Molekulární biologie pro informatiky - 7 Molekulární mechanismy signalizace Signální molekuly Signál • faktor, kterým se zprostředkovává a předává nějaká informace • signální molekula je molekula ve funkci signálu • extracelulární - zdroj mimo buňku, ligand reagující s buňkou pomocí receptoru - např. hormony, růstové faktory, neurotransmitery • intracelulární - zdroj uvnitř buňky, např. druzí přenašeči, další složky signálních drah Extracelulární signály • proteiny, peptidy, aminokyseliny, nukleotidy, lipidy, steroidy, mastné kyseliny a jejich deriváty, plyny • hormony - odvozené od aminokyselin (adrenalin, thyroxin) - peptidy a proteiny (inzulín, glukagon, oxytocin) - steroidní (testosteron, estrogen, kortizol) - vitamín D, kyselina retinová • cytokiny - interleukiny, interferony - nádorové nekrotické faktory (TNF-a, TNF-p, TNF-y) - růstové faktory (EGF, PDGF, IGF-1, GM-CSF, GHF, NGF) • nervové mediatory (acetylcholin, GABA) • lokální mediatory (histamin, oxid dusnatý) Signály hydrofilní povahy: vazba na membránové receptory, krátkodobá odpověď Signály lipofilní povahy: vazba na intracelulární receptory, dlouhodobá odpověď Signalizace Extracelulární signalizace • přenos signálu z buňky, která je jeho zdrojem na receptor cílové buňky, která signál přijímá 1. endokrinní - značná vzdálenost mezi zdrojovou a cílovou buňkou překonávána krví, např. hormony 2. autokrinní - stejná buňka je zdrojová i cílová 3. parakrinní - produkce signálu do tělních tekutin, lokální účinek na okolní buňky - např. histamin, NO 4. dutým spojem - mezi oběma buňkami, které jsou v těsném kontaktu vytvořena tubulární struktura - dutý spoj (gap junction) u živočišné buňky, plazodezmata u rostlin - např. Ca2+, cAMP 5. přímým kontaktem - ligand i receptor jsou umístěny na povrchu buněk, které se při signalizaci dostávají do přímého kontaktu např. Fas + FasL 6. synaptická - v nervové soustavě, přenos signálu mezi neurony, neuronem a svalovou buňkou - vliv na permeabilitu membrán, např. acetylcholin https://www.boundless.com/biology/textbooks/boundless-biology-textbook/cell-com 11606/ https://www.alz.org/braintour/synapses_neurotransmitters.asp https://www.studyblue.eom/notes/note/n/chapter-ll-cell-communication/deck/13660625 Signalizace Intracelulární signalizace • dráha přenosu signálu uvnitř buňky • vazba signálu na receptor indukuje enzymatickou aktivitu uvnitř buňky a signál je převeden na cílovou molekulu, která realizuje odpověď buňky na extracelulární signál Odpověď buňky • přítomnost receptoru a výbava buňky rozhoduje o tom, na který signál bude buňka reagovat • stejný signál může mít různé účinky u různých buněk - např. acetylcholin vyvolává kontrakci kosterních svalů, dilataci srdeční svaloviny, sekreci slin • změna genové exprese, aktivity metabolických enzymů, konfigurace cytoskeletu, permeability membrány pro ionty, aktivace syntézy DNA, indukce apoptózy • rychlost reakce - v s až min při změně funkce proteinů, v min až hod při změně v expresi genů http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/14_02.jpg http://27.109.7.67:llll/econtent/cell-communication/principles-part-2.php Signální dráhy První přenašeč signálu: prvotní signál zachycený buňkou. Druhé přenašeče signálu: malé molekuly produkované uvnitř buňky po vazbě ligandu na receptor mění aktivitu dalších složek signální dráhy Intracelulární signalizace zahrnuje řetězec dějů • přenos signálu a jeho převod do srozumitelné podoby • zesílení (amplifikace) původního signálu a jeho případné rozdělení • propojení signálních drah • na každý krok řetězce můžou působit dalších faktory • zapojené enzymy jsou přísně regulovány Dráha #1 Dráha #2 Po přijetí signálu se rovnováha signálních molekul velmi rychle obnovuje. Odpověď buňky je po rozložení nebo inaktivaci signální molekuly zastavena Ztráta senzitivity buněk • dlouhodobé vystavení buněk působení ligandu může vést ke ztrátě jejich citlivosti na tento ligand • změny na úrovni receptoru - odstranění receptoru z povrchu buňky - změny receptoru, které snižují jeho afinitu k ligandu či schopnost převodu signálu do nitra buňky Activated adenylyl cyclase 0999990999, 0999999999 ® Not 4) KnnniíiEEnM ^QQQQQQQQ cAMP ©11 i i l li 1 -^OOOOOOOO protein kinase R^P=liU.linr*HMM //J!\W^ OOOOOOOOOO enzyme amplification * t * i i v w 000000000 product http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/14_02.jpg http://www.slideshare.net/mousvi786/hormones-lecture-h02 Intracelulární receptory • receptory steroidních a tyroidních hormonů, vitamínu D, kyseliny retinové, oxidu dusnatého • ligandy difundují cytoplazmatickou membránou a vazbou na receptor vyvolají změnu v jeho konformaci, tím se zvýši afinita receptoru k DNA a receptor reguluje transkripci cílových genů Funkční domény receptoru • doména pro vazbu ligandu - v nepřítomnosti ligandu může být vázán inhibitor, např. antiestrogen • aktivační doména - vazba k TFIID, TFIIB • DNA vazebná doména - vazba k regulačním oblastem DNA, motiv dvou zinkových prstů • doména pro dimerizaci - dimerizace nutná pro plnou aktivaci receptoru 1. Cytoplazmatické receptory • steroidní hormony, gestageny, glukokortikoidy, testosteron, ekdyzon, mineralkortikoidy • na inaktivní formu vázány HSP proteiny (HSP70, 90), které se uvolní po vazbě ligandu • receptor tvoří homodimery a přechází do jádra, kde aktivuje příslušné geny • např. androgenní receptor https://commons.wikimedia.0rg/wiki/Fiie:Human_andmgen_receptor_and_and Intracelulární receptory 1. Cytoplazmatické receptory • reakce na steroidní hormony bývá dvoustupňová, brzká primární a opožděná sekundární odpověď 2. jaderné receptory • tyroidní hormony, vitamín D, kyselina retinová • tvoří heterodimery, často s RXR • např. vitamín D - v krvi vázán na DBP protein, v jádře receptor VDR, který dimerizuje s RXR, váže se k DNA a spolu s dalšími koaktivátory spouští transkripci cílových genů skin skin 7,8-dehydrocholesterol pre-vitamin D3 vitamin D3 target tissues 24-hydroxylase liver 25-hydroxylase kidney 1a-hydroxy!ase calcitroic acid H \ 0= p- adenylyl cyclase OH OH -o ATP PPi GTP cGMP Membrane associated guanylyl cyclase c A MP u 0=P-O OH OH Extracellular region mmimmmmiiawmmmmm Cytoplasm GTP cGMP Soluble guanylyl cyclase Peptide ligand ATP SH2 ~C SH3 She Stat SH2 DNA Binding run -SH2 SH2 Sap SH2 V https://commons.wikimedia.org/wiki/File: llkkA_SH2_domain.png http://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=domains-sh2 Rodina proteinů Ras INACTIVE • skupina malých monomerních GTPáz, schopnost vázat GDP/GTP • G doména váže za přítomnosti Mg2+ GDP/GTP • CAAX box, po prenylaci vazba k plazmatické membráně • aktivovány GEF faktorem (guanin nucleotide exchange factor), který uvolňuje GDP • Ras potom váže GTP, aktivuje se a přenášejí signál na své efektory • inaktivaci zajišťuje GAP protein (GTPase-activating protein), který podporuje hydrolýzu GTP • nadrodina proteinů Ras - rodiny Ras (růst a diferenciace buněk), Rho (morfologie a pohyb buněk), Rab a Arf (transport měchýřků), Ran (jaderný transport) Signalizace přes Grb2-Sos • Grb2 se přes SH2 doménu spojuje s aktivovanými tyrosinproteinkinázovými receptory SH3 doménu konstitutivně váže k proteinu Sos • Sos funguje jako GEF a zajišťuje aktivaci Ras http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/CB14.html Figure 15-54. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Rodina proteinů Ras Aktivovaný Ras-GTP váže a aktivuje své efektory, hlavním efektorem proteinů Ras je kináza Raf MAPK dráha zahájená aktivací Raf • Raf - Ser/Thr MAPKKK - v inaktivním stavu udržuje faktor 14-3-3 konformaci blokující katalytické místo - vazba Ras-GTP indukuje disociaci 14-3-3, fosforyluje Raf v pozicích Ser338 a Tyr341 Vazba Ras-GTP Flexibilní oblast Proteinkinázová doména 14-3-3 dimer / C Skryté aktivní místo Blok autoinhibiční doménou • MAPKK - MEK1/2 • MAPK - ERK, transport do jádra, kde aktivuje transkripční faktory • transkripční faktory se váží na SRE (sérum response elements) a indukují transkripci specifických genů (SRF, sérum response factor) • přenos signálů od mitogenů • dominantní při signalizaci určující růst, vývoj a diferenciaci buněk http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/CB14.html https://commons.wikimedia.Org/wiki/File:C-Raf-architecture.png Rodina proteinů Ras GEF faktory aktivující Ras proteiny - Sos: signál od proteinkinázových receptorů přes Grb2 - Ras-GRP: signál od fosfolipázy C přes DAG - Ras-GRF: signál od Ca2+ iontového kanálu přes kalmodulin Efektory proteinů Ras hGDP . (ras-gef)( ) (ras-gap) á^llj^ (£27)(Tsa) (Íkk)(bad)(fox 1 yíšch 1 (pld) (rho) PLCeJ <ČD£42)(rÁci) (vT) (dag) I i Endocytóza Transkripce Proliferace @ 1 (Jí) (RHEJp JL • Přežívání buněk • Růst buněk • Buněčná migrace • Proliferace • Transkripce I Endocytóza • Cytoskelet • Buněčná migrace • Ca2+ signalizace Nádorová onemocnění • stále aktivní Ras-GTP (blok hydrolýzy GTP, mutace GAP proteinů) • H-Ras, K-Ras a N-Ras nejčastější onkogeny nádorových onemocnění (u 20 - 30 % nádorů) • inhibitory Ras proteinů předmětem protinádorové léčby - např. inhibitory prenylace, siRNA proti mutantním Ras, reoviry http://www.naturexom/nrc/journal/vll/nll/fig_tab/nrc3151_Fl.html Přímá aktivace transkripčních faktorů Signální dráha Jak/STAT • STATjsou transkripční faktory s SH2 doménou, vcytoplazmě, po aktivaci translokace do jádra • Jak konstitutivně asociuje s receptorem • vazba cytokinu stimuluje dimerizaci receptoru, fosforylace Jak, fosforylace receptoru • na fosforylovaný receptor se váže STAT, který je aktivován fosforylací od Jak • aktivovaný STAT se odděluje od receptoru, dimerizuje a přechází do jádra • vazba na specifické enhancery a aktivace cílových genů • negativní regulace dráhy - fosfatáza SHP1: SH2 doménou vazba na P-Tyr aktivovaného receptoru, defosforylace Jak - proteiny SOCS: vazba na P-Tyr aktivovaného receptoru, blok struktury přes doménu SOCS-box váží ubikvitin ligázu, degradace Jak v proteazomu Tyrosine phosphorylation of http://www.nature.com/nrm/journal/v3/n9/fig_tab/nrm909_Fl.html http://www.sp.uconn.edu/~ttc02001/MCB3201/Study%20Guide/%5BVII%5D%20Signal%20Transduction.ppt Přímá aktivace transkripčních faktorů Signalizace TGFß (Transforming Growth Factor ß) tři izoformy (TGFpl-3) s tkáňově a vývojově specifickou expresí syntéza ve formě prekurzoru sekretováno do extracelulárního prostoru tvorba latentního komplexu: odštěpení pro- domény, vazba na LTBP protein po aktivaci uvolněn zralý TGF(3 ve formě dimeru Rl a Rll - transmembránové dimery - Ser/Thr kinázovou aktivita v cytosolické doméně Rlll - vazba a koncentrace TGF(3 blízko povrchu buněk • po vazbě TGFp na Rll (přímo/přes Rlll) je Rl přitažen a aktivován • Rl fosforyluje Smad3, který v dimerizuje a tvoří komplex se Smad4 a Importinem (3 • po translokaci do jádra se Importinem (3 uvolní • komplex Smad3/Smad4 váže transkripční faktor TFE3 a reguluje trasnkripci cílových genů http://www.sp.uconn.edu/ntc02001/MCB3201/Study%20Guide/%5BVII%5D%20Signal%20Tran Secreted TGFfi precursor |<-50-375 aa-»|«-110-140 aa+| *H3N-Q Pro-domain ) oo^c-o oo )-COO~ SH \ Mature domain Proteolytic cleavage Binding by LTBP Pro-domain ) Latent complex s i s oo oo oo oo oo oo () Pro-domain )-S-S 0 LTBP ') Conformational change or proteolysis of LTBP; release of mature TGF[5 *H3N-f) oo oo oo )-COO Mature form i (homo- or hetero- s dimer *H3N-f) oo oo oo )-COO~ tři typy receptoru 3-bp spacer Sekundární přenašeče NH, nízká molekulová hmotnost dobře rozpustné krátký poločas rozpadu intracelulární signály přenos, amplifikace a rozdělení signálu z receptoru po přijetí signálu aktivovány enzymy zodpovědné za jejich tvorbu jejich koncentrace v buňce stoupá a klesá v závislosti na přítomnosti mimobuněčného signálu vyvolávají rychlou změnu aktivity enzymů nebo jiných proteinů O—CH, CO ,0. 0=P-O OH I O N O—CH, 0=P-O OH I O OPO. CH3 — (CH2) — C — O—CH2 CH3 — (CH2) —C—O—CH II O 3', 5'-cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) Aktivuje proteinkinázu A (PKA) 3', 5'-cyklický guanosinmonofosfát (cGMP) Aktivuje proteinkinázu G (PKG) lnositol-l,4,5-trisfosfát (lns(l,4,5)P3) Otevírá Ca2+ kanály ER 1,2-diacylglycerol (DAG) Aktivuje proteinkinázu C (PKC) Receptory vázané na G-protein G-proteiny (trimerní) Vazba hormonu na receptor Hormone Receptor G protein Enzyme 2nd (1st messenger) messenger Receptor GDP GTP TAT Adenylate cyclase I Extracellular fluid cAM P aktivuje proteinkinázu A Inactive protein kinase Receptor G-protein Adenlyátcykláza aktivuje aktivuje měníATP G-protein adenlyátcyklázu nacAMP Active protein kinase Přenos signálu na cílovou strukturu Přenos signálu z receptoru na producenta sekundárních přenašečů Podjednotka a - vazebné místo pro GDP/GTP, GTPázová aktivita Podjednotky py - ukotvení G-proteinu v plazmatické membráně Základní stav • asociace apy podjednotek, GDP na podjednotce a Aktivace • vazba ligandu na receptor vede k výměně GDP za GTP (GEF faktor) • disociace a od py • a a py regulují aktivitu specifických cílových proteinů Inaktivace • po hydrolýze GTP na GDP (GAP protein) návrat do trimerního stavu http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio211/chapl6/chapl6.htm https://courses.washington.edu/conj/bess/gpcr/gpcr.htm 91189549944794 17945994 ^974 Receptory vázané na G-protein U savců 20 typů a, 5 typů (3, 6 typů y; podle a podjednotek řazeny do 4 tříd Gas a aktivace adenylátcyklázy, Ca2+kanálů Gai a inaktivace adenylátcyklázy, aktivace fosfolipázy C a cGMP fosfodiesterázy ßv aktivace K+ kanálů a fosfolipázy C Gaq a aktivace fosfolipázy C Gal2 a aktivace Rho Stimulatory [Epinephrine hormone