Molekulární biologie pro informatiky - 3 Replikace genomu, reparace a rekombinace DNA Replikace DNA Schopnost buňky přežít a množit se závisí na přesném zdvojení genetického materiálu. K replikaci DNA musí dojít před rozdělením buňky, aby mohly vzniknout dvě dceřiné, geneticky identické buňky. Při každém dělení musí buňka zkopírovat svůj génom s mimořádnou přesností a dostatečnou rychlostí. Replikace DNA je umožněna párováním bází. Komplementarita řetězců v dsDNA umožňuje, aby po separaci řetězců sloužil každý z nich jako templát pro syntézu nového vlákna. Templátový řetězec S Řetězec S a g t t c a T T H H I t I I I I Nový řetězec S' Řetězec S' 5' Původní dsDNA Nový řetězec S CaTTgCCagT ttt mm ^\ mm H| Ba n g y a a £' g g j 'c a 3 MmVMmVMmVMm\.Mm\MtMm\MmVMmV^mV. 5' Templátový řetězec S' 1 Replikace i í 1 í ^ Replikace iiíi 1111 X A X >xRepllkace 44444444 11111111 http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Replikace DNA Probíhá ve třech fázích 1. iniciace - zahájení replikace (ori), vazba replikačních proteinů, tvorba replikační vidlice 2. elongace - syntéza řetězce DNA 3. terminace - zakončení replikace daného replikonu Počátek replikace (místo ori) • specifická sekvence DNA, na které se zahajuje její replikace • sekvence bohatá na AT páry rozpoznávána iniciačními proteiny • vazba iniciačních proteinů narušuje vodíkové vazby mezi řetězci dsDNA • do otevřené struktury dsDNA se váží proteiny zodpovědné za vlastní replikaci DNA • přítomno na každém replikonu • u bakterií lx na chromozomu • u člověka ~ lO.OOOx na jaderné DNA, v průměru 220x na chromozom http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf místo ori T 5' / S—— 3' 3--\_/-* jednořetězcová oblast templátové DNA Replikace DNA Replikační vidlice • struktura ve tvaru „Y" kterou má DNA během své replikace • při dvousměrné replikaci se vytvoří dvě vidlice, které se pohybují v opačných směrech od místa ori • rychlost pohybu - bakterie ~ 1000 nukleotidů / s DNA polymeráza • tvorba nové DNA za využití jednoho z původních řetězců jako templátu • katalyzuje připojení nukleotidů k 3'konci rostoucího řetězce DNA • tvorba fosfodiesterové vazby mezi dNTP a DNA http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Replikace bakteriální chromozómové DNA DNA-polymerázy • DNA-dependentní-DNA-polymerázy, 5'->3' polymerace • vyžadují přítomnost primeru (DNA či RNA) 1. DNA-polymeráza I (Kornbergův enzym) • DNA-primer, 10 nukleotidů/s, 5'-3' a 3'-5' exonukleázová aktivita • odstranění RNA-primerů, syntéza DNA mezi Okazakiho fragmenty, opravy DNA 2. DNA-polymeráza II • polymerázová a 3'-5' exonukleázová aktivita, záložní polymeráza, opravy DNA PBPH^^HPHPB- OH llil".! DNA-polymeráza III RNA-primer, oligomerní protein katalytické jádro (a, 6, e) - 8nukleotidů/s, 3'-5' exonukleázová aktivita spojeny v dimer (t) - 20 nukleotidů/s, procesivní pro 11 nukleotidů (3-svorka - stabilizuje úseky dsDNA čímž mnohonásobně zvyšuje procesivitu dimeru y-komplex (y266'i|jx) - nakládá (3-svorku na DNA v místech RNA-primerů 500 nukleotidů/s, procesivita pro celu molekulu DNA replikace DNA, opravy DNA http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf http://www.nature.com/nrm/journal/v3/n5/fig_tab/nrm804_F4.html Replikace bakteriální chromozómové DNA DNA-helikázy • odvíjení komplementárních řetězců v dsDNA • při replikaci se uplatňují DnaB-protein a n'-protein DNA-gyráza • topoizomeráza II • před replikační vidlicí mění kladné nadšroubovicové závity na záporné a s DNA-helikáza 8 J Nadšroubovice DNA DNA-gyráza DNA-primaza • DNA-dependentní-RNA-polymeráza, syntéza RNA-primerů - i................. 5' / 3' Řetězec DNA llllll I 3' RNA-primer 3'ho Primáza .......... 3' DNA-ligáza • ligace polynukleotidových řetězců • spojení Okazakiho fragmentů ATP aíWpXp) \ 3'oh a@(^® ^ ^ a p Šli?/ '-^ ttU2?--^ f* 1 Templátová DNA amp http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Semikontinuální syntéza dsDNA při replikaci Vedoucí DNA řetězec • syntetizován kontinuálně na matricovém řetězci orientovaném 3'->5' • jeden RNA-primer v místě ori Opožďující se DNA řetězec • syntetizován diskontinuálně přes Okazakiho fragmenty na matricovém řetězci orientovaném 3'->5' • RNA-primer pro každý Okazakiho fragment • RNA-primery odbourány od 5'-konce • prodloužení Okazakiho fragmentů syntézou na 3'-konci a jejich spojení do souvislého řetězce DNA Oba nové řetězce DNA syntetizuje jedna molekula DNA-polymerázy III Obousměrná replikační vidlice http://www.bio.miami.edu/tom/courses/bil255/bil255goods/09_dna.html http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Iniciace replikace Počátek replikace oriC -245bp -13 bp tandemová repetice: bohatá na AT páry - 9 bp repetice: vazba DnaA DnaA - rozeznává oriC a převádějí jej do otevřené formy DnaB - helikáza, vazba z obou stran na otevřený úsek DNA - odvíjení dsDNA za vzniku replikačních vidlic SSB-proteiny - vazba na jednořetězcové úseky 13 bp - GATCTNTTNTTTT 9 bp - TTATNCANA i i i /r \ \ m i i m......Hiiiiiiiiiiiii nu nu nn mr -1-- ■-1- 13 bp repetice 9 bp repetice Vazba a akumulace DnaA Ohyb DNA Separace DNA řetězců V I Odvíjení dsDNA 1 Tvorba replikačních vidlic www.studyblue.com http://reasonandscience.heavenforum.org/tl849-dna-replication-of-prokaryotes Elongace replikace syntéza obou dceřiných DNA řetězců vyžaduje RNA-primer u vedoucího DNA řetězce jeden RNA-primer na počátku replikace u opožďujícího se DNA řetězce je RNA-primer na začátku každého Okazakiho fragmentu primozom = komplex DnaB s navázaným proteinem DnaG, DNA-primázou tvořící RNA-primery Koordinace syntézy obou DNA řetězců ve směru replikační vidlice • umožněna ohybem DNA a strukturou DNA-polymerázy III • katalytická jádra DNA-polymerázy III umístěna každé na jednom matricovém DNA řetězci • y-komplex umístěn asymetricky, opakovaně nakládá (3-svorky na opožďující se řetězec • pohyb katalytického jádra DNA-polymerázy III mezi jednotlivými (3-svorkami B-svorka katalytické jádro nově vytvořená DNA RNA-primer nový Okazakiho fragment / ^T^J opožďující se ^__^^) řetězec SSB-protein RNA-primer ; jádro B-svorka DnaB DnaG SSB primer^ 5' B-svorka katalytické jádro www.studyblue.com http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf katalytické jádro Elongace replikace Vazba DnaA do místa oriC Odvinutí dsDNA Vazba DnaB, která pokračuje v odvíjení dsDNA DNA-gyráza uvolňuje napětí tvorbou záporných nadšroubovcových závitů SSB-proteiny udržují řetězce DNA oddělené a přístupné replikace Vytvoření replikační vidlice Initiator s prutem ^ ^ Origin s Parental DNA □HA gyr-ase [topoisom erase) Tvorba souvislého řetězce z Okazakiho fragmentů DNA-polymeráza I - postupuje za DNA-polymerázou III - odbourává z 5'-konců RNA-primery - na 3'-konec předchozího Okazakiho fragmentu napojuje dNTP DNA-ligáza - spojuje doplněné fragmenty Vazba DnaG a syntéza RNA-primeru na vedoucím řetězci DNA-polymeráza III syntetizuje vedoucí řetězec OOG: Leading \ strand DNA DNA polymerase III Tvorba RNA-primeru na opožďujícím se řetězci DNA-polymeráza III syntetizuje opožďující se řetězec Lagging strand Tvorba dalších RNA-primerů na opožďujícím se řetězci DNA-polymeráza III syntetizuje Okazakiho fragmenty DNA-polymeráza I odstraňuje RNA-primery a zaplňuje jejich místo DNA , DNA polymerase I removing primer m_00000 * 1 Dkazaki fragmentmi 1 r2 □NA polymerase I DNA-ligáza spojuje přilehlé Okazakiho fragmenty do souvislého řetězce DNA ligase Primase OOP / .: - - r DMA polymerase 111 5' 3'- Terminace replikace • replikace bakteriálního chromozomu končí na specifických sekvencích = terminátor replikace, ter • vazba specifických proteinů, které inhibují DnaB a zastavují tvorbu replikační vidlice • funkce topoizomerázy typu II při oddělení vzniklých chromozomů 100 ,(/m academic.pgcc.edu faculty.samford.edu www.brighthubeducation.com schaechter.asmblog.org Replikace plazmidové DNA Replikace plazmidů otáčivou kružnicí • rozlišení pozitivního (+) a negativního (-) řetězce • začíná v místě ori, kde Rep-protein štěpí (+) řetězec • vzniklý 3'-konec je prodlužován, (+) řetězec je vytlačován • po dokončení kružnice štěpí Rep-protein (+) řetězec mezi původní a novou DNA • volné konce řetězců spojeny DNA-ligázou • vzniká (i) kružnicová dsDNA (původní (-) a nový (+) řetězec) (ii) kružnicová ssDNA (původní (+) řetězec), který se dosyntetizuje přes Okazakiho fragmenty Replikace konjugativních plazmidů během konjugace • interakce pilusu donorové buňky s recipientní aktivuje endonukleázu, která štěpí místo ori • replikaci otáčivou kružnicí, vytlačovaný (+) řetězec přestupuje do recipientní buňky • (-) řetězec zůstává v donorové buňce a syntéza na něm probíhá kontinuálně • původní (+) řetězec se v recipientní buňce dosyntetizuje přes Okazakiho fragmenty F plasmid Bacterial chromosome www.studyblue.com http://thegeneticsofvirusesandbacteria.weebly.com/diagrams.html Replikace chromozómové DNA u eukaryot Podobné rysy jako u replikace bakteriálního chromozomu: • semikonzervativní a semikontinuální způsob replikace • organizace replikační vidlice • analogní sestava replikačních proteinů • fáze iniciace, elongace a terminace Odlišnosti od replikace prokaryot: • replikace DNA omezena do S-fáze buněčného cyklu • přítomnost nukleozomů • mnohonásobná místa počátku replikace • problém s doreplikováním konců lineární molekuly DNA Počet _ . Velikost Rychlost syntézy DNA „, . . Druh ... .., , . . počátku genomu (bp) (kbp/min) ... replikace 011 011 on ▼ on ort on E. coli 4,6 x 106 30 1 S. cerevisiae 1,4 x 107 3 330 D. melanogaster 1,8 x 108 2,6 3.500 Mus musculus 2,5 x 109 2,2 25.000 Horno sapiens 3,2 x 109 3 >10.000 ? i + sphweb.bumc.bu.edu http://www.authorstream.eom/Presentation/M Replikace chromozómové DNA u eukaryot DNA-polymerázy u eukaryot nalezeno nejméně 13 druhů 3 nezbytné pro replikaci DNA opravy DNA replikace mitDNA funkce neznámá y t, k, n, - DNA-polymeráza a • tetramer, dvě podjednotky fungují jako RNA-primáza • tvorba RNA-primerů a části Okazakiho fragmentů • mírná procesivita, 5'-3' exonukleázová aktivita DNA-polymeráza (3 • monomer, syntéza krátkých řetězců při reparaci DNA • nízká procesivita, 5'-3' exonukleázová aktivita DNA-polymeráza y • dimer, syntéza mitochondiální DNA • vysoká procesivita, 5'-3' a 3'-5' exonukleázová aktivita DNA-polymeráza 6 • interakce s proteiny RCF a PCNA • dokončení syntézy Okazakiho fragmentů • vysoká procesivita v asociaci s PCNA-proteinem, 5'-3' a 3'-5' exonukleázová aktivita DNA-polymeráza £ • úzce souvisí s 6, hlavní polymeráza pro syntézu vedoucího řetězce Iniciace replikace Replikační počátky po 1 - 300 kbp • u nižších eukaryot (kvasinky) specifické sekvence (ARS) dlouhé 100 - 200 bp • savčí chromozomy bez specifických sekvencí, zóny bohaté na AT páry dlouhé 500 - 50.000 bp Pre-iniciační komplex • sestaven v Gl fázi buněčného cyklu • replikační počátek rozeznán proteinem ORC • vazba CDC6 a CDT1 • společně umožňují vazbu komplexu MCM2-7 Při vstupu do S-fáze jsou složky pre-iniciačního komplexu fosforylovány, což vede k uvolnění již nepotřebných složek a k aktivaci MCM2-7. Iniciační komplex • Mcm2-7 spolu s dalšími proteiny (CDC45, GINS) plní funkci DNA-helikázy a odvíjí DNA • zároveň do replikační vidlice váží DNA-polymerázy Výsledkem iniciace je založení replikační vidlice v počátcích replikace a vazba proteinů, které se budou účastnit elongační fáze replikace. https://en.wikipedia.org/wiki/Euka ryotic_DNA_replication#/media/File: Pre-replicative_complex.JPG Gl lh r.icr.is ORCs r.icr.is 4 D Ks _,— DDKs T Gl ORCs y/ Elongace replikace Vedoucí řetězec • jediný primer vytvořený DNA-polymerázou a, jejíž součástí je primáza • RCF-protein nakládá PCNA na konec RNA-primeru • PCNA-protein vytěsňuje DNA-polymerázu a • zvyšuje procesivitu DNA-polymerázy e, která se na něj váže a syntetizuje DNA Opožďující se řetězec 5 • jednořetězcové úseky pokryty proteinem RPA • syntéza zahájena DNA-polymerázou a • ta vytvoří RNA-primer (10 nt) a část DNA Okazakiho fragmentu (10-20 nt) • vytlačena proteinem PCNA • RNA-primery odstraňuje z 5'-konce RNázaH • Okazakiho fragmenty dokončeny DNA-polymerázou 6 a spojeny DNA-ligázou 3' 5' www.leibniz-fli.de Složky bakteriálního a eukaryotického replizomu Funkce Bakterie E u kary ota Rozpoznání orí DnaA ORC Vazba helikázy k DNA DnaC CDT1, CDC6 Helikáza DnaB MCM komplex Relaxace DNA DNA-gyráza Topoizomeráza II Ochrana ss řetězců SSB RPA Primáza DnaG Polet Syntéza vedoucího řetězce Pol3 Pole Syntéza opožďujícího se řetězce Pol3 Polet, Polo Posuvná svorka B-svorka PCNA Nakládání svorky y-komplex RCF Odstranění RNA-primeru Poli RnázaH Dokončení Okazakiho fragmentů Poli Polo Spojení Okazakiho fragmentů DNA-ligáza DNA-ligáza Terminace replikace Problém zakončení replikace lineárních dsDNA • po odstranění RNA-primeru na 3'-konci matricového řetězce pro opožďující se řetězec vzniká prázdné místo, které nemůže DNA-polymeráza zaplnit, protože nemá na co napojovat dNTP • bez strategie, jak tento úsek doreplikovat by docházelo ke zkracování chromozomů a ztrátě Gl Telomery • konce eukaryotických chromozomů, které je chrání před degradací • druhově specifické telomerické sekvence • vazba telomerázy, která udržuje jejich délku • u buněk bez telomerázy dochází ke zkracování telomer (-50-150 bp/dělení) • senescence či smrt buněk po zkrácení telomer pod kritickou hranici • telomery jsou rozeznány jako skutečné konce chromozomů a buňka je dokáže odlišit od dvou-řetězcových zlomů uprostřed chromozomů dna polymerase Lead.ng strand Sliding clamp. Lagging strand l^>#>ař^^,''lllimimUl!!L Helicase I'' 5' 3' iiiuimiiiiiiiimiiii 5' Primase / rna primer <>|!llllllllllllllll dna polymerase Mllllllllllillll 5' , 3»' J^lli^B^lli^^^ 3' http://www.uic.edu/classes/bios/bioslOO/lectures/dna.html med.stanford.edu Terminace replikace Telomeráza • umožňuje dokončit syntézu dceřiných řetězců na 3'-koncích matricové DNA • ribonukleoproteinový komplex složený z (i) RNA - působí jako templát - sekvence komplementární k telome-rickým sekvencím (ii) RNA-dependentní-DNA-polymerázy • ke konci replikace se přes RNA složku váže k přečnívajícímu 3'-konci DNA • tento konec využívá jako primer a podle RNA matrice ho prodlužuje o telomerické sekvence • syntéza tandemových repetic je zajištěna translokací telomerázy podél vznikajícího řetězce • na prodlouženém 3'-konci vytvoří replikační enzymy další Okazakiho fragment a původní délka chromozomu je zachována • přítomna v zárodečných buňkách, nepřítomna v somatických buňkách • reaktivace v nádorových buňkách Missing DNA on 15' lagging strand Telomerase with its own RNA template DNA polymerase ^1' ' _ff a a u c c c 5 ILilllMMJIII '— Sliding clamp http://www.uic.edu/classes/bios/bioslOO/lectures/dna.htm Terminace replikace Ochrana přečnívajících 3'-konců chromozomů • telomerické sekvence se ohýbají a vytvářejí strukturu telomerické smyčky (T-smyčka) • ssDNA na konci řetězce se zanořuje do dsDNA úseku a tvoří trojvláknovou strukturu (D-smyčka) • celou strukturu stabilizuje komplex proteinů = shelterin - u lidíTRFl, TRF2, TIN2, POTÍ, TPP1, RAPI - vazba na ss či ds úseky DNA, ochrana před endonukleázami - potlačení opravných mechanismů DNA, regulace telomerázy TPP1 D-loop Replikativní senescence • způsobena zkrácením telomer a rozpadem T-smyčky • buňky zastaví růst, vstoupí do senescence nebo spustí apoptózu • brání tak nestabilitám v genomu a vývoji nádorů • telomery by byly rozeznány jako poškození DNA • odhalené konce by mohly vést k fúzi chromatid či chromozomů www.researchgate.ne www.ch.ic.ac.uk Nukleozomy během replikace Během Gl a S fáze buněčného cyklu jsou syntetizovány histony nutné pro zdvojení nukleozomů během replikace DNA. Teoretické způsoby využití původních a nových histonů v dceřiných nukleozomech ■ ,Lehké" médium, Replikace Izolace oktamerů Izolace oktamerů J_ Centrifugace I J_ n Jeden pruh, oktamery Centrifugace -í- Široký pruh, r oktamery se směsí ;«~ s „těžkými" AK starých a nových histonů („těžké", „lehké" AK) Recyklace H3-H4 H3-H4 j:___ nukleozomy se během replikace rozpadají rychlé opětovné sestavní nukleozomů po replikaci na umístění histonů do nových nukleozomů se podílí faktor CAF-1 za pomoci ASF1 nové oktamery jsou náhodnou směsí původních a nových histonů http://www.jbc.org/content/280/13/12065.full http://www.nature.com/nsmb/journal/v22/n8/full/nsmb.3067.html?WT.ec_id=NSMB-201508&spMailinglD=49254359 Replikace mitochondriální DNA u eukaryot Replikační vidlice mitochondriální DNA RNA pel 1 3" vmtSSB mtSSB mtSSB Poly Twihkle _ n„ _Helicas£ P55 Topo i opouomerase kružnicová dsDNA z těžkého (H) a lehkého (L) řetězce každý řetězec obsahuje své místo ori D-smyčka: oblast vytěsnění H-řetězce vazba primeru párujícího se s L-řetězcem od primeru začíná syntéza nového H-řetězce za současného vytěsňování řetězce původního po uvolnění místa oriL začíná syntéza nového L-řetězce http://www.niehs.nih.gov/research/atniehs/labs/gisbl/pi/mdnar/indexxfm http://slideplayer.com/slide/4088377/ genesdev.cshlp.org Přesnost replikace DNA Chybovost DNA-polymerázy je jedna chyba na každých 107 bází. Přesnost replikace DNA zajištěna komplementárním párováním bází a vlastnostmi DNA-polymerázy: (i) přednostní připojení nukleotidů se správným párováním (ii) odstranění chybně připojeného nt procesem zvaným proofreading Proofreading • kontrolní čtení, které probíhá během syntézy DNA • kontrola správného párování začleněných nukleotidů • špatně začleněný nukleotid odstraněn 3'-5' exonukleázovou aktivitou DNA-polymerázy • polymerační a korekční aktivita DNA-polymerázy zajištěna různými katalytickými doménami enzymu • podmíněn syntézou DNA řetězce ve směru 5'-3' DNA-polymeráza \ Tem plátový 3í řetězec 4 /■- Připojení chybného nukleotidu Odstranění chybného nukleotidu "illll ■ ■ Správně párovaný 3'-konec umožňuje připojení dalšího nukleotidu "Ilill :3' 4 I ■ 5' http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf http://reasonandsc Molekulární podstata mutageneze • zachování genomu buněk vyžaduje - přesnost replikace DNA - schopnost opravit poškozenou DNA • genom buněk je poškozován jak reaktivními molekulami pocházejícími z buňky tak vnějšími vlivy • i přes opravné mechanismy dochází ke vzniku mutací • mutace jsou dědičné změny genotypu, jejichž molekulární podstatou jsou nu-kleotidové substituce, delece a inzerce Substituce • výměna nukleotidu • tranzice: výměna purinové báze za purinovou či pyrimidinové za pyrimidinovou • transverze: výměna purinové báze za pyrimidinovou či naopak Substituce -J- Inzerce —T— Delece —*— synonymní substituce: vznik kodónu se stejným smyslem AAG (Lys) —> AAA (Lys) nesmyslná mutace: vznik terminačního kodonu AAG (Lys) —> TAG (STOP) neutrální substituce: změnou aminokyseliny se nemění konformace peptidového řetězce AAG (Lys) —> AGG (Arg) mutace měnící smysl kodonu AAG (Trp) —> ACG (Thr) www.bbc.co.uk Molekulární podstata mutageneze Delece, inzerce • ztráta / vložení jednoho nebo více nukleotidů • posunové mutace: změna čtecího rámce DNA 3' |ir /A > n u jf ľ\ /A /.\ (»• (»7 in /A 'i itls' jednonukleotidová inzerce trinukleotidová delece Extra A 3' I1' '- ľ Mr /,\ A\ jej u ir n (c'i l.f) n /.\ /A|3- 5' Extra U AUGUAAGUUUGGCUAA 3' 3' 5' 5' __ missing 13' G G C Q missing A U G A A G U U|G G C U A A ■3' missing TACAAACCGATT ATGTTTGGCTAA missing I 11 1 Stop AUGIUUUGGCUAA Stop Standardní alela: převládá v populaci, funkční Mutantní alela: alela vzniklá mutací, její četnost v populaci nepřesahuje 1 %, nemusí být funkční Spontánní mutace: vznikají bez účinku mutagenu Indukované mutace: vyvolané mutagenem Mutagen • fyzikální nebo chemické agens vyvolávající mutace • působí genotoxicky, poškozují genotyp • promutagen není přímo mutagenní, metabolickou aktivací přeměněn na mutagen http://www.slideshare.net/kristenw3/mutations-13330478 Spontánní mutace Pokud není chybné párování bází opraveno, dochází při dalších replikacích k fixaci mutace. První replikace Mutantní molekula j q j Standardní molekula Druhá replikace t (c; t Standardní molekula t g t_ Standardní molekula Chybné páry bází mohou vzniknout během replikace díky chemickým vlastnostem bází a těmto dějům: 1. Tautomerní změny bází • stabilní tautomery podléhají Watson-Crickovu párování • přechodné tautomery mohou tvořit páry AC, GT • frekvence výskytu 10~4 - 10~5/ na nukleotid a replikační cyklus Tymin KETO forma ENOL forma N H O OH Cytozin AMINO forma IMINO forma H Guanin KETO forma NH N H Adenin AMINO forma N' [j ENOL forma NH2 N H IMINO forma https://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Nucleic_Acid/Nitrogenous_Bases Spontánní mutace 2. Kolísa vo st párování bází • uplatňuje se při čtení genetického kódu, ale může se vytvořit i při replikaci • vznik párů CT, G A, TG 3. Depurinace a depyrimidinace • přerušení glykosidické vazby mezi bází a cukrem, následná ztráta báze, vznik AP místa • po replikaci může vzniknout substituce (přednostně A) či delece • několik tisíc událostí / den v genomu savců • depurinace častější Mutantní molekula biotechkhan.wordpress.com http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf www.mun.ca Spontánní mutace 4. Deaminace Cytozin H jsrT .1. Uracil + Adenin GC —> AT Adenin Guanin A O 4II N H Hypoxantin Xantin + Cytozin blok replikace DNA AT —> GC 5. Inkorporace uracilu do DNA • místo tyminu • během replikace účinně odstraňován uracil-DNA-glykosylázou • volné dUTP odbourávány dUTPázou • dUMP vzniká z dCMP, a využívá se pro biosyntézu dTMP, při inhibici této biosyntézy roste pravděpodobnost, že se uracil zařadí do DNA 6. Oxidatívni poškození DNA • vyvolává především hydroxylový radikál (OH*) • 8-oxodeoxyguanozin (8-OxodG) se přednostně se páruje s A • tyminglykol zastavuje replikaci CH thymine o UV IR oxidative damage thymine glycol o HO" no dR oxidation guanine 8-oxoguanlne N-H- 8-oxoG (G0):C 8-oxoG fcO)A www.mdpi.com Indukované mutace - chemomutageny Analogy bází • purinové a pyrimidinové deriváty • strukturálně podobné bázím, inkorporace do NK • např. 5-brómuracil: analog tyminu, AT —> GC Br -H-N R O *1 Br O-H---O 5-BrU (keto) Adenine N---H-N M >=N R O---H-N H 5-BrU (eriol) Guanine Kyselina dusitá (hn02) • oxidatívni deaminace bází, AT <- • vznik v žaludku z NaNO. ■>GC H NH2 c—AT Hydroxylamin • reaktivita s C • vznik hydroxyamino skupiny, párování s A, GC —> AT -H N X. k / C'i http://slideplayer.com/slide/2816043/ https://en.wikipedia.org/wiki/5-Bromouracil wiki.chemprime.chemeddl.org pubs.rsc.org Indukované mutace - chemomutageny Alkylační látky • alkylace nukleofilních center bází DNA, atomy dusíku a kyslíku • jednofunkční-jedna reaktivní skupina, alkylace bází mění jejich párování - př. ethylmetansulfonát (EMS) -H—N N-H—/ ^ N—H-/ H,C —CH, M O O CH3 H3C—CH2—O—S—CH3 EMS Guanine Cytosine / H 06-ethylgjanine Thymine "A ,CH3 S , el Thymine Adenine HsN* Cytosine Guanine dvojfunkční - dvě reaktivní skupiny, tvoří křížové vazby mezi dvěma nukleofilními centry - zástava replikace DNA, využití v chemoterapii - př. yperit (hořčičný plyn) yperit cisplatina Cl—CH2—CH2 \l— CH3 / Cl CH2—CH2 Cl NhL \ / 3 Pt ✓ \ Cl NhL H2N HjC—N—CH, I I 0 HjC CH2 O n n^ ^ n ' DNA DNA NH2 H3N NH3 \ / H2N' N K N' ^N' "NH2 H3M -G-G- Pt(ll) NH, -G-G- H3N NH3 \ / A -G-G- Indukované mutace - chemomutageny Psoraleny • planární tricyklická konfigurace, interkalace mezi sousední nukleotidy v dsDNA, posunové mutace • fotoreaktivace UVA světlem vede k tvorbě monoaduktů a křížových vazeb na DNA, zástava replikace Interkalace Monoadukt Křížová vazba DNA Monoadukt Křížová vazba Polyaromatické uhlovodíky • interkalace do dsDNA, metabolickou aktivací vznikají epoxidy, které tvoří monoadukty s DNA • př. benzo(a)pyren DNA http://www.google.com/patents/US6187572 http://www.nature.com/bmt/journal/v33/nl/fig_tab/1704284f2.html https://www.researchgate.net/figure/49739612 Indukované mutace - promutageny Promutageny jsou samy o sobě neškodné. Vyžadují metabolickou aktivaci, aby se staly mutageny. Benzo(a)pyren • produkt nedokonalého spalování • uhelný dehet, výfukové plyny, cigaretový kouř, grilované maso • vznik epoxidů tvořících adukty s DNA 2-acetylaminofluoren (AAF) • původně vyvinut jako insekticid • vznik N-hydroxy-2-aminofluorenu tvořícího adukty s DNA • nádory jater, močového měchýře, ledvin Aflatoxiny • mykotoxiny produkované plísněmi rodu Aspergillus • kontaminované potraviny (obilniny, olejniny, koření, ořechy) • vznik aflatoxinu M1 jeden z nejsilnějších jaterních mutagenů Dusičnany, dusitany • hnojiva, potravinové konzervanty; potraviny rostlinného i živočišného původu • vznik nitrosaminů, které modifikují báze DNA a mění jejich párování http://pubs.rsc.org/is/content/articlehtml/2015/tx/c4tx00126e JV-Hydroxy-2-AAF Indukované mutace - fyzikální mutageny Rostoucí vlnová délka a klesající energie Ionizující záření • záření s dostatkem energie pro ionizaci atomů a molekul ozářené látky • gama záření, paprsky X, část UV záření • vyvolává vznik modifikovaných bází, křížových vazeb a jednořetězcových i dvou řetězcových zlomů DNA 0,0001 nm 0,01 nm 10 nm 1000 nm 0,01 cm 1 cm 1 m 100 m Paprsky gama Rentgenovo záření UV Infračervené zářen! Mikrovlny Rádiové vlny —'---~~ Viditel né světlo 400 nm ■ • i i 500 nm -i i i | i 600 nm i ' 1 700 nm Ionizující záření Neionizující záření (i) nepřímý účinek (65 % poškození) - ionizace vody a vznik vysoce reaktivních radikálů - modifikace bází: hydroxylace, deaminace, demethylace H20—*H20* (excitovaná)—► H + OH H20—>H20++e-H2O^H++ OH-e+H20—>H20-e" + 02—-.02 •H + OH" (ii) přímý účinek (35 % poškození) - absorpce energie molekulou DNA, která se ionizuje a dochází ke štěpení vazeb a zlomům DNA - př. ozáření dávkou 1 Gy vyvolá v buňce 15 - 60 ds zlomů, > 1000 ss zlomů ds zlom http://slideplayer.cz/slide/1968755/ http://labguide.cz/fluorochromy/ 2012.igem.org teachnuclear.ca Indukované mutace - fyzikální mutageny Ultrafialové záření • nižší energie a specifičtější účinek než ionizující záření, absorpční maximum bází při 254 nm (i) zvýšení frekvence spontánních mutací - zachycená energie excituje atomy, které se stávají reaktivnější a přecházejí do tautomerů (ii) tvorba pyrimidinových dimerů - dimerizace dvou sousedních pyrimidinových molekul na stejném řetězci DNA - kovalentní spojení přes cyklobutanový kruh či (6-4) pyrimidinové fotoprodukty - porušují strukturu DNA a narušují replikaci - nejčastěji tyminové dimery o. earthobservatory.nasa.gov kb.osu.edu Opravy poškozené DNA Ionizující záření Kyslíkové radikály Alkylační činidla Spontánní mutace U V záření Polyaromatické uhlovodíky Ionizující záření cis-platina Replikační chyby Uracil v DNA A P místo 8-OxodG ss zlom Tyminovýdimer (6-4) fotoprodukt Adukty s bázemi Křížové vazby ds zlomy Substituce Inzerce Delece Zástava buněčného cyklu Inhibice transkripce, replikace, segregace chromozómů Mutace, chromozómové aberace Senescence Apoptóza, smrt buňky Vrozené choroby, nádorová onemocnění, stárnutí V buňkách existují mechanismy pomocí kterých buňka rozezná a úplně nebo do určité míry odstraní poškození DNA. Tyto opravné mechanismy jsou katalyzovány různými sadami enzymů. Schopnost opravit poškozenou DNA je zásadní pro udržení integrity genomu buněk a pro normální fungování mnohobuněčného organismu. Tomas R. Lindahl, Paul L. Modrich, Aziz Sancar získali v roce 2015 Nobelovu cenu za chemii za výzkum v oblasti molekulárních mechanismů oprav DNA. Typy oprav DNA: • úplná oprava - oprava na původní stav bez syntézy DNA • excizní oprava - vyštěpení poškozeného místa, syntéza nepoškozené DNA • tolerantní oprava - obnova funkce DNA bez opravy poškození http://www.naturexom/scitable/content/dna-damage-repair-mechanisms-and-consequences-14459141 Úplné opravy DNA Přímá oprava alkylovaných bází 06-metylguanin-DNA-metyltransferáza Fotoreaktivace fotolyáza štěpí cyklobutanový kruh v pyrimidinovém dimeru fylogenetický konzervativní mechanismus, u savců excizní oprava odstranění pyrimidinových dimerů v DNA vyvolaných UV zářením katalyzována fotolyázou (aktivace VIS o vlnové délce 340 - 400 nm) Zheyun Liu et al. PNAS 2011;108:14831-14836 • u lidí MGMT, u bakterií Ada; „sebevražedný enzym" • demetylace 05-metylguaninu na guanin, přenos metyl skupiny na vlastní Cys • deficity MGMT nalezeny u nádorů děložního hrdla, kolorekta, žaludku, jater, glioblastomu • u bakterií adaptivní odpověď na alkylační poškození - Ada odstraňuje alkylace z 06-metylG a 04-metylA (Cys321) i cukrfosfátové páteře (Cys69) - metylace Cys69 mění Ada na silný aktivátor transkripce sebe sama a dalších opravných genů N^metylA, N3-metylC: demetylace enzymem ALKBH N3-metylA, N7-metylG: excizní opravy Cys-SH cys-s-cH3 R R https://quizlet.com/11580914/chapter-25-slides-flash-cards/ Excizní opravy DNA Evolučně konzervativní, u prokaryot i eukaryot. Třístupňový proces: 1. rozpoznání a vyštěpení poškozené DNA, nukleázy 2. zaplnění mezery správnými nukleotidy, DNA polymerázy 3. spojení zlomu v cukr-fosfátové páteři, DNA ligázy Bázová excizní oprava (BER) • oprava poškozených bází (oxidace, alkylace, deaminace), odstranění U • DNA glykosyláza APmísto - rozeznání a odstranění nevhodné báze, tvorba AP míst - různé typy na jednotlivá poškození • AP endonukleáza - vyštěpení AP místa, tvorba 3'-OH - u člověka APEX1 a APEX2 • DNA polymeráza - připojení správného nukleotidu - Polp u eukaryot, Poli u prokaryot deaminace C / GCTUATCC ffa"|T|ff CGAGTAGG Uracil DNA glykosyláza G C T A T C C CGAGTAGG AP endonukleáza lnt mezera G C T A T C C "!■ i ■ "i JT CGAGTAGG DNA ligáza - spojení řetězce -DNA ligáza lilu lidí zvýšené riziko kolorektálních nádorů u mutací Polp, DNA glykosylázy DNA polymeráza DNA ligáza opravená DNA GCTCATCC CGAGTAGG https://www.studybluexom/notes/note/n/chapter-5-dna-replication-repair-and-recombination Excizní opravy DNA Nukleotidová excizní oprava (NER) • oprava rozsáhlejšího poškození DNA, které mění a deformuje dvoušroubovici DNA • adukty bází, UV fotoprodukty Bakterie • rozeznání poškozeného místa - UvrAB • vyštěpení poškozeného místa (13 nt) - UvrBC • uvolnění vyštěpeného úseku - UvrD • dosyntetizování chybějící DNA - Poli • spojení řetězce - LigA Tymidinový dimer 5' n I I jpp I I I I 3' 5' | | | i | | i | | i | i 3' 3' I i l l l l l l i l l l 5' y i i i i i i i i i i i i 5' UvrD y I i l I i i i l i l i l y Člověk • rozeznání poškozeného místa XPA, XPC, XPE; CSA, CSB • odvinutí DNA XPB, XPD • vyštěpení poškozeného místa (24 nt) XPF, XPG • dosyntetizování chybějící DNA Poló/s • spojení řetězce DNA ligáza I https://en.wikipedia.org/wiki/Nucleotide_excision_repair#/media/File:A_schematic_representation Excizní opravy DNA • deficity v NER mechanismech geneticky podmiňují některé syndromy Xerodema pigmentosum - autosomálně recesivní choroba, nejčastěji deficit XPA, XPC - extrémní citlivost k slunečnímu záření - > 1000 x zvýšeno riziko vzniku kožních nádorů Cockaynův syndrom - autosomálně recesivní choroba, deficit CSA, CSB - fotosenzitivita, trpaslictví, retinitis pigmentosa http://www.schumacher-lab.cecad.uni-koeln.de/ Excizní opravy DNA Oprava chybného párování (mismatch repair) • frekvence chyb při syntéze DNA replikace + proofreading + opravy 1 : 100.000 1 : 10.000.000 1 : 1.000.000.000 třeba odlišit nový řetězec s chybou od původního u E. coli Dam metyláza, která metyluje A v sekvenci GATC, těsně po replikaci hemimetylovaný stav rozpoznání chybného nukleotidu (MutS) navázání opravných enzymů (MutL, MutH) vyštěpení chybné sekvence - MutH rozezná nemetylovanou GATC a štěpí ji - exonukleáza spolu s helikázou a SSB proteiny odstraňuje naštěpený řetězec až k chybnému nt syntéza DNA podle původního řetězce (Pol3) spojení řetězce (DNA ligáza) GATC zametylována i v opraveném dceřiném řetězci (Dam metyláza) CHj MutH , CM, T I 3'-5'- I 5 5 Helikáza II /tib 3". s— Exonukleáza CH3 I CHj CHj _1__5' - 3' / MutS, MutL \ / MutH \ —Ľ_r - 3' CH3 Exonukleáza Helikáza II SSB CH3 __:_s- - 3' . 5' ■ 3" DNA pol III DNA ligáza , 5' • 3' CHj CH* 3'_1— 5'- CH, 3-l_ S-- CH, 3'_Ľ. 5-- SS —^ . 1 I CHj _l_ S' -3' MutH I 5- Exonukleáza CH3 ► - 3' • opravný systém používán i u eukaryot a člověka, mutace v opravných genech zvyšují riziko rakoviny http://www.slideshare.net/najmhemato/dna-repair Tolerantní opravy SOS odpověď • koordinovaná syntéza enzymů a spuštění záchranných opravných mechanismů • indukována rozsáhlým poškozením DNA, přetížením reparačních mechanismů, akumulací poškozené DNA • náchylná k chybám, umožňuje buňce přežít za cenu mutageneze • LexA potlačuje expresi cca 18 genů vazbou na SOS box v jejich promotoru (SOS regulon) lexA, recA, umuQ umuD, sulA, uvrA, uvrB, uvrQ ssb,... • akumulace ssDNA v poškozených buňkách aktivuje RecA • aktivní RecA způsobuje rozklad LexA, čímž se zvyšuje exprese genů SOS regulonu • zastavení buněčného dělení - SulA, SulB • zvýšená činnost NER - UvrABC • potlačení exonukleázové aktivity Pol3, začlenění jakékoli báze proti tyminovému dimeru - UmuCD (PolV), RecA • vlivem oprav mizí ssDNA, RecA přechází do inaktivního stavu, neštěpený LexA opět potlačuje SOS regulon • výsledkem je přežití buňky se zvýšenou pravděpodobností mutací / Vedoucí řetězec B RNA primer Opožďující se řetězec A B RecA o O O i—► Exprese potlačena \7 SOS box /T-t ^xA^^^ i—► Exprese potla 9 P Exprese SOS genů Opravy DNA SOS odpověď Inhíbíce buněčného dělení http://mmbr.asm. org/content/76/3/530/Fl. expansion, html Opravy dvojřetězcových zlomů Štěpení cukr-fosfátové kostry a dvouřetězcové zlomy indukovány ionizujícím záření, chybami v replikační vidlici, působením některých chemikálií. Nebezpečí fragmentace chromozomů, přestaveb genomu, ztráty genetické informace. Nehomologní spojování konců (NHEJ) • v Gl fázi buněčného cyklu, před replikací DNA • zarovnání zlomených řetězců a následné znovu spojení • náchylné k chybám, možná ztráta nukleotidů Spojení konců přes mikrohomologii (MMEJ) • v brzké S fázi buněčného cyklu • úprava konců, která odhalí krátkou oblast homologie • párování homologní oblasti, spojení řetězců Homologní rekombinace (HR) • v S/G2 fázi buněčného cyklu, po replikaci DNA • bezchybná oprava bez ztráty genetické informace • tvorba jednořetězcových přesahů, vyhledání homologní DNA, opravná syntéza DNA dle templátu, spojení volných konců http://wwwxell.com/trends/biochemical-sciences/fulltext/S0968-0004%2815%2900158-9 Gl / \ S/G2 Exol BLM-Dna2 K AMRN _ /N V , COK Ku / ^ \ Kofoly \}c-.q~j. tf u- ug4 I j I r RadSl Q „--t—^.. tIsj C-NHEJ L- Lig3/1 TxjOv/" ^.COCíl" V1 MMEJ I HR Opravy dvojřetězcových zlomů dsb Nehomologní spojování konců (NHEJ) • evolučně konzervativní mechanismus • převládající oprava ds zlomů v savčích buňkách • přesnost opravy - spojení tupých konců - zarovnání a spojení převislých konců • prokaryota - E.coli pouze homologní rekombinace - některé druhy i NHEJ (Ku, LigD) • člověk - rozeznání konců (Ku70/80, DNA-PKcs, MRN komplex) - úprava konců (nukleáza Artemis) - spojení konců (komplex XRCC4 / DNA ligáza IV) • mutace v XRCC4 a Lig4 genetickou podstatou syndromů projevujících se citlivostí k ionizujícímu záření, těžkými imunodeficity, mikrocefalií DNA Rozpoznání ds zlomu 110 KU70/80 -- Vazba dalších NHEJ proteinů Úprava konců Spojení konců DNA-PKcs XRCC4 / DNA ligáza IV Artemis http://www.nature.com/onc/journal/v26/n56/fig_tab/1210871fl.html Opravy dvojřetězcových zlomů Spojení konců přes mikrohomologii (MMEJ) • rozeznání konců v místě zlomu (PARP1, MRN komplex) a jejich úprava (FEN1) • nalezeny a spárovány mikrohomologie • přesahy za homologními oblastmi odbourány (FEN1 ?) • spojení volných konců řetězců (komplex XRCC1 / DNA ligáza III) • oprava náchylná k chybám (delece DNA mezi mikrohomologiemi), využívána při inaktivaci NHEJ • zvýšená exprese či aktivita proteinů MMEJ nalezena u celé řady nádorových onemocnění ■ ňCGSTSůTTCGGínCSCňT ■ ■ TG C&SIC ftňG C C&KEGTř - ACCTTAC-TTC CC-TCTTA'ľCC - T GCAň T C ň ň C C Z AA Tj\CG - NHEJ MMEJ TCTTATCC■ GSATAGG ■ ■ ňCGJ3E8GTTC 'TCC »C _ ň NtjeLease? TCC ■ \ ■ TůC CCňGSHCAGG- T té-1 TCC — ■ ňC GEEEG TTG GHECAT ■ ■TGCE51CAACC5E3IGTA- ,a[-g ŕ: I ■ ACGtfťgTCC ■ ■TGCSÍÍIAGG- ň T c T C G http://www.nature.com/nrc/journal/vl3/n7/fig_tab/nrc3537_F4.html Homologní rekombinace Výměna genetické informace mezi dvěma homolog-ními molekulami DNA. Probíhá u všech organismů • mezi virovými genomy v hostitelské buňce • u bakterií během transformace, konjugace • během meiózy eukaryotických buněk • při opravách ds zlomů DNA Dva modely oprav ds zlomů DNA pomocí homologní rekombinace • Hollidayův model (DSBR, double-strand break repair) • nasedání závislé na syntéze (SDSA, synthesis-dependent strand annealing) ds zlom Tvorba převislých konců 3 . 5'- Přpojení volného konce / Syntéza DNA * Spojení řetězců dsbr Prostupování řetězců | Tvorba D smyčky Syntéza DNA sdsa \ Obnova původního řetězce Posun a zrušení Hollidayova spoje Nebo Syntéza DNA Spojení řetězců www.genetika-biologie.cz By Emw2012 - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=5668312 Homologní rekombinace Bakterie • hlavní opravný mechanismus ds zlomů • vazba komplexu RecBCD na konec vytvořený ds zlomem • odvíjení dsDNA helikázovou aktivitou RecBD • pohyb RecBCD komplexu podél molekuly DNA • po dosažení místa Chí (5'-GCTGGTGG-3\ každých 5 kb) je štěpen jeden z řetězců, na odvíjený řetězec se váže RecA • vzniklé nukleoproteinové vlákno prostupuje do homologní DNA za vzniku D-smyčky • vznik a posun Hollidayova spoje (RuvAB), který je zrušeno působením RuvC za vzniku rekombinantních molekul • 3' konec Chí struktury může být použit pro syntézu nového řetězce, potom vzniká jedna rekombinantní a jedna původní molekula DNA Člověk • rozpoznání zlomů a úprava vzniklých konců - BRCA2, Rad52, Rad54, Rad51 • nukleoproteinové vlákno - Rad51 • různé helikázy (RecQ), nukleázy, topoizomerázy • deficity v procesech HR spjaty s tvorbou nádorů, početními chromozómovými abnormalitami By Snownow - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=20163117 Opravy poškozené DNA Při selhání replikačních a opravných mechanismů dochází ke vzniku mutací. Záměna pouhého jednoho nukleotidu může vážně poškodit zdatnost a zdraví organismu. - např. srpkovitá anémie Změny DNA v zárodečných buňkách přenášeny na potomstvo. Změny DNA v somatických buňkách mohou vést ke vzniku nádorových onemocnění. Pravděpodobnost akumulace dostatečného množství mutací pro vznik nádoru roste s věkem. Chyby v opravných mechanismech zvyšují frekvenci spontánních mutací a citlivost buněk k mutagenů. Nalezeno přes 30 mutací v genech pro opravy DNA, které mimojiné zvyšují riziko vniku nádoru. Využití chemických i fyzikálních mutagenů při léčbě nádorových onemocnění (chemoterapie, rádioterapie). ISO 10 20 30 40 50 SO 70 80 Věk (rok) http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf http://www.understandingrace.org/humvar/sickle_01.html Shrnutí • Před tím než se buňka rozdělí, musí replikovat veškerou genetickou informaci uloženou v DNA. • Vlákna v dvouřetezcové DNA jsou navzájem komplementární, každé z nich proto může sloužit jako templát pro syntézu dalších vláken. Během replikace DNA vznikají dvě úplně stejné molekuly, což umožňuje kopírovat genetickou informaci a předávat ji do dceřiných buněk a z rodičů na potomstvo. • Během replikace DNA se vlákna dvoušroubovice oddělují za vzniku replikační vidlice ve tvaru „Y". DNA polymeráza na každém z vláken vytvoří nový komplementární řetězec DNA. • DNA polymeráza syntetizuje DNA pouze v jednom směru, takže pouze vedoucí řetězec může být v replikační vidlici tvořen nepřerušovaně. Na opožďujícím se řetězci probíhá syntéza DNA přerušovaně, ve formě krátkých fragmentů, které jsou následně spojeny do souvislého řetězce. • Syntéza DNA začíná od krátkých RNA primerů, které jsou následně odstraněny a nahrazeny DNA. • Replikace DNA vyžaduje spolupráci mnoha proteinů, které tvoří multienzymový komplex pohybující se podél replikované DNA. • U eukaryot jsou konce chromozomů replikovány pomocí telomerázy. • DNA polymeráza se vyznačuje vysokou přesností replikace podporovanou proofreadingovou aktivitou. Případné chybné báze jsou opravovány pomocí oprav chybného párování bází. • Poškození DNA je opravováno řadou enzymů, které poškozené místo rozeznají, odstraní a nahradí novou DNA, která se tvoří podle nepoškozeného templátu. • Dvouřetezcové zlomy DNA jsou opravovány v závislosti na fázi buněčného cyklu pomocí nehomologního spojování konců či homologní rekombinace. Zvídavé otázky Vysvětlete vlastními slovy, proč se replikace DNA označuje jako „semikonzervativní"? Proč jsou telomery a telomeráza potřebné pouze pro replikaci eukaryotických chromozomů a prokaryotických ne? Která z následujících tvrzení jsou pravdivá? Vysvětlete svoji odpověď. a) Bakteriální replikační vidlice je asymetrická, protože obsahuje dvě DNA polymerázy, které se liší ve své struktuře. b) Okazakiho fragmenty jsou odstraňovány nukleázou, která degraduje RNA c) Frekvence replikačních chyb je snižována jak proofreadingovaou aktivitou DNA polymerázy tak opravou chybného párování bází. d) Při chybění oprav DNA jsou geny nestabilní. e) Žádná z chybných bází vzniklých deaminací se v DNA přirozeně nevyskytuje. f) Nádory mohou vznikat v důsledku akumulace mutací v somatických buňkách. Zvídavé otázky • V jakém pořadí by denaturovaly následující molekuly DNA při postupném zahřívání jejich roztoku? A) 5 '-CCG G G CC AG CCG GTGTG G GTTG CCG AG G - 3' 3-GGCCCGGTCGGCCACACCCAACGGCTCC - 5' B) 5-AGTGCTTGATCGAT - 3' 3'-TCACGAACTAGCTA - 5' C) 5'-ATTATAAAATATTTAGATACTATATTTACAA- 3' 3'-TAATATTTTATAAATCTATGATATAAATGTT- 5' • Rychlost syntézy DNA u E.coli je 100.000 nt / min. Replikace celého chromozomu trvá 45 minut. Kolik párů bází obsahuje chromozom E.coli? Jaká je přibližná délka tohoto chromozomu? • Haploidní genom D. melanogaster obsahuje 1,35 x 108 bp. Syntéza na jedné replikační vidlici probíhá rychlostí 30 bp/s. Obě kopie genomu se zreplikují behěm 5 minut. Kolik replikačních počátků je pro takto rychlou syntézu DNA potřeba? • Jaký bude konečný produkt nebo stav replikace, pokud bude mutací inaktivován následující enzym, a i přes tuto mutaci se bude buňka snažit zreplikovat DNA? a) DNA-polymeráza b) DNA-ligáza c) DNA-helikáza d) primáza