Molekulární biologie pro
informatiky - 9
Regulace buněčného cyklu
V roce 2001 udělena Nobelova cena za fyziologii nebo lékařství
za objevy v oblasti buněčného cyklu.
Leland Hartwell objevil specifické geny, které řídí buněčný cyklus
zavedl pojem kontrolní body buněčného cyklu
Paul Nurse identifikoval cyklin-depenentní kinázy
prokázal jejich evoluční konzervativnost
Timothy Hunt objevil cykliny
prokázal jejich degradaci během buněčného cyklu
Historie objevů buněčného cyklu
„When a cell arises, there must be a previous cell,
just as animals can only arise from animals and plant from plants.“
Rudolph Virchow, 1858
http://www.slideshare.net/SaifulAlom/nobel-2014-43059120 https://en.wikipedia.org/wiki/Rudolf_Virchow#/media/File:Rudolf_Virchow_NLM4.jpg
Dělení buněk
Všechny buňky pochází z již existující buňky.
Množení buněk probíhá prostřednictvím buněčného dělení.
Prokaryota
• příčné dělení buněk
• tvorba nové buněčné stěny mezi kopiemi bakteriálního chromozomu
Eukaryota
• na začátku vývoje mnohobuněčného organizmu je jediná buňka
• dělení buněk nezbytné pro
- růst organizmu
- náhradu poškozených a starých buněk
- šíření genetické informace: mitóza, meióza
http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap01/week01.html http://sciencelife.uchospitals.edu/2015/05/22/cutting-through-a-cell-division-mystery/
• před vlastním rozdělením se buňka musí zvětšit,
zduplikovat chromozomy a zajistit jejich přesné
rozdělení do dceřiných buněk
• koordinace těchto procesů probíhá v rámci
buněčného cyklu
• dělení buněk je přísně řízeno, aby se zachovala
jednota mnohobuněčného organizmu
• ztráta kontroly dělení vede k abnormálnímu
vývoji a může být příčinou nádorů
Buněčný cyklus
• cyklus životních procesů buňky, které začínají jejím zrozením a končí tvorbou dceřiných buněk
• přesná návaznost buněčných procesů, dvě odlišné fáze:
Interfáze
• růst buňky, duplikace organel, zvýšený metabolismus
G1 první růstová fáze, aktivní syntéza RNA a proteinů
buňka hromadí energii a připravuje se na syntézu DNA
(replikační proteiny, histony)
S syntéza DNA, duplikace chromozomů
G2 druhá růstová fáze, pokračuje syntéza RNA a proteinů
růst buňky a příprava na M fázi (mitotické vřeténko)
M fáze
• mitóza (rozdělení jádra) a cytokineze
(rozdělení buňky)
• kondenzace chromatinu
• rozpad jaderné membrány
• tvorba vřeténka a kinetochorů
• separace chromatid
• rozpad vřeténka
• dekondenzace chromatinu
• tvorba membrány, rozdělení buňky
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html http://www.bio.utexas.edu/faculty/sjasper/bio212/mitosis.html
Kondenzující
chromozomy
Centromera
Sesterské
chromatidy
Mitotické
vřeténko
Separace sesterských
chromatid
Tvorba dceřiných
buněk
MITÓZA
CYTOKINEZE
Buněčný cyklus
Syntéza DNA během buněčného cyklu
• veškerá struktura a funkce buňky jsou kódovány DNA
• při dělení musí každá buňka získat kompletní genetickou informaci
• DNA se replikuje před vlastním rozdělením buňky
• dochází k duplikaci chromozomů
• buňka v G2 fázi má 2x vyšší obsah DNA než v G1 fázi
• vzniklé kopie chromozomů jsou spojeny v oblasti centromery, tvoří
sesterské chromatidy, které se při dělení jádra oddělují
Sesterské
chromatidy
sphweb.bumc.bu.edu http://genes.atspace.org/27.1.html
Syntéza proteinů a RNA během buněčného cyklu
• stále stejně rychlá během interfáze
• v M fázi klesá syntéza proteinů a zastavuje se syntéza RNA
• všechny proteiny se tvoří během interfáze průběžně
• výjimkou jsou histony, které se tvoří pouze v G1 a S fázi
• po dokončení replikace jsou histonové mRNA degradovány
Buněčný cyklus
Časové nároky buněčného cyklu
• rychlost buněčného cyklu je určena vnitřními a vnějšími stimuly
• buňky s výraznou specializací bez schopnosti se dělit (neurony, svalové
buňky, červené krvinky)
• buňky, které se dělí jen za určitých podmínek (jaterní buňky, lymfocyty)
• rychle se dělící buňky (epiteliální, krevní kmenové buňky)
• většinu doby zabírá interfáze, podle typu buňky může trvat hodiny, dny,
týdny, měsíce, roky
• kvasinky 1,5 - 3 hod, střevní epitel 12 hod, savčí fibroblasty v kultuře 20
hod, savčí játra cca 1 rok
• proliferující lidská buňka má cca 22 hodinový cyklus
• buňka, která se přestane dělit, vstupuje do klidové fáze G0
• variabilita dána délkou G1 fáze
Bod restrikce
• v pozdní G1 fázi
• na přechod z fáze G1 do S je potřeba mimobuněčný signál
(růstový faktor, mitogen)
• bez tohoto signálu buňka cyklus opustí a vstoupí do G0
Bod restrikce
Růstové faktory
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html http://clinicalgate.com/introduction-to-the-cell-cycle/#cetextbox3
G1 fáze
http://unexpected-grace.blogspot.cz/2013/06/day-3-update.html
• první růstová fáze po rozdělení buňky, navazuje na cytokinezi
• buňka potřebuje dosáhnout původní velikosti buňky mateřské
• u raných embryí chybí fáze G1 a G2, buňka se dělí a zmenšuje
• tvorba cytoplazmy a nových organel, syntéza RNA a strukturních i regulačních proteinů
• příprava buňky na S fází - syntéza replikačních proteinů a histonů
• běžná metabolická aktivita
• délka závisí na typu buňky, dostupnosti živin a růstových faktorů, přítomnosti inhibitorů proliferace
• v optimálních podmínkách 9 - 11 hod
• genetický materiál ve formě dekondenzovaného chromatinu, 2n molekul DNA (46 u lidí)
• bod restrikce citlivý na vnější faktory, 1. kontrolní bod buněčného cyklu
• na konci fáze se buňka rozhoduje, jak bude pokračovat
i) vstup do G0 fáze: klidová fáze, buňka se nedělí
absence růstových faktorů, senescence, diferencované buňky
ii) vstup do S fáze: po překonání bodu restrikce, buňka navazuje dalším buněčným dělením
2 buňky 4 buňky 5 buněk 6 buněk 8 buněk 10 buněk
S fáze
• semikonzervativní replikace DNA
• v rámci replikonů založeny v místech ori obousměrné replikační vidlice
• replikační proteiny - iniciační proteiny, helikázy, polymerázy, RNázy, ligázy, telomeráza
• syntéza DNA vyžaduje templátový DNA řetězec a RNA primer
• vedoucí řetězec tvořen kontinuálně, opožďující se řetězec přes Okazakiho fragmenty
• replikace konců lineárních chromozomů zajištěna telomerázou
Směr pohybu
replikační vidlice
Místo spoje fragmentů
Opožďující se řetězec
Okazakiho fragment
RNA-primer
Vedoucí DNA řetězec
• správnost replikace zajištěna přesností a proofreadingovou aktivitou DNA
polymerázy, opravou chybného párování bází
• zdvojení genetického materiálu, chromozomy složené ze sesterských chromatid
http://www.nature.com/nrm/journal/v8/n6/fig_tab/nrm2180_F2.html
http://novazeme.ning.com/forum/topics/tajemstv-skryt-ho-v-dom?xg_source=activity http://www.osel.cz/8311-jsou-centrioly-nositelkami-informace.html
G2 fáze
• druhá růstová fáze, premitotická fáze
• syntéza proteinů a tvorba organel, soustavná příprava na M fázi
• syntéza proteinů mitotického vřeténka, duplikace centriolu
• zreplikovaný genetický materiál, 2 x 2n molekul DNA, dvě sesterské chromatidy v chromozomu
• dekondenzovaný chromatin
• 2. kontrolní bod buněčného cyklu, kontrola celistvosti DNA a správnosti replikace
Centriola
• párová organela eukaryotické buňky, není v buňkách rostlin a hub
• schopná samostatného dělení
• devět trojic mikrotubulů kolem centrální dutiny
• dvě spojené vzájemně kolmo orientované v M a G1 fázi
• duplikace v S a G2 fázi, ve vzniklém páru vždy jedna centriola původní a jedna nová
• spolu se svým okolím tvoří centrozom, který organizuje mitotické vřeténko
Triplet mikrotubulů
Spojovací
vlákna
Příčný řez centriolou Uvolnění centriol
M / brzká G1 S G2 Mitóza
Centrozm
Duplikace a elongace Zrání a separace
http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision.htm http://www.nature.com/nrm/journal/v9/n1/fig_tab/nrm2310_F2.html
M fáze
• zahrnuje dělení jádra (mitóza, karyokineze) a cytoplazmy (cytokineze)
• na základě změn v morfologii a chování chromozomů mitóza rozdělena do 5 fází
1) Profáze
• kondenzace chromozomů do podoby viditelné světelným mikroskopem
• sesterské chromatidy spojené v oblasti centromery
• posun centrozomů na opačné strany buňky
• v centrozomech zahájena tvorba mitotického vřeténka
2) Prometafáze (pozdní profáze)
• tvorba kinetochorů na chromozomech
- velký proteinový komplex v oblasti centromery
- umožňuje vazbu chromozomů na mikrotubuly vřeténka
- vnitřní vrstva rozpoznává a váže centromerovou DNA
- prostřední vrstva spojuje vnější a vnitřní vrstvu
- vnější vrstva se váže k (+) koncům mikrotubulů, obsahuje
motorové proteiny, vychází z ní vláknitá korona
2) Prometafáze (pozdní profáze)
• rozpad jaderné membrány a jadérka
• ustálení pozice centrozomů na opačných stranách buňky
• pohyb chromozómů do středu buňky
• tvorba mitotického vřeténka
- polarita tubulinu: (-) konec v centrozomu, (+) konec roste na opačném konci
- dynamická struktura, zkracování a prodlužování (de)polymerací tubulinu
- po rozpadu jaderné membrány (+) konce vřeténka kontaktují kinetochory
- kinetochorové mikrotubuly: připojeny ke kinetochorům
- polární mikrotubuly: připojeny k tubulům z opačného pólu vřeténka
- astrální mikrotubuly: připojeny k proteinům plazmatické membrány
M fáze
https://en.wikipedia.org/wiki/Spindle_apparatus#/media/File:Kinetochore.jpg
http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision.htm http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html
Centrozom
Kinetochorové
mikrotubuly
Polární
mikrotubuly
Astrální
mikrotubuly
Dynamika tubulinových podjednotek
http://electronicimaging.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=1100191 https://en.wikipedia.org/wiki/Karyotype#/media/File:Sky_spectral_karyotype.png
M fáze
3) Metafáze
• dokončena kondenzace chromozomů
• chromozomy taženy / tlačeny kinetochorovými mikrotubuly
• seřazení chromozomů v ekvatoriální rovině mezi póly vřeténka (metafázní destička)
• sesterské chromatidy každého chromozomu připojeny k opačným pólům vřeténka
• sestavení karyotypu z buněk zastavených v metafází (kolchicin)
Klasický karyogram
Spektrální karyogram
Metafázní
chromozomy G1 chromozomy
M fáze
4) Anafáze
• rozdělení centromer, separace sesterských chromatid
• pohyb chromatid k pólům vřeténka
- zkracování kinetochorových mikrotubulů
- vzdalování pólů vřeténka
- účast motorových proteinů
• u každého pólu vřeténka shromážděna stejná sada
genetické informace, základ dceřiných buněk
5) Telofáze
• pokračuje prodlužování polárních mikrotubulů, příprava na cytokinezi
• chromozomy, které dorazily k pólům vřeténka, začínají dekondenzovat
• rozpad kinetochorů, rozpad mitotického vřeténka, tvorba jadérka
• obnova jaderné membrány kolem sady sesterských chromatid
Pohyb chromozomů
k pólům vřeténka
Vzdalování pólů
vřeténka
http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision.htm http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html
Jaderná membrána během M fáze
G2 Profáze Metafáze
Kondenzace chromatinu
Rozklad jaderných pórů
a jaderné laminy
Tvorba ER s proteiny
jaderné membrányFragmentace jaderné
membrány
Brzká anafáze Pozdní anafáze Telofáze
Tvorba jaderné
membrány
Sestavování jaderných
pórů a příprava laminů
Dokončení
jaderných pórů
Sestavení jaderné
laminy
http://www.nature.com/nrm/journal/v10/n3/full/nrm2641.html
Cytokineze
• rozdělení cytoplazmy po rozdělení chromozomů k opačným pólům vřeténka
• ukončuje buněčné dělení, vznik dvou identických dceřiných buněk, menších než buňka mateřská
• nemusí po mitóze vždy následovat, replikace a dělení jádra bez cytokineze (endocykly)
např. brzká vývojová stádia D. melanogaster
Živočišná buňka
• kontraktilní prstenec z aktinových filament
• stahování prstence v přítomnosti myozinu a ATP tvoří dělící rýhu
Rostlinná buňka
• buněčná destička mezi dceřinými buňkami
• tvorba destičky z materiálu dopraveného z GA (polysacharidy, glykoproteiny)
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html; http://america.pink/emil-heitz_1423728.html; http://slideplayer.com/slide/6821210/
Živočišná buňka
Kontraktilní prstenec Dceřiné buňky
Dělící rýha
Rostlinná buňka
Dceřiné buňkyPůvodní
buněčná stěna
Tvorba
buněčné destičky
Evoluce mitózy
a) Prokaryota
b) Obrněnky (Dinozoa)
c) Rozsivky (Diatomeae) a kvasinky
d) Většina eukaryot
Bakteriální chromozom
Chromozomy
Mikrotubuly
Jaderná membrána
Kinetochorové mikrotubuly
Jaderná membrána
Kinetochorové mikrotubuly
Centrozom
Fragmenty jaderné membrány
Počátek replikace
oriC
Buněčná stěna
Plazmatická
membrána
Bakteriální chromozom
Dvě kopie oriC
oriC oriC
E. coli
https://www.studyblue.com/notes/note/n/ch-12-mitosis-lecture/deck/6936213 http://slideplayer.com/slide/273141/
Meióza
Nepohlavní rozmnožování
• jedna buňka se dělí a vznikají dvě nové, identické dceřiné buňky
• např. mitóza, binární dělení
Pohlavní rozmnožování
• spojení dvou buněk za vzniku nové buňky (zygota), která je odlišná
od těch původních
Meióza
• redukční dělení
• probíhá v zárodečných buňkách, vznikají gamety (vajíčka, spermie)
• interfáze s replikací chromozómů, dvě meiotická dělení
• původní buňka je diploidní (2n), vznik čtyř dceřiných buněk, které
jsou haploidní (n)
• redukuje počet chromozomů na polovinu, oplodněním se obnovuje
diploidní stav
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-20/CB20.html
Diploidní - 2n
92 dsDNA
Diploidní - 2n
46 dsDNA
Haploidní - n
46 dsDNA
Čtyři pohlavní buňky (haploidní, n, 23 dsDNA)
Pár homologních
chromozomů
Sesterské
chromtaidy
Replikace DNA
Meióza I
Meióza II
Spermatogeneze
Spermatidy
(haploidní)
Spermie
(haploidní)
Spermatogonium
(diploidní)
Oogeneze
Polární tělíska
(haploidní)
Oocyt
(haploidní)
Oogonium
(diploidní)
Meióza I - redukční dělení
• separace homologních chromozomů s různými alelami genu
• neobvyklý typ buněčného dělení, při kterém se tvoří
haploidních buňky s chromozomy ze dvou sesterských
chromatid
Profáze I
• párování homologních chromozomů, tvorba bivalentů (2 chromozomy), tetrád (4 chromatidy)
• mezi homologními chromozomy spojenými synapsí probíhá crossing-over (homologní rekombinace)
- vzájemné překřížení homologních chromozomů v tetrádách
- výměna částí chromozomů, zajišťuje genetickou rekombinaci u potomků
• kondenzace chromozomů, tvorba dělícího vřeténka, rozpad jaderné membrány
• skládá se z pěti fází
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-20/CB20.html
Kondenzace
duplikovaných
chromozomů
Jaderná membrána Rozpad jaderné
membrány
Tvorba bivalentu
Chiazma
Tvorba
synaptonemálního
komplexu
Zahájení synapse Dokončení synapse
crossing-over
Rozpad synapse
viditelná chiazmata
Zrekombinované
chromozomy
Gen X
Homologní chromozomy
(stejné geny, různé alely)
Sesterské chromatidy
(stejné geny, stejné alely)
Meióza I - redukční dělení
Metafáze I
• seřazení párů homologních chromozomů v ekvatoriální rovině
Anafáze I
• separace homologních chromozomů a jejich pohyb k pólům dělícího vřeténka
• sesterské chromatidy zůstávají spojeny v oblasti centromer
Telofáze I
• rozpad dělícího vřeténka, obnova jaderné membrány
• cytokineze dělí buňku na dvě
http://satameiosis.weebly.com/meiosis-slideshow.html
Centrozomy
Jaderná
membrána
Chromatin
Chiazmata
Vřeténko
TetrádaSesterské
chromatidy
Kinetochorové
mikrotubuly
Metafázní
destička
Centromera
s kinetochorem Separace homologních
chromozomů
Sesterské chromatidy
nedotčeny
Dělící rýha
Dvě haploidní buňky;
chromozomy stále zdvojeny
Rozchod homologních
chromozomů
Seřazení tetrád
v ekvatoriální rovině
Párování homologních chromozomů
Výměna segmentů
Replikace chromozomů
Interfáze Profáze I Metafáze I Anafáze I Telofáze I
Meióza II - separační dělení
• po meióze I v buňce přítomen jen jeden homolog z každého chromozomu
• při meióze II dochází k separaci sesterských chromatid, které obsahují
stejnou genetickou informaci, do vznikajících gamet
Profáze II rozpad jaderné membrány, tvorba dělícího vřeténka
Metafáze II seřazení chromozomů v ekvatoriální rovině
Anafáze II separace sesterských chromatid a jejich pohyb k opačným pólům vřeténka
Telofáze II rozpad dělícího vřeténka, obnova jaderné membrány, cytokineze
Gen X
Sesterské chromatidy
(stejné geny, stejné alely)
http://satameiosis.weebly.com/meiosis-slideshow.html
Telofáze I Profáze II Metafáze II Anafáze II Telofáze II
Dělící rýha
Dvě haploidní buňky;
chromozomy stále zdvojeny
Během meiózy II dochází ke konečné separaci sesterských chromatid.
Vznikají čtyři haploidní dceřiné buňky, které obsahují jednu kopii každého chromozomu.
Sesterské
chromatidy
Mitóza Meióza
Replikace DNA Během interfáze, před mitózou Během interfáze, před meiózou, pouze jednou
Počet dělení 1 2
Synapse homologních
chromozomů
Neprobíhá
Probíhá spolu s crossing-overem mezi
nesesterskými chromatidami během profáze I.
Počet dceřiných buněk
a jejich genetický obsah
Dvě diploidní (2n) dceřiné buňky,
genetický identické s rodiči.
Čtyři haploidní (n) dceřiné buňky, obsahují
polovinu počtu chromozomů rodičovské buňky,
genetický odlišné od rodičů i mezi sebou.
Úloha v lidském těle
Produkce buněk pro růst a opravy
organismu.
Produkce gamet které zajišťují genetickou
rozmanitost při sexuálním rozmnožovaní.
Meióza
• výsledkem meiózy jsou čtyři haploidní buňky s jednou kopií každého chromozomu
• crossing-overem vznikají různé kombinace alel různých genů v rámci chromozomu
• meióza je základem pro pohlavní rozmnožování, závisí na přítomnosti homologních chromozomů
• potomstvo vzniklé pohlavním rozmnožováním je geneticky odlišné od svých rodičů i sourozenců
• pohlavní rozmnožování je zdrojem genetické rozmanitosti,
která pochází z:
i) nezávislý výběr chromozomů: nezávislá orientace
chromozomových párových během meiózy I
ii) náhodné oplodnění: náhodné oplození vajíčka spermií
za vzniku zygoty
iii) crossing-over: nové kombinace alel v rámci chromozomu
http://www.zo.utexas.edu/faculty/sjasper/bio301l/division.html
Řízení buněčného cyklu
• rozhodnutím se, zda se budou dělit, reagují buňky na svoji velikost a extracelulární signály (přítomnost
živin, růstových faktorů, stresových faktorů, poškození DNA)
• kvasinky se rozhodují hlavně podle velikosti buňky a dostupnosti živin
• u savců převládá vliv růstových faktorů a mitogenů
Principy řízení buněčného cyklu
• mitóza neproběhne před koncem replikace DNA, replikace DNA neproběhne bez rozdělení buňky
• poškozená DNA se nesmí replikovat a předat do dceřiných buněk
• chybně spárované chromozomy nesmí dokončit mitózu
• deregulace buněčného cyklu může vést ke vniku nádorových onemocnění
http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/control/
i) posttranslační modifikace proteinů, které se účastní jednotlivých fází buněčného cyklu
- fosforylace: významná změna struktury a funkce proteinů, reverzibilní
proteinkinázy patří mezi hlavní regulátory buněčného cyklu
- proteolýza: nepotřebné proteiny označeny ubikvitinem a degradovány v proteazomu, ireverzibilní
ii) kontrolní body buněčného cyklu
Zdravá tkáň: řízený růst buněk
Nádor: nekontrolovaný růst buněk
Řízení buněčného cyklu - historie
Potu Rao, Robert Johnson (1970)
• analýza buněčného cyklu pomocí experimentů s fúzí buněk v různých fázích cyklu
• vznik buňky se dvěma jádry - heterokaryon
• buněčný cyklus řízen specifickými chemickými signály obsaženými v cytoplazmě
• řízení buněčného cyklu probíhá ve dvou místech - G1/S přechod, G2/M přechod
http://csls-text3.c.u-tokyo.ac.jp/active/13_01.html
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html; http://www.slideshare.net/ayesexy/cell-cycle-9451819
S G1 M G1 M MS S S G2 S G2
Cytoplazma buňky v S fázi obsahuje faktory, které
indukují syntézu DNA v jádře ve fázi G1
Existuje cytoplazmatický faktor, který indukuje M fázi,
a ke kterému je jádro citlivé po celý buněčný cyklus
Opětovná syntéza DNA v G2 jádře G2 nenastává.
Inhibice opakované replikace je odstraněna mitózou.
Yoshio Masui, Clement Markert (1971)
• identifikace faktoru MPF (mitosis-promoting factor), dimer složený z proteinkinázy (CDK) a cyklinu
• MPF je vysoce konzervativní, indukuje u všech eukaryotických buněk mitózu
• Xenopus laevis - oblíbený modelový organismus kvůli velkým oocytům
Odběr cytoplazmy
ze zralého oocytu
Injekce cytoplazmy
do nezralého oocytu
Meióza Zralý oocyt
Cyklin-dependentní-proteinkinázy (Cdk)
• klíčové enzymy regulující přechod mezi fázemi BC, přestup buněk z G0 do G1
• různé fáze BC spouští tím, že fosforylují specifické cílové proteiny
• jejich aktivita je přísně regulována
i) katalytická aktivita pouze v komplexu s cyklinem
ii) Tyr fosforylační místa - aktivační, inhibiční
- fosforylace specifickými kinázami, defosforylace fosfatázami
iii) inhibitory
• u kvasinek 1 enzym, u člověka 5 enzymů
G1 CDK4, CDK2, CDK6
S CDK2
G2 CDK2, CDK1
M CDK1
Faktory zajišťující řízení buněčného cyklu
Inhibitory CDK (CKI)
• negativní regulátory průchodu BC, dvě rodiny (INK, CIP)
• váží se na CDK a tlumí jejich aktivitu, zodpovědné za zástavu BC v G1
• např. p21 se aktivně syntetizuje při poškození DNA, váže se na CDK a přerušuje průběh BC
CDK
Cyklin
Aktivní CDK
Aktivační kináza
Inaktivační kináza
Aktivační
fosfatáza
http://slideplayer.com/slide/2304039/
Fáze BC Cyklin CDK Funkce
G1 D, E CDK4, CDK6, CDK2 Umožňují překonat bod restrikce v pozdní G1
S A, E CDK2 Umožňují zahájit replikaci DNA
G2 A CDK2, CDK1 Navádějí buňku k M fázi
M B CDK1 Podporují mitotické děje
Cykliny
• proteiny tvořící komplexy s Cdk, aktivují Cdk a určují jejich substrátovou specifitu
• regulují průchod jednotlivými fázemi BC
• jejich koncentrace kolísá během fází BC - specifická syntéza / ubikvitinace a proteolýza
Faktory zajišťující řízení buněčného cyklu
• u kvasinek 9 typů
• u člověka 4 rodiny, které jsou aktivní v různých fázích BC
Proteazom
Ubikvitin
CDK Cyklin
http://www.bioscirep.org/content/30/4/243 http://tbl.med.yale.edu/cell_growth_control_reading.php
https://www.boundless.com/biology/textbooks/boundless-biology-textbook/cell-reproduction-10/control-of-the-cell-cycle-89/regulator-molecules-of-the-cell-cycle
Řízení buněčného cyklu - raná G1
http://tbl.med.yale.edu/cell_growth_control_reading.php
• cyklin D - CDK4/6
• tři formy cyklinu D (D1, D2, D3) s tkáňově specifickou expresí, tvoří komplex s CDK4 nebo CDK6
• cyklin D působí jako senzor mitogenních signálů a připravuje buňku pro S-fázi
• aktivace transkripčních faktorů, které zajišťují expresi replikačních proteinů a cyklinu E
• defosforylace složek pre-iniciačních komplexů, sestavení nových komplexů v místech ori
• odpověď na mitogenní signály
př. EGF - EGFR - GEF faktor - Ras protein - dráha MAP kináz - transkripční faktory - exprese cyklinu D
• inhibice antimitogenními signály
př. TGFβ - TGFβR - transkripční faktor Smad3, Smad4 - exprese CDK inhibitoru
Mitogenní signalizace
Receptorová
tyrozinproteinkináza
GEF faktor
Cyklin D
Transkripce
Jun
Fosforylace
Antimitogenní signalizace
Fosforylace
Smad3
Receptorová serin/
threonin kináza
Transkripce
Cyklin D neaktivuje CDK4
• cyklin D - CDK4/6, cyklin E - CDK2
• dále připravují buňku pro S-fázi
• transkripce cyklinu E řízena sadou transkripčních faktorů E2F (aktivátory 1-3, inhibitory 4-5)
• Rb protein (pRb) aktivní v nefosforylované formě, inhibován fosforylací
• v G0 a G1 inhibuje pRB svojí vazbou aktivační E2F a aktivuje inhibiční E2F, potlačuje expresi cyklinu E
• po fosforylaci komplexem cyklin D - CDK4/6 se pRb uvolňuje a E2F spouští expresi cyklinu E, cyklinu
A a replikačních proteinů
• pozitivní zpětná vazba - cyklin E tvoří komplex s CDK2 a dokončuje fosforylaci pRb, v tuto chvíli je
průchod buněčným cyklem nezávislý na přítomnosti mitogenů
• po zahájení S fáze je cyklin E degradován a CDK2 tvoří komplex s cyklinem A
Řízení buněčného cyklu - přechod G1/S
http://tbl.med.yale.edu/cell_growth_control_reading.php
Transkripce cyklinu E
Funkce pRB v řízení BC
Pozitivní zpětná vazba
Řízení buněčného cyklu - S fáze
• cyklin A - CDK2
• fosforylace složek pre-iniciačního komplexu
- iniciaci replikace DNA (aktivace komplexu MCM)
- blok opakované replikace v rámci jednoho BC (uvolnění cdc6)
• výsledkem S fáze je vznik dvou sesterských chromatid každého
chromozomu spojených molekulami kohezinu
S G1 S S
S G2 S G2
Cytoplazma buňky v S fázi obsahuje aktivní komplexy cyklin E - CDK2
a cyklin A - CDK2, které zajistí fosforylaci pRB, expresi replikačních
proteinů a iniciaci replikace DNA. Již není třeba mitogenní signál.
V jádře G2 buňky neproběhne opakovaná S fáze v důsledku
absence pre-iniciačních komplexů.
http://tbl.med.yale.edu/cell_growth_control_reading.php http://genesdev.cshlp.org/content/22/22/3089/F2.expansion.html
kohezin
G1 S M - profáze M - metafáze
MPF (mitosis-promoting factor) = cyklin B - CDK1
• koncentrace cyklinu B roste průběžně během celé interfáze
• CDK1 - inhibiční fosforylace kinázou Wee1
odstraněna fosfatázou Cdc25
- aktivační fosforylace kinázou CAK
• nárůst aktivity MPF je skokový, při maximální hladině
cyklinu B a po odstranění inhibiční fosforylace
• pozitivní zpětná vazba - aktivovaný MPF aktivuje Cdc25
a inhibuje Wee1
MPF fosforyluje cílové proteiny zapojené v brzké fázi mitózy
• kondenzace chromatinu - aktivace kondenzinů
• rozpad jaderné membrány - depolymerace laminů,
fosforylace jadrných pórů a proteinů vnitřní membrány
• tvorba mitotického vřeténka - aktivace centrozomů a proteinů
asociujících s mikrotubuly
Kontrola velikosti buněk u kvasinek
• nízká aktivita Cdc25 a vysoká aktivita Wee1 - opožděná
mitóza, delší G2, zvětšení buněk
• vysoká aktivita Cdc25 a nízká aktivita Wee1 - urychlená
mitóza, kratší G2, zmenšení buněk
Řízení buněčného cyklu - přechod G2/M
Cyklin B
CDK1
CAK
Wee1 Aktivační
Inaktivační
Inaktivní
Cdc25
Aktivní
Cdc25
Aktivní
MPF
http://tbl.med.yale.edu/cell_growth_control_reading.php
http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_14thecellcycle.html http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html
Jaderné membrány
Jaderný pór
Jaderná lamina
MPF
Laminové
dimery
Řízení buněčného cyklu - M fáze
APC, anaphase-promoting complex
• ubikvitin ligáza připojující ubikvitin k proteinům, které řídící mitózu, a tím je předurčuje k degradaci
• aktivita během BC kolísá, aktivován v pozdní mitóze působením MPF
• funguje jen po připojení proteinu Cdc20, ten je blokován proteiny Mad a Bub, které ho uvolňují až
po správném připojení kinetochorů všech chromozomů k mikrotubulům vřeténka
• substrátem jsou např.
i) sekurin
• jeho rozklad uvolňuje separázu, která degraduje proteiny spojující sesterské chromatidy
ii) cyklin B
• náhlý pokles jeho hladiny inaktivuje MPF
• absence MPF umožňuje konstitutivně aktivním fosfatázám odstranit fosfátové skupiny z proteinů,
které byly fosforylovány MPF, zakončení mitózy, vstup do nové G1
Volný
chromozom
Chromozom
připojený
k vřeténku
Proteiny
Mad a Bub
Cdc20
APC
Komplex Mad/Bub
inhibuje Cdc20
Inaktivní
APC Aktivní APC
MPF
Cdc20
Sekunrin
Inaktivní
separáza
Aktivní
separáza
Mitotické
vřeténko
Kohezin
Rozštěpený
kohezin
Ubikvitinace a degradace
sekurinu
G2 Metafáze Anafáze
APC
Degradace cyklinu B
Vzrůstající koncentrace cyklinu B
G2/M přechod
https://www.studyblue.com/notes/note/n/adv-cell-bio-chapter-17-exam-iii/deck/8669501 http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html
Inhibitory CDK (CKI)
Rodina INK4 (INhibitors of Kinase 4)
• p16INK4A, p15INK4B, p18INK4C, p19INK4D
• inhibují sestavování komplexů a kinázovou aktivitu
cyklin D - CDK4/6, zástava v G1
• exprese p16 stimulována inhibitory růstu (např. TGFβ)
a proteiny E2F (negativní zpětná vazba)
Rodina CIP (CDK Inhibitory Proteins)
• p21Cip1 (cílový gen proteinu p53), p27Kip1, p57Kip2
• váží a inhibují cyklin D - CDK4/6, cyklin E - CDK2,
cyklin A - CDK2, cyklin B - CDK1
Farmakologické inhibitory CDK
• CDK řídí buněčný cyklus, expresi genů, diferenciaci, apoptózu, procesy v nervovém systému
• deregulace CDK u různých chorob, farmakologické inhibitory blokující ATP vazebné místo CDK
• zkoumán selektivní účinek těchto inhibitorů a jejich možné využití pro léčebné účely
- nádory, neurodegenerativní choroby (Alzheimerova choroba, ALS, mrtvice)
- kardiovaskulární choroby (ateroskleróza, hypertrofie srdce)
- virové infekce (HCMV, HIV, HSV, HPV)
- parazitická protozoa (malárie, spavá nemoc)
aktivní p16
cyklin D
CDK4
inaktivní
komplex
cyklin D
CDK4
aktivní
komplex
p16 chybí
aktivní Rb
inaktivní Rb
aktivní E2F
exprese genů
S fáze
NEPROLIFERUJÍCÍ
BUŇKA
PROLIFERUJÍCÍ
BUŇKA
Kontrolní body buněčného cyklu
• vnímají vnější i vnitřní podněty a zajišťují správný chod BC
• kontrola dokončení předchozí fáze a splnění podmínek pro fázi
následující
Kontrolní bod G1 - bod restrikce
• vliv vnějších faktorů - přítomnost živin, mitogenů, antiproliferačních faktorů
• po překonání bodu restrikce mohou BC zastavit už jen vnitřní faktory
• celistvost DNA
• velikost buňky (kvasinky)
Kontrolní bod G2
• dokončení replikace DNA
• celistvost DNA
• velikost buňky (kvasinky)
Kontrolní bod M
• přechod metafáze-anafáze
• správné připojení chromozomů k mitotickému vřeténku
https://sharonap-cellrepro-p2.wikispaces.com/The+Cell+Cycle
https://adapaproject.org/bbk_temp/tiki-index.php?page=Leaf%3A+What+happens+at+each+of+the+cell+cycle+checkpoints%3F
Kontrolní body buněčného cyklu
Vnější podněty - chemické
• živočišné buňky potřebují kromě esenciálních živin mimobuněčné signály pro růst, dělení a přežití
• signální molekuly produkované jinými buňkami téhož organismu:
i) mitogeny - stimulují dělení buněk, překonávají přirozené brzdící mechanismy G1/S (např. pRb)
ii) růstové faktory - stimulují navýšení hmoty a růst buněk, indukují syntézu makromolekul
- např. PDGF: tvorba v krevních destičkách, podpora hojení ran
iii) faktory pro přežívání - potlačují programovanou buněčnou smrt
Vnější podněty - fyzikální
• pro růst a proliferaci vyžaduje buňka prostor a povrch pro adherenci
Účinky PDGF
na fibroblasty
pojivové tkáně
Fragmentace
pojivové
tkáně
Degradace ECM
Zisk fibroblastů
Umístění buněk
do kultivačních
nádob
Bez PDGF Přídavek PDGF
Normální buňka Nádorová buňka
Závislost na povrchu pro adherenci
Inhibice růstu nedostatkem prostoru
http://www.slideshare.net/msarwa/the-cell-cycle-15819946 https://www.studyblue.com/notes/note/n/ch-12-mitosis-lecture/deck/6936213
Kontrolní body buněčného cyklu
Vnitřní podněty
• celistvost DNA, připojení chromozomů k dělícímu vřeténku
Poškození DNA
• vlivem fyzikálních a chemických mutagenů
• opravitelné poškození - zastavení BC do doby opravení DNA
• rozsáhlé poškození - programovaná buněčná smrt
• zástava v BC v G1 (inaktivace CDK2) nebo G2 (inaktivace CDK1)
• klíčová úloha nádorových supresorů
ATM, ATR - rozpoznání poškozené DNA (UV fotoprodukty, dsDNA zlomy), aktivace CHK1, CHK2
CHK1, CHK2 - aktivace p53, inhibice Cdc25
p53 - zvýšení hladin CKI
http://www.nature.com/nrm/journal/v8/n8/fig_tab/nrm2227_F4.html http://www.nature.com/nrg/journal/v2/n3/fig_tab/nrg0301_196a_F2.html
Inaktivní InaktivníAktivní
ds zlomUV poškození
apoptźa
ds zlom
Kontrolní body buněčného cyklu
p53
• významný regulátor BC, působí jako nádorový supresor
• za normálních podmínek nízká hladina, průběžná degradace
- Mdm2 zajišťuje transport p53 z jádra k proteazomu
- zpětná vazba: p53 spouští expresi Mdm2
• stabilizován ve stresových situacích, především při poškození DNA
• působí jako transkripční faktor, indukuje
- zastavení BC: exprese p21/CIP
- zastavení replikace DNA: inaktivace DNA polymerázy δ
- zastavení mitózy: inaktivuje cdc25
- apoptózu: exprese Bax, Puma
http://www.medicalrealm.net/what-is-genetic-disorder---li-fraumeni-syndrome.html http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html
Deficit p53
• průchod BC s poškozenou DNA - hromadění mutací - riziko vzniku
nádoru (mutace v genu p53 u většiny nádorových onemocnění)
• Li-Fraumeniho syndrom
- dědičný syndrom způsobený inaktivační mutací p53
- zvýšené riziko vzniku nádoru (sarkomy, nádory mozku, prsu,
nadledvinek, leukemie)
- 50 % riziko nádoru do 40 let věku, 90% do 60 let věku
CHK1, CHK2
Poškozená DNA
Aktivace
Aktivace
Degradace
Inhibice
CKI
Cyklin - CDK
Nedochází k fosforylaci
pRb
Nedochází k inhibici
apoptózy
Inhibice
ZASTAVENÍ
BC
APOPTÓZA
Kontrolní body buněčného cyklu
Kontrolní bod dělícího vřeténka
• pro vstup do anafáze musí buňka získat potvrzení o připojení všech chromozomů na kinetochorové
mikrotubuly dělícího vřeténka
• poškození tohoto kontrolního mechanismu vede k poškození a nondisjunkci chromozomů
i) kontrolní bod zapnut
• nepřipojené kinetochory aktivují proteiny Mad
a Bub
• komplex APC-Cdc20 v inaktivním stavu
ii) kontrolní bod vypnut
• vazba sesterských chromatid chromozomů na
kinetochorové mikrotubuly z opačných pólů
dělícího vřeténka vyvolává v chromozomech
mechanické napětí
• netvoří se komplex proteinů Mad a Bub
• komplex APC-Cdc20 je aktivní a zajišťuje
degradaci sekurinu
http://www.nature.com/onc/journal/v23/n11/fig_tab/1207374f1.html
Faktory ovlivňující průchod BC
http://www.nature.com/nrc/journal/v11/n1/full/nrc2982.html
• přítomnost mitogenů - exprese cyklinu D
• přítomnost antimitogeních, diferenciačních faktorů - exprese CKI
• stárnutí buňky - exprese CKI
• poškození DNA - zástava BC přes p53
• virové infekce (např. HPV, lidský papilomavirus) - inhibice p53 a pRb, proliferace buňky
Poškození DNA
Senescence
Diferenciace Mitogeny
Poruchy řízení buněčného cyklu
Nádorová onemocnění
• nádorové buňky nepotřebují k dělení růstové faktory
- samy si mohou tvořit růstové faktory
- mohou signalizovat i bez přítomnosti růstového faktoru
- mohou mít narušené kontrolní body BC
• zvýšená proliferace buňky podpoří její transformaci do
buňky nádorové
• nádor je v podstatě selhání kontroly buněčného dělení,
nekontrolovatelný růst buněk
• protoonkogeny
- normálně aktivují proliferaci buněk
- při abnormální aktivaci či ztrátě jejich inhibice podporují
vznik nádoru
- př. růstové faktory, cykliny, CDK, E2F, Mdm2, Ras, Myc
• nádorové supresory
- normálně potlačují dělení buněk
- inaktivace či zvýšená inhibice podporuje vznik nádoru
- př. pRb, p53, p21, p14, p16, TGF-β, ATM
https://www.quora.com/How-does-the-cell-cycle-play-a-role-in-cancer
Protoonkogen
Mutovaný protoonkogen
- onkogen
Normální růst buněk
Ztráta kontroly růstu
Normální růst buněk
Normální růst buněk Ztráta kontroly růstu
Normální růst buněk
Mutovaný
nádorový supresor
Mutované
obě alely genu
Poruchy řízení buněčného cyklu
Početní změny chromozomů (aneuploidie)
• normální karyotyp 46, XX(Y) monozomie - např. 45, X trizomie - např. 47, XY +21
• chyby v kontrolním bodu dělícího vřeténka, výsledek nondisjunkce a opoždění chromozomů
i) chyby v mitóze
• opoždění chromozomu v anafázi a jeho nezačlenění do dceřiného jádra
• vnik mozaicismu, v jednom organismu se vyskytují linie buněk s různým karyotypem
ii) chyby v meióze
• nondisjunkce - vznik nulizomické / trizomické gamety, monozomie/trizomie po oplození
- v MI: chyba v rozdělení homologních chromozomů
- v MII: chyba v rozdělení chromatid
• opoždění chromozomu v anafázi: vnik nulizomické gamety
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html http://www.nature.com/onc/journal/v32/n39/fig_tab/onc2012615f2.html
Opoždění chromozomu v anafázi BC
Nondisjunkce chromozomů v meióze
n+1 n+1 n-1 n-1 n+1 n-1 n n
G2/M
přechod
Bod restrikce
Přechod
metafáze -
anafáze
Odbouraný
mitotický cyklin
Odbouraný
G1 cyklin
APC
Aktivní mitotický
komplex cyklin-CDK
Aktivní G1 komplex
cyklin-CDK
Cyklin E/A - CDK2Cyklin A - CDK2
Cyklin A/B - CDK1
Vstup do S fáze
Cyklin D - CDK4/6
ATM/R
p53
p21
Poškozená DNA
Poškozená DNA
ATM/R
p53
p21 Cdc25A
p21
Poškozená DNA
Vstup do M fáze
ATM/R
p53
p21 Cdc25C
CHK1
ATR
Poškozená
DNA
Nezreplikovaná
DNA
Mad2
Kontrola připojení chromozomů
k dělícímu vřeténku
Mitogeny
p53
p21 Cdc25A
p21ATM/R
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html
Zvídavé otázky
Kolik buněk vzniká z jedné buňky, která podstoupí meiózu?
Do jakých dvou hlavních fází se rozděluje buněčný cyklus?
Jaké buňky se množí pomocí mitózy?
Jaký typ mikrotubulů je zodpovědný za vazbu chromozomů během M fáze BC?
Jak se nazývá fáze buněčného cyklu, při které se buňka fyzicky rozdělí na dvě?
Jaká struktura zastává při mitóze funkci obdobnou chiasmatům při meióze?
Vstup do jaké fáze buněčného cyklu signalizuje aktivní komplex MPF?
Ke vstupu do jaké fáze buněčného cyklu vede degradace G1 fázových cyklinů?
Rozpad jaderné membrány odpovídá začátku prometafáze (ANO/NE)
Při mitóze jsou jádra dceřiných buněk geneticky shodné s jádrem mateřské buňky (ANO/NE)
Během mitotické profáze obsahuje každý chromozom dvě chromatidy (ANO/NE)
Homologní chromozomy se párují během mitotické profáze (ANO/NE)
Začátek anafáze je inhibován až do seřazení všech chromozomů v ekvatoriální rovině (ANO/NE)
Buňky v G0 fázi buněčného cyklu obsahují stejné množství DNA jako ve fázi G2 (ANO/NE)
Zvídavé otázky
Co je cílem ubikvitnace komplexem APC na začátku anafáze?
a) sekurin
b) separáza
c) kohezin
d) tubulin
Jaké z následujících tvrzení porovnávajících mitózu a meiózu není pravdivé?
a) oba procesy využívají dělící vřeténko z mikrotubulů
b) po obou procesech následuje cytokineze
c) oba procesy jsou pečlivě regulovány
d) v obou procesech probíhá během profáze crossing-over
e) oba procesy zahrnují redukci obsahu DNA v dceřiných buňkách
Jaké z následujících tvrzení o anafázi buněčného cyklu není pravdivé?
a) zmenšuje se vzdálenost mezi kinetochory a póly dělícího vřeténka
b) zvětšuje se vzdálenost mezi dvěma sadami dceřiných chromatid
c) rozpadají se mikrotubuly dělícího vřeténka
d) zvětšuje se vzdálenost mezi oběma póly dělícího vřeténky
e) dochází k cyklin-dependentní aktivaci CDK1