Molekulární biologie pro
informatiky - 8
Molekulární struktura
eukaryotické buňky
Eukaryotická buňka
Buněčné kompartmenty
• zajišťují oddělení a organizaci chemických reakcí v buňce
• enzymy katalyzující sled reakcí soustředěny do jednoho kompartmentu
• metabolických děje probíhají odděleně od zbytku buňky
• výhody - protichůdné chemické procesy v jedné buňce, mikroprostředí vhodné pro chemickou
reakci, oddělení nebezpečných rozkladných dějů, dělba práce mezi organelami
• nevýhody - nutná koordinace procesů, biosyntéza organel, třídění proteinů pro různé cíle
Struktura buňky
• povrch buňky
(cytoplazmatická membrána, buněčná stěna)
• základní cytoplazma
• jádro
• semiautonomní organely
(mitochondrie, chloroplasty)
• endomembránový systém
(Golgiho aparát, endoplazmatické retikulum,
vezikulární útvary)
• cytoskelet
https://eluc.kr-olomoucky.cz/verejne/lekce/5
Jádro
• funkce genetická, metabolická, regulační
• různý tvar u různých buněčných typů
• výjimečně u specializovaných buněk chybí (např. erytrocyty)
• hmota uvnitř jádra = chromatin
• jaderná membrána
- odděluje jádro od cytoplazmy
- dvě biomembrány (šířka 7-8nm)
- vnější membrána navazuje na membránu ER
- perinukleární prostor (šířka 20-40 nm) navazuje na lumen ER
- jaderné póry skrz obě membrány
• jaderná lamina
- vyztužení vnitřní membrány, vazba chromatinu
- lamin A, B, C; proteiny asociované s membránou
• jadérko
Monocyt
Neutrofil
Eozinofil Bazofil
Lymfocyty
Chromatin
Jadérko
Jaderná
lamina
Vnější
membrána
Vnitřní
membrána
Jaderná
membrána
Perinukleární
prostor
Ribozomy
Jaderné
póry
Hrubé ER
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-18/CB18.html
http://xarquon.jcu.cz/edu/zbb/prednasky/07cytoskeleton/077nuclearskeleton/skelet_jaderny.htm
https://en.wikipedia.org/wiki/White_blood_cell#/media/File:Blausen_0909_WhiteBloodCells.png
• hmota složená z dsDNA, histonů a proteinů nehistonové povahy
• kvartérní struktura DNA: dvoušroubovice DNA - nukleozomový řetězec
- 30-nm chrom. vlákno - 600-nm chrom. vlákno - mitotický chromozom
• odlišné fyzikální stavy: dekondenzovaný euchromatin
kondenzovaný heterochromatin
Chromozom
• jedna molekula DNA
• v interfázním jádře rozprostřen v chromozomovém teritoriu
• při mitóze ve formě mitotického chromozomu
• daný počet u každého druhu organizmů
• haploidní sada chromozomů v pohlavních buňkách
- jeden soubor chromozomů s kompletní genetickou informací
- každý chromozom pouze jednou
• diploidní sada chromozomů v somatických buňkách
- dvě kompletní sady chromozomů, každý chromozom ve dvou kopiích
Chromatin
Interfáze Mitotické chromozomy Diploidní
Replikace 1. MEI
2. MEI
Haploidní
http://www.mechanobio.info/figure/1389942033388.jpg.html lookfordiagnosis.com http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision.htm
2-nm dsDNA
10-nm nukleozomové vlákno
30-nm chromatinové vlákno
60-nm chromatinové vlákno
Mitotický chromozom
Histony
Jaderná DNA
Velikost jaderného genomu
• hodnota C = velikost jaderné složky haploidního
genomu daného druhu
• paradox hodnoty C = neexistuje vztah mezi
velikostí genomu a biologickou komplexitou
organismu
• jednotky Mb - stovky Gb
Druh
Velikost
genomu (bp)
Počet chromozomů
v haploidním genomu
Počet genů
S. cerevisiae 1,2 x 107 16 5.770
C. elegans 1,0 x 108 4 21.700
D. melanogaster 1,2 x 108 4 17.000
Xenopus laevis 3,1 x 109 18
Mus musculus 2,8 x 109 20 23.000
Homo sapiens 3,3 x 109 23 21.000
Zea mays 5,0 x 109 10 50.000
Allium cepa 1,5 x 1010 8
Genové repetice
• jednotkou repetice je gen
• u mnohobuněčných organismů se 50 - 75 % strukturních genů vyskytuje ve dvou nebo více kopiích
1. tandemové genové repetice
- geny či skupiny genů které se opakují bezprostředně za sebou
- nukleotidové sekvence které oddělují jednotlivé geny či skupiny se nazývají mezerníky
- např. geny přepisované do 5S rRNA (250x), tRNA (10-100x)
geny kódující histony (20x skupina genů kódující všech pět histonů)
2. rozptýlené genové repetice
- gen nebo skupina genů s kopiemi na různých místech haploidního genomu
- např. některé geny pro tRNA, snRNA, aj.
Jaderná DNA
Genové repetice
3. genové rodiny
- skupina sekvenčně příbuzných genů
- společný evoluční původ a biologická funkce genů
- často se geny v rámci rodiny nevyjadřují současně ve stejném vývojovém stádiu organizmu
- např. geny kódující polypeptidové řetězce hemoglobinu, ve dvou genových rodinách
pseudogeny = nepřesné kopie strukturních genů (inaktivní)
ε
Ebryonální hemoglobin: ζ2ε2
Fetální hemoglobin: α2γ2
Hemoglobin u dospělého jedince: α2β2, α2δ2
Lidský genom
Celková velikost ̴3.200.000.000 bp
Počet genů ̴ 20.500 (odhad před sekvenací 150.000)
Odlišnosti v rámci druhu Homo sapiens ̴ 0,1 %
Homologie s ostatními primáty 96 % (celkem), 99 % v genech
26 % z celkové sekvence genomu přepisováno do RNA
1,5 % sekvencí kóduje proteiny nebo funkční RNA
Lidský karyotyp
• 23 párů chromozomů
• 22 párů autozomů (homologní chomozomy)
• 1 pár gonozomů (pohlavní chromozomy X a Y)
• dělení do 7 skupin podle makrostavby chromozomu
A – 1, 2, 3 velké metacentrické
B – 4, 5 velké submetacentrické
C – 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X střední submetacentrické
D – 13, 14, 15 střední akrocentrické
E – 16, 17, 18 malé submetacentrické
F – 19, 20 malé metacentrické
G – 21, 22, Y malé akrocentrické
Rozptýlené
repetice
(44%)
Alu
sekvence
(10%)
Tandemové
repetice
(15%)
Jedinečná
nekódující DNA
(15%)
Introny strukturních
a funkčních genů
(24%)
Exony strukturních a funkčních genů (1,5%)
Jaderný pór
• kanál skrz obě jaderné membrány obklopený komplexem proteinů
• 3000 - 4000 póru v jádře savčích buněk, průměr 120 nm, výška 200 nm
• komplex zhruba 100 různých proteinů (nukleoporinů), osmičetná symetrie
• cytoplazmatická strana - kruh s vlákny
• nukleoplazmatická strana - kruh v jaderné lamině, struktura ve tvaru koše
• místo transportu molekul mezi jádrem a cytoplazmou
• pasivní transport - volná difuze menších molekul rozpuštěných ve vodě
• aktivní transport - selektivní transport molekul s třídícími signály; RNA, proteiny, makromolekuly
- transportní proteiny (importiny, exportiny) se po naložení přenášené molekuly váží k jadernému
póru a celý komplex je skrz něj translokován
- jednostranný transport zajišťuje Ran: Ran-GTP v jádře, Ran-GDP v cytoplazmě
Transport přes jaderný pór
http://slideplayer.cz/slide/3008839/ http://www.pha.jhu.edu/~ghzheng/old/webct/note6_4.htm#
Transport přes jaderný pór
Transport do jádra, import
• chromatinové proteiny, laminy, ribozomální proteiny, DNA/RNA-polymerázy, TF
• proteiny určené do jádra obsahují jadernou lokalizační sekvenci (NLS)
• NLS rozeznána importinem - vazba k jadernému póru - import do jádra
• vazba Ran-GTP na importin - vytěsnění přenášeného proteinu
• export Ran-GTP/importin z jádra
• RanGAP stimuluje hydrolýzu Ran-GTP na Ran-GDP
• disociace Ran-GTP/importin
• regulace TF blokováním jejich NLS a zadržením
v cytoplazmě (např. NFκB / IκB)
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-18/CB18.html http://www.pha.jhu.edu/~ghzheng/old/webct/note6_4.htm#
Transport z jádra, export
• molekuly mRNA, tRNA, ribozomové podjednotky
• jaderná exportní sekvence (NEL) bohatá na Leu
• vazba Ran-GTP k exportinu zvyšuje jeho afinitu k NEL - naložení exportovaného
proteinu - vazba k jadernému póru export z jádra - hydrolýza Ran-GTP na RanGDP
- uvolnění přenášené molekuly
• mRNA exportována ve formě hnRNP, kdy alespoň jeden z proteinů obsahuje NES
• rRNA se spojuje s importovanými ribozomálními proteiny, z jádra exportovány
podjednotky ribozomů
NaloženíVyložení
Přenášený
protein
Importin
NLS
Ran
Struktura v jádře buňky neohraničená membránou
Syntéza molekul rRNA, sestavení ribozomálních podjednotek
Organizátor jadérka (NOR, Nucleolus Organizer Region)
• krátká raménka akrocentrických chromozomů 13, 14, 15, 21, 22
• tandemové repetice rDNA (13,7 kb; geny pro rRNA)
• RNA Pol I přepisuje rDNA do 45S pre-rRNA
• štěpení na 18S, 5.8S a 28S rRNA (snoRNP)
5S rRNA přepisována mimo jadérko (RNA Pol III)
Import ribozomálních proteinů do jádra - sestavení ribozomálních podjednotek - export podjednotek
z jádra, všechny kroky regulovány řadou exportních proteinů, které zajišťují správnou tvorbu ribozomů
Jadérko
chromozomy podílející se svojí
rDNA na tvorbě jadérka
jadérko
jaderná membrána
jadérko jaderná membrána
http://www.pha.jhu.edu/~ghzheng/old/webct/note6_4.html https://www.uni-mainz.de/FB/Medizin/Anatomie/workshop/EM/EMNucleolus.html
http://cryoem.berkeley.edu/~bgreber/website/pages/biogenesis.html
• 15 - 25 μm, 80S, neohraničeny membránou
• volně v cytoplazmě nebo vázané na ER
• ribonukleoproteinové částice
• složené ze dvou podjednotek
- vznik v jadérku, spojení v cytoplazmě
- 60S: 5S, 5.8S, 28S rRNA; 50 L proteinů
- 40S: 18S rRNA; 30 S proteinů
• funkce: syntéza proteinů na základě genetické informace uložené v mRNA
• polyribozom: řada ribozomů připojených na jedinou molekulu mRNA, stočen do kruhu
Ribozomy
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26829/figure/A1090/?report=objectonly
http://www.pha.jhu.edu/~ghzheng/old/webct/note6_4.html http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch06/ribosome.html
Ribozomy ER
Volné ribozomy
Vázané ribozomy
Endoplazmatické retikulum
Cytoplazma
Velká podjednotka
(60S)
Malá podjednotka
(40S)
Polypeptidový
řetězec
mRNA
Iniciační
kodon
Stop
kodon
PolyA vazebný
protein
čepička
eIF-4G
eIF-4E
Semiautonomní organely
• obal ze 2 membrán, energetická centra buňky
• vlastní proteosyntetický aparát a DNA
• syntéza mnoha jejich proteinů probíhá v cytoplazmě
a je řízena jadernými geny
• endosymbiotická teorie jejich vzniku při evoluci
eukaryotické buňky
Mitochondrie
• 0,1 - 10 μm, protáhlá tělíska, několik set v jedné buňce
• dvě biomembrány - vnější hladká, vnitřní je zvrásněna a vytváří přepážky (tzv. kristy)
- dva kompartmenty: mezi membránami / matrix mitochondrie mezi kristami
• organely buněčného dýchání, zisk ATP
• enzymy oxidativní fosforylace a dýchacího řetězce na vnitřní membráně
• v matrix umístěny enzymy Krebsova cyklu a katabolismu MK
mitochondriální DNA a ribozomy
Proto-eukaryotická
buňka
Jádro
ER
Aerobní
bakterie
Fotosyntetizující
bakterie
Mitochondrie
Moderní heterotrofní
eukaryotická buňka
Moderní fotosyntetizující
eukaryotická buňka
Vnější membrána
Vnitřní membrána
Krista
TEM
Matrix
Ribozomy
https://frombenchtobedside.wordpress.com/ http://archive.cnx.org/contents/420d9f1a-a15c-4ee5-b879-52dd4debf8d5@2/eukaryotic-origins
Michal Stoklasa, Mitochondrie anaerobních prvoků, Praha, 2015 http://www.biologyexams4u.com/2013/02/mitochondria-structure-and-function.html#.Vuar4Xqhlr8
Heterogenita ve velikosti, tvaru a konformaci mtDNA v závislosti na fylogenetickém postavení druhu
např. mnohobuněční živočichové - kružnicová dsDNA, 16 - 20kb, každý druh má svůj vlastní typ
vyšší rostliny - kružnicová či lineární dsDNA, 250 - 2000kb, variabilní uspořádání genů
Většinou 5 - 10 molekul dsDNA na mitochondrii
Biochemické děje mitochondrií zajišťují proteiny kódované jak mitochondriálními tak jadernými geny
Genofor mitochondrií člověka
• geny pro funkční RNA
- 2 molekuly rRNA (12S a 16S)
- 22 molekul tRNA
• 13 strukturních genů
- cytochrom c-oxidáza: COI, II, III (10)
- NADH-dehydrogenáza: ND1-ND6 (41)
- ATP-syntáz: ATPáza 6 a ATPáza 8 (14)
- ubichinon-cytochrom b-reduktáza: cyt b (10)
• geny pro ribozomové proteiny a DNA- a RNA-polymerázy
nahrazeny jadernými geny
• u živočichů jsou mitochondriální geny jednoduché
u hub a rostlin je řada z nich složených
Mitochondriový genofor
http://slideplayer.com/slide/4089202/ https://www.researchgate.net/figure/40691391_fig3_Figure-1-The-human-mitochondrial-DNA-gene-map-Human-mtDNA
• oxygenní fotosyntéza
i) světelná fáze fotosyntézy
- závislá na světle, probíhá v thylakoidech
- přeměna světelné energie na chemickou, vznik ATP a NADPH, vedlejším produktem je O2
ii) temnostní fáze fotosyntézy
- nezávislé na světle, ve stromatu
- uložení chemické energie fixací CO2 do sacharidů, tvorba glukózy a zásobních látek (škrob)
Semiautomní organely
Chloroplasty
• na povrchu dvojitá biomembrána
• thylakoidy - propojený systém plochých vaků, vznik vychlípením a odškrcením od vnitřní membrány
- navrstvení do tzv. gran, obsahují fotosyntetické pigmenty (zelený chlorofyl)
• tři kompartmenty - mezi membránami obalu, lumen thylakoidů
- stroma (matrix): vnitřní základní hmota, která obsahuje DNA, ribozomy a inkluze
http://clashtalk.kinja.com/take-a-minute-to-appreciate-photosynthesis-1742386609; http://www.biologydiscussion.com/chloroplasts/chemical-composition-of-chloroplasts-
600-words-biology/788; http://www.shmoop.com/photosynthesis/inputs-architecture.html
Stroma
Granum
Tylakoid
Vnitřní dvojvrstevná
membrána
Vnější dvojvrstevná
membrána
Genom rostlinné buňky rozdělen do jádra, mitochondrií a chloroplastů
Kružnicová dsDNA, 40-220 kb
Jednotná ve struktuře a organizaci genů napříč druhy:
• dvě obrácené repetice
• krátký a dlouhý jednokopiový úsek (SSC-úsek, LSC-úsek)
• polygenní transkripční jednotky
• geny pro podjednotky RNA-polymerázy (α, β, β´, β´´)
• geny pro rRNA (5S, 4,5S, 16S, 23S)
• geny pro tRNA (30 druhů)
• geny pro ribozomové proteiny
• geny pro proteiny fotosyntézy
- velká podjednotka RuBisCo
- proteiny fosfosystému I a II
- podjednotky ATP-syntázy
- podjednotky NADH-dehydrogenázy
Zvláštnosti genomu rostlin
• vzájemná závislost a spolupráce jaderná, mitochondriové a chloroplastové složky genomu
• rozdíly ve velikosti jaderného genomu vlivem různého počtu mnohonásobných repeticí
• mnohé geny součástí genových rodin (evoluční přežití rostlinného druhu)
Chloroplastový genofor
plantmethods.biomedcentral.com
Cytoplazmatická membrána
Funkce
• soudržnost buňky a její ochrana před vnějšími vlivy
• dává buňce tvar, ukotvení cytoskeletu
• semipermeabilita (polopropustnost) - regulovaný
transport látek mezi buňkou a okolím
• podíl na adhezi buněk a buněčné signalizaci
Složení
i) lipidy
• amfifilní dvojvrstva: hydrofilní polární část
hydrofóbní nepolární část
• tři skupiny: fosfolipidy (fosfatidylcholin, fosfatidylinositol, fosfatidylserin), glykolipidy, cholesterol
ii) proteiny
• integrální (zanořeny do lipidové vrstvy), ukotvené s lipidy, periferní (na povrchu lipidové vrstvy)
• funkce: receptory, signalizace, transport látek, mezibuněčný kontakt, kontakt cytoskeletu
iii) sacharidy
• ve formě glykolipidů a glykoproteinů
• tvoří glykokalyx na vnější straně buňky
• funkce: mechanická, informační, vazebná místa pro patogeny
Model tekuté mozaiky
• molekuly lipidů i proteinů jsou v neustálém pohybu, pohyb proteinů ve fosfolipidové dvojvrstvě
http://dl1.cuni.cz/mod/page/view.php?id=195338&lang=de
Transport mezi vnitrobuněčnými oddíly
Sekreční a endocytické dráhy
• potřeba spolupráce buněčných organel, které nejsou autonomní, ale slouží celé buňce
• mechanismy pro transport materiálů mezi organelami
• propojení některých organel funkčním sledem pochodů (dráha)
• sekreční (exocytická) dráha
- biosyntéza organel
- vylučování molekul do mezibuněčného
prostoru
• endocytická dráha
- příjem a zpracování signálů
a materiálu z vnějšího
prostředí
• vezikulární transport
- transport proteinů a lipidů
mezi organelami
- správné umístění molekul
uvnitř a vně buňky
Jaderná
membrána
Endoplazmatické
retikulum
Golgiho aparát
Lysozom
Pozdní endozom
Raný
endozom
CYTOPLAZMA
Sekreční váček
Cytoplazmatická
membrána
EXTRACELULÁRNÍ
prostor
http://www.histology.leeds.ac.uk/cell/endo-exo.php
Transport mezi vnitrobuněčnými oddíly
Chaperony
• podílejí se na translaci, podporují skládání proteinů do správné konformace, brání agregaci proteinů
• vazba na hydrofobní aminokyseliny polypeptidů, konformace vytvořena až po syntéze celé molekuly
• proteinové rodiny - Hsp70, Hsp90, válcovité chaperoniny
Hsp70 a jejich regulátory
• vazba na nově vznikající proteiny na ribozomu, stabilizace částečně složených polypeptidu
• tvořeny v buňkách vystavených stresu, vazba na chybně poskládané proteiny, sbalení po denaturaci
• působí při transportu proteinů
• DnaK: bakteriální Hsp70, podpůrné proteiny DnaJ a GrpE
DnaJ stimuluje hydrolýzu ATP
DnaK-ADP pevně váže nesložený protein
GrpE stimuluje uvolnění ADP
DnaK váže ATP
Uvolnění složeného proteinu
Vazba DnaJ k nesloženému peptidu
Vazba komplexu k DnaK-ATP
http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Folding4.html
Transport mezi vnitrobuněčnými oddíly
Hsp70 u savců
• Hsc73 (cytosol), BiP (ER), mHsp70 (mitochondrie), ctHsp70 (chloroplasty)
• Hsp40 - proteiny podobné DnaJ, vyhledávají specifické substráty
• ekvivalent GroE není třeba, samy si zajišťují výměnu ADP/ATP a uvolnění peptidu
Hsp90
• správné skládání a funkce receptorů pro steroidní hormony (kortizol, estrogen, progesteron, aj.)
• např. glukokortikoidový receptor (GR) - kortizol
• v klidovém stavu vazba s imunofilinem 51 a Hsp90,
které udržují GR ve správné konformaci pro vazbu
lignadu
• vazba kortizolu vyvolá konformační změnu, po které
se vymění imunofilin 51 za 52
• imunofilin 52 váže dynein (Dyn), který připojuje
komplex k cytoskeletu a zajišťuje jeho traslokaci
do jádra
• v jádře se pomocné proteiny uvolní, GR dimerizuje a
spouští expresi cílových genů
https://en.wikipedia.org/wiki/Hsp90#/media/File:Gr_hsp90_translocation.png
Transport mezi vnitrobuněčnými oddíly
Hsp60, chaperoniny
• válcovité částice na skládání proteinů, kterým poskytují
prostor oddělený od cytoplazmy
• umožňují skládání nových i denaturovaných proteinů
• Hsp70 a Hsp60 se často uplatňují postupně
Chaperoniny GroEL a GroES u E.coli
• GroEL - 2 kruhy ze sedmi podjednotek tvořící válec
• GroES - poklička válce
• vazba nesloženého proteinu na vnitřní stěnu kruhu GroEL
válce, který není blokován GroES
• vazba ATP ke každé podjednotce obsazeného kruhu
• hydrolýza ATP uvolňuje 14 molekul ADP a GroES
• vazba ATP a GroES k obsazenému kruhu
• skládání proteinu v ohraničeném prostoru
• hydrolýza ATP vede k uvolnění GroES a složeného proteinu
Obdobné struktury u eukaryot
• mitochondrie Hsp60 a Hsp10
• chloroplasty Cpn60 a Cpn10
• po translokaci proteinu do mitochondrií a chloroplastů s ním nejdříve asociují Hsp40 a Hsp70, které
zachovají jeho schopnost skládání a přenesou ho do chaperoninu, kde je skládání dokončeno
http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Folding4.html http://oregonstate.edu/instruction/bi314/summer09/Fig-08-23-0.jpg
Transport mezi vnitrobuněčnými oddíly
Třídění proteinů
• biosyntéza organel vyžaduje přísun nových molekul lipidů a proteinů
• proteiny pro jádro, mitochondrie, chloroplasty a peroxizomy transportovány přímo z cytoplazmy
pro Golgiho aparát, lysozomy, endozomy, extracelulární prostor přichází z ER
Zadržení v lumen ER
Import do jádra
Import do peroxizomů
Import do mitochondrií
Import do ER
Funkce signálu Příklad adresové sekvence
Adresová sekvence
• sekvence v proteinu určující do jaké organely má jít, protein bez této sekvence zůstává v cytosolu
• pořadí 15 - 60 aminokyselin
• přesné sekvence pro jednotlivé organely se mohou lišit, vliv
hydrofobních, kladně nabitých a záporně nabitých aminokyselin
Tři mechanismy importu proteinů do membránových organel
1. transport jaderným pórem
2. proteinové translokátory (ER, mitochondrie, chloroplasty)
3. transportní váčky (sekreční dráha z ER)
http://oregonstate.edu/instruction/bi314/fall12/proteinsorting.html
Import proteinů pomocí proteinových translokátorů
• proteinové translokátory v místech kde jsou v kontraktu obě membrány obalu organel
• vstup do mitochondrií a chloroplastů
- na N-konci transportovaného proteinu je adresová sekvence
- během přenosu je protein rozvinut a odstraněna adresová sekvence
- následuje transport přes membrány a opětovné složení proteinu
http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_12mitochondria.html
Import do mitochondrií
• přes jednu membránu do mezimembránového prostoru
přes obě membrány do matrix
• průběh importu do matrix
- cytoplazmatické Hsp70 rozvinou transportovaný protein
- receptor rozezná adresovou sekvenci
- směřování proteinu do póru translokátoru
- translokace proteinu vnější membránou (komplex TOM)
vnitřní membránou (komplex TIM)
- odštěpení adresové sekvence matrixovou proteázou
- vazba mHsp70 na přenášený protein napomáhá dokončení
translokace a jeho sbalení uvnitř mitochondrie
- translokace vnitřní membránou vyžaduje přítomnost
elektrochemického gradientu
- průchod vnější i vnitřní membránou vyžaduje ATP
Import do mitochondrií
• translokace do mezimembránového prostoru
i) translokace do matrix, odstranění adresové sekvence, odhalení
hydrofobní sekvence, která protein směřuje zpět přes vnitřní
membránu do mezimembránového prostoru (komplex OXA)
ii) sekvence zastavující přenos přeruší translokaci vnitřní membránou
a protein je odštěpen do mezimembránového prostoru
iii) translokace vnější membránou, vazba faktorů, které protein zadrží v
mezimembránovém prostoru
Import do chloroplastů
• obdoba transportu do mitochondrií
• translokační komplex TOC ve vnější membráně
• translokační komplex TIC ve vnitřní membráně
• adresová sekvence dlouhá 30 - 100 aminokyselin
(není kladně nabitá jako u mitochondrií)
• translokace vnitřní membránou nevyžaduje elektrochemický
gradient
• proteiny určené do lumen tylakoidu mají dvě adresové sekvence postupně za sebou
• účast ctHsp70 a Cpn60/10 na správném sbalení translokovaného proteinu
http://www.slideshare.net/aljeirou/protein-structure-targeting-and-sorting
Import proteinů pomocí proteinových translokátorů
Sekreční dráha
• cesta proteinu přes hrubé endoplazmatické retikulum - endoplazmatické retikulum - Golgiho aparát -
sekreční váčky - extracelulární prostor
• používána pro proteiny směřující do endoplazmatického retikula, Golgiho aparátu, lysozomů,
plazmatické membrány a vně buňky
• sekreční váčky - dopravní prostředky obsahující proteiny z vnitřních organel
- proteiny vyloženy po splynutí membrány váčku s membránou cílové organely
• poprvé pozorována u buněk žlázového epitelu pomocí radioaktivně značených aminokyselin
3 minuty
(endoplazmatické
retikulum)
7 minut
(Golgiho aparát)
120 minut
(extracelulární
prostor)
Radioaktivní
protein
Sekreční
váčky
Golgiho
aparát
Hrubé ER
https://www.studyblue.com/notes/note/n/biology-101-chapter-4-6/deck/1098008 http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_11protsorting.html
Sekreční dráha
Endoplazmatické retikulum (ER)
• systém vzájemně propojených plochých váčků a kanálků
• membrány navazují na jaderný obal, lumen navazuje na perinukleární prostor
• dává vzniknout Golgiho aparátu, lysozomům, plazmatické membráně
• funkce: biosyntéza proteinů a lipidů, přeprava látek transportními váčky, skladovaní buněčných
produktů, reakce na podněty z vnějšího prostředí (Ca2+ signalizace)
• drsné - na cytoplazmatickém povrchu navázány ribozomy, syntéza proteinů
• hladké - bez ribozomů, metabolismus lipidů a polysacharidů, detoxifikační reakce, zásobárna Ca2+
Import proteinů do ER
• adresová sekvence pro ER se nazývá signální sekvence
• odstranění signální sekvence z proteinu ER umístí protein do cytosolu
• začlenění signální sekvence do cytoplazmatického proteinu způsobí
jeho nasměrování do ER
Cytoplazmatický
protein
ER protein Signální
sekvence
Cytoplazmatický protein
se signální sekvencí
ER protein s odstraněnou
signální sekvencí
NORMÁLNÍ STAV ÚPRAVA SIGNÁLNÍ SEKVENCE
Drsné ER Hladké ER
http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_11protsorting.html
• syntéza všech proteinů začíná na volných ribozomech
• po vytvoření signální sekvence je ribozom přitahován k ER
pomocí částice SRP
• vazba SRP na signální sekvenci dočasně zastavuje translaci
• v membráně ER je SRP receptor, který přitahuje komplex
ribozom/peptid/SRP
• vazba ribozomu k translokačnímu komplexu v membráně ER
• po vazbě GTP se signální sekvence začlení do membránového
kanálku
• hydrolýzou GTP se uvolní SRP, translace pokračuje a rostoucí
peptid prochází membránou ER
• odštěpení signální sekvence signální peptidázou
• uvolnění peptidu do lumen ER
Syntéza proteinů v drsném ER
• kromě vlastní syntézy proteinů se ER podílí i na jejich struktuře - sbalování proteinů, tvorba
disulfidických vazeb, sestavování oligomerních proteinů, prvotní místo glykosylace
• ER je hlavní křižovatka v dopravě proteinů po buňce
i) volné proteiny jdou skrz membránu do lumen ER, kde jsou uvolněny
- proteiny vyskytující se v lumen organel, sekretované ven z buňky
ii) membránové proteiny zůstávají zanořeny v membráně ER
- proteiny vyskytující se v membránách organel, plazmatické membráně
Sekreční dráha
http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_11protsorting.html
Začlenění proteinu do membrány ER
• různé orientace proteinu a počet jeho průchodů přes membránu
• sekvence zastavující přenos, vnitřní signální sekvence
- hydrofobní oblasti, které ukotvují proteiny v membráně
- α-šroubovice, 20 - 25 aminokyselin, interakce s fosfolipidy
- vnitřní s.s. rozeznána pomocí SRP, neštěpena signální peptidázou
- jejich orientace určují orientaci proteinu v membráně
Sekreční dráha
http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_11protsorting.html
• různé orientace proteinu
• protein procházející membránou několikrát
- důsledek střídání vnitřních signálních sekvencí a sekvencí zastavujících přenos
Sekreční dráha
Sbalování a úprava proteinů v ER
• sbalování - chaperony v ER hojně zastoupeny, rodiny Hsp70 (BiP) a Hsp90 (Grp94)
• štěpení - odstranění některých aminokyselin po translaci
- vždy odstranění iniciačního Met a signální sekvence, u některých proteinů i jiné sekvence
- např. inzulín: v buňkách pankreatu syntetizován jako preproinzulín
odstraněním signální sekvence se do lumen ER uvolňuje proinzulín
vyštěpení a degradace interní sekvence
spojení výsledných dvou polypeptidů disulfidickou vazbou → inzulín
• tvorba disulfidických vazeb - disulfid izomeráza, vazby zajišťující nejstabilnější konfiguraci proteinu
• glykosylace - připojení oligosacharidů
http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_11protsorting.html
Spojující
peptid
Signální
sekvence
Štěpení signální sekvence
Tvorba disulfidických vazeb
Vyštěpení spojujícího
peptidu
Chybná disulfidická vazba
Správná disulfidická vazba
Sekreční dráha
Hladké endoplazmatické retikulum
• syntéza membránových lipidů (fosfolipidy, glykolipidy, cholesterol)
• chemické vlastnosti lipidů vyžadují, aby se tvořily ve spojení s již existujícími membránami
• syntéza na cytosolické straně membrány ER
• syntéza fosfolipidů
- vznik kyseliny fosfatidové z glycerol-3-fosfátu a mastných kyselin nesených CoA
- začlenění kyseliny fosfatidové do membrány a její další konverze
- translokace fosfolipidů přes membránu, aby se nehromadily na cytosolické polovině ER, flipázy
http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_11protsorting.html
Membrána ER
Syntéza fosfolipidů
Nové lipidy připojeny
jen na cytosolickou
polovinu dvojvrstvy
Růst obou stran
fosfolipidové
dvojvrstvy
Flipáza
Sekreční dráha
Vezikulární transport z ER
• směřuje do Golgiho aparátu, lysozomů, plazmatické membrány, extracelulárního prostoru
• proteiny a lipidy po cestě upravovány (glykosylace, tvorba disulfidických vazeb)
• náklad váčků je specifický, daný receptory v membráně váčku
• proteiny určené pro lumen ER mají na C-konci adresovou sekvenci Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL)
Golgiho aparát (GA)
• systém plochých nádrží (cisteren) a kanálků
• funkce: zpracování, třízení a modifikace proteinů z ER (glykosylace proteinů), syntéza glykolipidů
• cis strana - vznik nových cisteren fúzí váčku z ER
• přechod váčků přes jednotlivé střední části GA
• trans strana - pučení váčků, které směřují zpět do ER, zpět do GA, ven z buňky
- vznik lysozómů
cis
strana
cis
cisterna
střední
cisterna
trans
cisterna
trans
strana
transportní
váček
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-12/12_08.jpg http://slideplayer.com/slide/2759214/
Sekreční dráha
Transportní váčky
• různé typy váčků pro transport specifického nákladu
• vykonávají kyvadlovou dopravu mezi organelami
• opláštěné váčky - proteinový obal na cytosolické straně váčků
- napomáhá tvarovat membránu do podoby váčku
- účast na zachycení specifických molekul
- po odškrcení váčku je plášť odstraněn a váček fúzuje s cílovou mem.
Typ váčku Proteiny pláště Výchozí organela Cílová organela
Klathrinový klathrin + adaptin 1 GA lysozom
Klathrinový klathrin + adaptin 2 plazmalema endozom
COP proteiny Coat ER GA
cisterna GA cisterna GA
GA ER
Klathrinové váčky
• nakládaná molekula - receptor - adaptin - klathrin
• molekuly klathrinu vzájemně interagují a tvoří síť, která
narušuje membránu, postupně vzniká jamka a váček
s klathrinovým pláštěm
• dynamin se váže kolem ústí váčku a za hydrolýzy GTP se
stáhne a odškrtí váček od membrány
http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_11protsorting.html
Sekreční dráha
Klathrinové váčky
• začlenění specifických proteinů do klatr. váčků
• proteiny určené pro transport z GA do lysozomů
označeny přítomností manóza-6-fosfát
• receptor pro manóza-6-fosfát v membráně na
trans straně GA
• přes cytosolické adaptiny se k receptoru váží
klatriny, které spojí svoje řetězce v sít a zahajují
pučení váčku
COP váčky
• přeprava molekul mezi ER a GA, v rámci GA
• plášť tvořen proteiny Coat
• pro odškrcení váčku nutná účast proteinu ARF (GTPáza)
• ARF-GTP se spojuje s membránou GA, je nutný pro vazbu Coat
proteinů a podílí se na tvorbě váčků
• po vytvoření a odškrcení váčku hydrolýza ARF-GTP na ARF-GDP
• rozložení COP, fúze váčku s cílovou membránou
http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_11protsorting.html www.uni-tuebingen.de
fúze
váčku
hydrolýza GTP
odškrcení váčku
výměna GDP/GTP
aktivace ARF
vazba Coat
Klathrin
Lysozomální
protein
Manóza-6-
fosfát
Receptor
pro manóza-
6-fosfát
Adaptin
Volný
klathrin
Klathrinový
váček
Odškrcení
Cytosolická
strana
Lumen GA
Trans
strana GA
Manóza-6-
fosfát
Lysozomální
proteiny
Receptor pro
manóza-6-fosfát
Sekreční dráha
Doručení váčků
• navádění váčků k cíli závisí na proteinech SNARE
• v-SNARE na povrchu váčků specificky rozeznány t-SNARE na povrchu
cílových membrán
• unikátní SNARE pro každou organelu a typ transportních váčků
• interakce proteinů NSF a SNAP zodpovídá za fúzi váčku s cílovou
membránou
Sekrece molekul z buňky
i) řízená
• sekrece molekul po přijetí signálu
• transportní váčky splývají a tvoří větší váček
• po přijetí signálu jeho exocytóza
• do váčků jdou specifické molekuly, běžné u žlaznatých buněk
ii) konstitutivní
• sekrece průběžná, bez signálu
http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_11protsorting.html http://www.utm.utoronto.ca/~w3bio315/pdf/OLD-PDF/2009%20Fall/lecture16.pdf
Lysozomy
• funkce: nitrobuněčné trávení, rozklad materiálu z nitra i vnějšku buňky
• váčky uzavřené membránou (0,05 - 0,5 µm)
• obsahují zhruba 50 typů kyselých hydroláz na rozklad všech organických složek buňky
• hydrolázy fungují při pH ~ 5, kyselé pH udržují ATP dependentní H+ pumpy
• proteiny v membráně lysozomu chráněny glykosylací
• primární lysozom vniká odškrcením od GA - po splynutí s endozomem vzniká sekundární (aktivní)
lysozom - terciální lysozom s nestravitelnými zbytky odstraňovanými exocytózou
• přes 30 genetických chorob člověka s mutantními geny pro lysozomální enzymy
- např. Gaucherova nemoc: glukocerebrosidáza na rozklad glykolipidů, léčba aplikací enzymu
Sekreční dráha
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-12/12_08.jpg http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_11protsorting.html
Endocytická dráha
Endocytóza
• příjem částic, molekul a kapaliny z vnějšího prostředí
• malé molekuly přijímány u všech buněk
• velké částice a celé buňky přijímány fagocytujícími buňkami
• pohlcovaný materiál obklopen plazmalemou - pučení dovnitř buňky - odškrcení endocytického váčku
- fúze s lysozomem
i) pinocytóza
• pohlcení kapaliny a malých molekul
• využití klathrinových jamek a váčků
• neutrální, nerozlišuje přijímaný materiál
• průběžné pohlcování částí plazmalemy
ii) fagocytóza
• pohlcení velkých částic pomocí fagozomů
• vazba částice k povrchovým receptorům - tvorba
pseudopodií obklopujících částici - tvorba fagozomu
- fúze s lysozomem - fagolysozom
iii) autofagie
• rozklad vlastních struktur
• staré organely, hladovějící buňky
• uzavření organely v membráně z ER - tvorba autofagozomomu
- fúze s lysozomem
FAGOCYTÓZA
PINOCYTÓZA
AUTOFAGIE
GA
Primární
lysozom
Endocytický
váčekFagozom
Využití živin
během procesu
degradace
Plazmatická
membrána
Terciální
lysozom
ER
Exocytóza degradovaného materiálu
a kyselých hydroláz
Sekundární
lysozom
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-12/12_08.jpg
Endocytická dráha
Endocytóza přes povrchové receptory
• selektivní zvýšení koncentrace látek v buňce
• vazba molekul k příslušným receptorům - uzavření komplexu receptor/
ligand do klathrinových váčků - odstranění obalu váčku - fúze s lysozomem
- zpracování pohlceného materiálu, recyklace receptorů
• např. cholesterol
Cholesterol
• nezbytný pro tvorbu membrán
• v krvi vázán na proteinovém nosiči a společně tvoří
lipoproteiny
• nízkodenzitní lipoprotein LDL vzniká v játrech a dopravuje
cholesterol k buňkám
• vazba LDL s cholesterolem na LDLR - klathrinová
endocytóza - fúze s lysozomem - uvolnění LDL od
LDLR v kyselém prostředí lysozomu - recyklace
receptorů - rozložení LDL - uvolnění cholesterolu do
cytoplazmy
• porucha LDLR receptoru: hromadění cholesterolu
v krvi, vývoj aterosklerózy, srdeční infarkty v raném
věku
Plazmatická membránaLDL receptoryLDL
CYTOPLAZMA
Endocytóza
Uvolnění pláště
Fúze s lysozomem
Endolysozom
Odškrcení
transportního váčku
Recyklace LDLR
Kyselé hydrolázy
Volný
cholesterol
Klathrinový
váček
Cytoskelet
Struktura Dutý válec, stěna z 13 protofilament Dva propletené řetězce F-aktinu 8 protofilament
Monomery α-tubulin
β-tubulin G-aktin Cytokeratin, vimentin, desmin,
neurofilamenta, nestin, laminy
Polarita (+) a (-) konce (+) a (-) konce ---
Funkce Organizace a udržení tvaru
a polarity buňky Kontrakce svalů Podpora buněčných struktur
Pohyb chromozomů Pohyb buněk, cytokineze Udržení tvaru buňky
Intracelulární transport Proudění cytoplazmy Tvorba jaderné laminy a lešení
Pohyb organel Udržení tvaru buňky Zesílení axonů nervových buněk
Pohyblivost buněk (axonema) Intracelulární transport Organizace svalových vláken
Mikrotubuly Mikrofilamenta Intermediální filamenta
αβ-tubulinové heterodimery Monomery G-aktinu Dimery intermediálních filament
Mikrotubuly
Mikrofilamenta
Intermediální filamenta
Spoje buněk
• struktury zajišťující trvalé spojení sousedních buněk a spojení buněk s extracelulární matrix (ECM)
• důležité pro morfologii a funkci epitelů s těsným uspořádáním buněk
• vyžadují napojení na cytoskelet
Těsné vazby
• brání průniku molekul a tekutiny
Adherentní vazby
• propojují mikrofilamenta sousedních buněk
Desmozomy
• propojují intermediální filamenta sousedních buněk
Mezerové spoje
• spojují cytoplazmy sousedních buněk
Hemidesmozomy
• připojují intermediální filamenta k bazální lamině
Polarita epiteliálních buněk
• apikální povrch - přítomnost mikroklků a řasinek
- pohyb hlenů v dýchací trubici, vajíčka ve vejcovodu, umístění speciálních receptorů
• laterální povrch - přítomnost adherentních, mezerových a těsných vazeb a desmozomů
- spojení buněk přes speciální ligandy a cytoskelet
• bazální povrch - přítomnost hemidesmozomů a adhezivních plaků
- ukotvení buněk v bazální lamině
Bazální lamina
Aktin
Klky
Intermediální
filamenta
ECM
HEMIDESMOZOMY MEZEROVÉ SPOJE
DESMOZOMY
ADHERENTNÍ VAZBY
TĚSNÉ VAZBY
http://csls-text3.c.u-tokyo.ac.jp/active/11_06.html
Spoje buněk
Adherentní spoje, desmozomy a hemidesmozomy obsahují plaky
• destičky či pásy lokálně nahromaděného materiálu na cytosolické straně plazmatické membrány
• vytvořeny z adaptorových proteinů
• ukotvení transmembránových spojovacích proteinů, které váží ECM či protein sousední buňky
• vazba cytoskeletu
Adherentní vazby
• kadheriny - spojovací proteiny, homofilní vazby v přítomnosti Ca2+
- přemosťují mezibuněčný prostor svými extracelulárními doménami
• adaptorové proteiny - kateniny (α, β, p120), vinkulin
• interakce s mikrofilamenty (F-aktin)
Plaky z adaptorových
proteinů
Plazmatická membrána
Vlákna cytoskeletu
Spojovací
proteiny
Mezibuněčný
prostor
http://yxsj.baiduyy.com/whole/image/chapter7/7.26.jpg https://en.wikipedia.org/wiki/Desmosome#/media/File:Desmosome_cell_junction_en.svg
Spoje buněk
Desmozomy
• mechanické svorky zajišťující soudržnost tkáně a silnou adhezi buněk (střevní epitel, kůže, srdce)
• spojovací proteiny - speciální kadheriny desmocolin a desmoglein
• adaptorové proteiny tvořící silné plaky - plakofilin, plakoglobin, desmoplakin
• interakce s intermediálními filamenty, které vyčnívají z plaků do nitra buňky - tonofibrily
• Pemphigus vulgaris - autoimuitní onemocnění kůže, tvorba protilátek proti desmogleinu
- narušena adheze epitelu, mezi buňky proniká tělní tekutina, tvorba puchýřů
Hemidesmozomy
• propojení buněk s bazální laminou a tím ECM
• podobnost s desmozomy, avšak místo kadherinů používají jako spojovací proteiny integriny, které se
váží k laminům bazální membrány
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-17/CB17.html
http://dermaamin.com/site/histopathology-of-the-skin/68-p/2023-pemphigis-vulgaris-.html http://slideplayer.com/slide/4173835/
Pemphigus vulgaris (kůže)
Spoje buněk
Těsné vazby
• většinou těsně pod apikálním povrchem, bez prostoru mezi buňkami
• spojovací proteiny - claudin, ocludin, JAM (junction adhesion molecules)
- těsné uspořádání, homofilní interakce s proteiny sousední buňky
• podíl na polarizaci buněk, brání laterálními pohybu membránových lipidů a proteinů
• překážka pro průchod tekutin a molekul přes vrstvu buněk, oddělení tělních dutin
• míra jejich propustnosti rozhoduje o průchodu molekul transbuněčnou či parabuněčnou
drahou
• transport glukózy přes střevní epitel
- vstup do buňky na apikální straně přes Na+/glukóza synportní protein
- export glukózovým transportérem na bazolaterálním povrchu
Těsné vazby
Plazmatické membrány
sousedních buněk
Spojovací proteiny
Spojovací proteiny
Apikální povrch
Těsné vazby
Bazolaterální povrch
Paracelulární dráha:
přes těsné vazby
Transcelulární dráha:
přes membrány buněk
Transport glukózy ve střevech
http://clinicalgate.com/membrane-physiology/ http://bio100.class.uic.edu/f06pm/lect06.htm http://klinphys.charite.de/for721/f_summary_e.htm
http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/biomembrane2/tight.html; http://www.bio.davidson.edu/bernd/Lab/EpithelialInfoWeb/Tight%20Junctions.html
Spoje buněk
Mezerové spoje
• umožňují přímou chemickou a elektrochemickou komunikaci buněk
• membránový protein konexin
• 6 molekul konexinu uspořádaných do kruhů tvoří dutý válec konexon
• konexony dvou sousedních buněk tvoří hydrofilní kanál, který
propojuje cytoplazmy buněk
• umožňují tok malých molekul mezi buňkami (ionty, cukry, cAMP)
Spojení buněk s ECM
• fokální adheze a hemidesmozomy
• oba typy vazeb zprostředkovány integriny
• rozdíl v napojení na cytosklelet - fokální adheze váží mikrofilamenta
- hemidesmozomy váží intermediální filamenta
Plazmatické membrány
sousedních buněk
Cytosolická strana
membrány
Extracelulární strana
membrány
Konexiny uspořádané
do konexonů
Hydrofilní kanál
Buňka 1
Buňka 2
Extracelulární
prostor
Integrin
Cytosolická strana
membrány
Vazebné místo pro adaptorové proteiny
Plazmatická
membrána
Extracelulární
strana
membrány
Vazebné místo pro proteiny ECM
Cytoplazma
Fokální adheze
Plazmatická
membrána
ECM
Cytoplazma
Plazmatická
membrána
Intermediální
filamenta
Adaptorové proteiny
tvořící plak
Integrin
(α6β4)
Bazální lamina
Laminin
Kolagenové fibrily
Kolagenová
vlákna
ECM
Hemidesmozom
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-17/CB17.html https://quizlet.com/12976144/cell-bio-lecture-11-flash-cards/