
Outline
For Further Reading
x