Molekulární biologie 10. Programovaná buněčná smrt a molekulární podstata získané imunity Osnova 1. Apoptoza 2. Vývoj a aktivace T-buněk a B-lymfocytů 3. Imunoglobuliny, exprese BCR a TCR Hlavní zdroje: S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie 1-4 Masarykova Universita Brno ISBN 80-902562 M. Muller, Biology of Cells and Organisms University of Illinios, Chicago http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/summer2010/lecturesm10.htm Wikipedia Apoptóza programovaná buněčná smrt Apoptóza programovaná buněčná smrt - intenzivně zkoumána od 1990s - poruchy apoptozy hrají roli v různých nemocech Počet článku zkoumajících apoptozu (pubmed) Excesivní apoptóza např. dystrofie Omezená apoptóza např. rakovina Dystrofie - degenerace tkáně z důvodu nemoci nebo špatné výživy Apoptóza - programovaná buněčná smrt - nezbytná pro vývoj a homeostázi organismu - pouze u mnohobuněčných organismů - přísně regulovaný proces (na rozdíl od nekrózy) - buněčný stres stimuluje pro-apoptotické signální dráhy - tyto dráhy aktivují proteázy zvané "kaspázy" - kaspázy způsobují mitochondriální dysfunkci - apoptotická buňka vykazuje charakteristické změny morfologie Homeostaza - stálost vnitřního prostředí Buněčný stres pro-apoptotické signální dráhy Kaspázy mitochondriální dysfunkce APOPTOZA Charakteristické morfologické znaky apoptozy 1. Blebbing - nepravidelné záhyby cytoplazmatické membrány - smršťování buňky (shrinkage) - vznikají odpojení cytoskeletu od membrány - degradace vnitřní struktury buňky - vznik apoptotických tělísek 2. Fragmentace jádra - Kaspáza 3 aktivuje endogenní endonukleázu - enzym CAD (Caspase-Activated DNase) - štěpí chromatinovou DNA na fragmenty o délce cca 180bp - na elektroforetickém gelu lze pozorovat 180bp fragmenty DNA a jejich násobky (360, 540...) - 180bp je zhruba délka rozestupu histonů na DNA místa štěpení CAD endonukleázou CAD Pyknóza - ireverzibilní kondenzace chromatinu Kdy probíhá apoptóza Příklady: - zánik nadbytečných buněk v prenatálním období (u embrya, u plodu) - orgány se zakládají jako shluky buněk - duté orgány vznikají tak, že vnitřní buňky zaniknou apoptózou (A) - diferenciace lidských prstů (B) - zánik buněk ve tkáních - např. zánik červených krvinek po přibližně 80 dnech - poškození DNA, které již neumí buňka opravit (D) researchgate.net Apoptóza vs. Nekróza https://www.pinterest.com/spanglyal/cancer-cell-mapping/ Apoptóza může být indukována dvěma drahami 1. Vnitřní dráha (intrinsic pathway; mitochondriální) - z důvodu buněčného stresu nebo DNA damage - uvolnění proteinů (hl. Cytochrom C) z prostoru na membráně mitochondrií 2. Vnější dráha (extrinsic pathway) - z důvodu vnější signalizace od ostatních buněk - extracelulární ligandy (hl. TNF-α a Fas) se váží na tzv. death-receptory na povrchu buněk - TNF-α produkují aktivované makrofágy - Fas ligand produkují TC lymfocyty 1. Barvení buněk trypanovou modří - počítání ve světelném mikroskopu 2. Flow cytometrie 3. Western blotting Metody detekce apoptózy např. při testování léčiv in vitro 2. Flow cytometrie Technika pro analýzu velkého množství buněk. Na buňkách je možné rozlišit - velikost (forward scatter) - tvar (granularitu; side scatter) - expresi povrchových proteinů (protilátka proti povrchovým antigenům konjugovaná fluorochromem) - expresi intracelulárních proteinů (buňky nutno usmrtit a permeabilizovat membránu) Forward scatter Sidescatter 2. Flow cytometrie Detekce buněčné smrti pomocí propidium jodidu (PI) - PI- fluorescenční barvička, vážící se na DNA - podobně jako Trypanová modř proniká a barví pouze mrtvé buňky Histogram barvení propidium jodidem Apoptosis / Necrosis Annexin V (FITC) Propidiumiodide(PerCP-Cy5) Viable cells Early apoptotic cells Late apoptotoic or necrotic cells Annexin V FITC staining fosfolipid fosfatidylserin 2. Flow cytometrie osa x: intenzita fluorescenčního signálu v kanálu FITC (buňky pozitivní na Annexin) osa y: intenzita fluorescenčního signálu v kanálu PerCP-Cy5 (buňky pozitivní na Propidium jodid) Annexin+... časná apoptoza PI+... pozdní apoptoza 3. Western blotting - izolace celkového proteinu z buněk a rozdělení proteinů na polyakrylamidové gelu podle své velikosti. - inkubace s protilátkou umožní, zda je daný protein ve vzorku přítomen a v jakém množství (oproti jinému vzorku na téže membráně - semikvantitativní metoda) - příklady markerů apoptózy: - proapoptotický protein z rodiny Bcl-2: BIM - štěpený protein PARP Imunitní systém Imunitní systém Existuje fyzická, chemická a buněčná obrana proti invazi bakterií a virů 1. linie obrany - fyzická a chemická a) kůže: vrstva mrtvých buněk - suchá a s nízkým pH b) sliznice: pokryty lysozymem - chemický rozklad bakterií c) cilie (řasinky): výběžky buněk, působí jako filtr a aktivně odstraňují patogeny Imunitní systém 2. linie obrany - nespecifická imunitní odpověď - obecná odpověď na infekci patogenem - je vyvolán zánět Granulocyty a) Neutrofil - fagocytuje bakterie a sekretuje lysozym který degraduje bakteriální stěny b) Eosinofil - vylučuje enzymy, které zabíjí parazitické červy c) Bazofil - vylučuje histamin pro podporu zánětu d) Mastocyt (mast cell; žírná buňka) - vylučuje signály pro snížení průtoku krve v místě poranění - signály pro zvýšení průtoku krve a propustnosti kapilár v okolí poranění, aby se fagocyty dostaly do místa poranění e) Makrofágy - fagocyty (big eaters) - fagocytují vše - obsahují MHC (major histocompatibility complex) , který vystavuje antigen - sekrece cytokinů, které přitahují další makrofágy a neutrofily - zvyšují teplotu Antigen: částice rozeznávaná protilátkou, v imunologii se jedná o cizí patogen Protilátka: částice, která specificky rozeznává antigen a je rozeznávána lymfocyty wikipedia Hematopoéza (krvetvorba) MHC-molekuly (proteiny) - Major histocompatibility complex (hlavní histokompatibilní komplex) - u lidí zvaný též HLA-komplex (human leukocyte antigen) - soubor povrchových proteinů - posttranslačně glykozylované proteiny Syntéza MHC - během syntézy zachycují peptidy a fragmenty vzniklé odbouráváním cizorodých proteinů (antigenů) a zanořují je do povrchu buňky - buňka se stává APC (buňkou nabízející antigen) - antigen je rozeznáván TCR-receptorem T-lymfocytů Typy MHC 1. MHC I (první třídy) - vážou peptidy vznikající odbouráváním virových a bakteriálních peptidů - tyto peptidy byly získány po zničení již infikované tělní buňky - jsou rozeznávány TC -lymfocyty, které se aktivují k usmrcení podobně infikovaných buněk 2. MHC II (druhé třídy) - vážou peptidové fragmenty z patogenů přímo fagocytovaných APC buňkou - tyto peptidy se odbouraly v intracelulárních vezikulách makrofágů, nebo byly zachyceny receptory B- lymfocytů - jsou rozeznávány pouze TH-lymfocyty Zánět - patogeny vstupují do místa poranění - krevní destičky vylučují srážlivé faktory - makrofágy a buňky poraněné tkáně vylučují cytokiny, které přivolávají pomoc - změny ve stěnách kapilár umožňují průchod bílých krvinek a tkáňového moku - mastocyty indukují vazokonstrikci poraněných cév a vazodilataci okolních cév - stimulace kostní dřeně k produkci dalších neutrofilů a makrofágů - přilákání dalších imunitních buněk do místa poranění - zvýšení teploty Tkáňový mok (interstitial fluid): mezibuněčná tekutina v těle mnohobuněčných živočichů. Hlavní složka mimobuněčné tekutiny, do níž se také řadí krevní plazma a míza (lymfa), která se z moku tvoří. Video: Zánět Imunitní systém 3. linie obrany - specifická imunitní odpověď - v případě, že první dvě linie obrany nestačí a infekce se šíří Makrofágy fagocytují patogen a vystavují na povrchu jejich antigeny (Antigen Presenting) T-lymfocyty jsou tímto informovány o typu patogenu Helper T lymfocyty indukují množství efektorových a paměťových buněk Cytotoxické T lymfocyty eliminují infikované a nádorové buňky B lymfocyty a plasmatické buňky produkují protilátky (sekretují do krve nebo umísťují na buňky) Aktivace T a B lymfocytů Při styku s antigenem se lymfocyt zmnožuje a vzniká množství klonů se stejným antigenním receptorem - nazýváme klonální selekce - základní koncept imunologie Klonální selekcí lymfocytů vznikají dva typy buněk: a) efektorové: krátká životnost, najdou a zničí patogen - z B buněk → plazmatické - sekretují protilátky - z T buněk → - cytotoxické T lymfocyty - helper T lymfocyty b) paměťové: vznikají při primární infekci, nejsou aktivní, ale přetrvávají v těle a při další infekci stejným patogenem jsou rychle reaktivovány k mitóze (imunologická paměť) Imunitní systém 3. linie obrany - specifická imunitní odpověď - každý virus a bakterie má unikátní molekulární markery, které jej identifikují - lymfocyty v těle rozeznávají: - vlastní antigeny - ty je nechávají klidnými - cizí antigeny - spouští mitotickou aktivitu (dělení) Fáze: 1. Rozeznání specifické cizí částice 2. Opakované buněčné dělení a vytvoření obrovské populace klonů lymfocytů 3. Diferenciace do subpopulací efektorových a paměťových buněk Imunitní systém 3. linie obrany - specifická imunitní odpověď Antigen-prezentující buňka - vystavují na svém povrchu antigeny - např. makrofág pohltí bakterii a na svém povrchu vystaví její antigeny - makrofág, dendritická buňka, B lymfocyt - tyto antigeny jsou ve vazbě s MHC - antigeny jsou rozeznávány lymfocyty T-lymfocyty (Thymocytes) - líhnou se v kostní dřeni - putují nezralé do brzlíky (thymus) kde diferencují a zrají - v procesu zrání získávají markery CD4 (T-helper cells TH) a CD8 (Cytotoxic T-cell TC) a antigenně specifické receptory - do krevního oběhu jsou uvolněny jako "virgin" T cells - T lymfocyty ignorují buňky s prázdnými MHC antigeny, stejně jako volně plovoucí antigeny - váží se však na antigeny, vystavené na povrchu makrofágů v MHC komplexu - vazba indukuje rapidní proliferaci do efektorových a paměťových buněk s receptorem pro daný antigen T-lymfocyty (Thymocytes) 1. Efektorové T-helper lymfocyty (CD4) - sekretují interleukiny → stimulace dalších T a B buněk - na povrchu mají protein CD4, který se váže na MHC II molekuly -TH-lymfocyty dělíme na a) TH1 - aktivující makrofágy b) TH2 - aktivující B-lymfocyty 2. Efektorové cytotoxické T lymfocyty (CD8) - rozpoznávají infikované buňky a ničí je pomocí Fas ligandu, perforinů+granzymů → APOPTÓZA - na povrchu mají protein CD8, který se váže na MHC I molekuly B-lymfocyty - prekurzory se tvoří v kostní dřeni u dospělých a játrech fétu - po dozrání syntetizují jeden typ protilátky - "virgin" B cell produkuje protilátku (imunoglobulin), která se uchytí v membráně - aby se B-lymfocyt začal dělit potřebuje: - kontakt se specifickým antigenem - aktivaci od T-helper lymfocytu, který už se s daným antigenem setkal na APC buňce (např. makrofágu) - Po aktivaci diferencuje B-lymfocyt do efektorové buňky (= plazmatická buňka) a paměťového B- lymfocytu - Plazmatická buňka produkuje masivní množství volných protilátek - volné protilátky označují patogen pro zničení fagocyty a komplementem - paměťová buňky zůstávají inaktivní během první infekce, ale při druhé infekci se aktivují mnohem rychleji než "virgin" B-lymfocyty - nejmenší část antigenu schopná reakce s protilátkou nebo receptorem T-lymfocytu se nazývá antigenní detrminanta neboli epitop Komplement Imunitní mechanismus zvyšující (doplňující, komplementující) účinnost protilátek - nespecifický a neadaptibilní - soubor malých proteinů, tvořených v játrech a cirkulujících v krvi - po aktivaci atakuje membrány patogenů, ve kterých způsobuje póry wikipedia Vlastnosti B-lymfocytů 1. Mají v povrchu receptor zachycující volný antigen. Molekula protilátky (imunoglobulin) vázaná na membránu 2. B-lymfocyt se aktivuje k dělení a diferenciaci na plazmatickou buňku teprve po kontaktu s antigenem. Do té doby je v klidu v G0 fázi. 3. Po vazbě antigenu se tento sdružuje s MHC II a je nabízen TH-lymfocytům. Antigen-presenting cells (APC; buňky nabízející antigen) na povrchu vystavují antigen, který je rozeznáván T-lymfocyty Existují 3+1 typy APC buněk: 1. B-lymfocyty - volný antigen se váže na receptor B-lymfocytu - endocytozou se antigen dostává do vezikuly, kde se rozkládá na peptidy - na ribozomech se syntetizují MHC II-molekuly, které migrují do vezikuly a spojí se s peptidy - komplex MHC II+peptid putuje k povrchu buňky, kde se vystavuje TH-lymfocytům - B-lymfocyty s antigeny se vyskytují v lymfoidních folikulách lymfatických uzlin 2. Makrofágy - pohlcují bakterie a odbourávají jejich proteiny a vystavují v komplexu s MHC II - vrozená (nespecifická) imunita - na povrchu receptory pro různé složky mikrobiálních buněk - rozptýleny po celém těle - lymfatické uzliny, plíce, játra, mozek... - mohou být i pohyblivé a přecházet mezi tkáněmi (amébovitý pohyb) - po vazbě TH-lymfocyt navíc produkuje interferon gamma (INF-γ) a tím se ještě víc aktivuje k pohlcování virů a bakterií - makrofágy též produkují cytotoxické proteiny 3. Dentritické buňky - komplexy antigenů a MHC I i MHC II - aktivují tedy jak TH- tak i TC-lymfocyty Podle místa výskytu dělíme: a) Langerhansovy buňky - v pokožce a mukózních tkáních - přijmou antigen a putují do lymfatických uzlin, kde diferencují na dendritické buňky a stimulují T-lymfocyty b) Intersticiální dendritické buňky - osidlují většinu orgánů (srdce, játra, ledviny...) c) Proplétající se dendritické buňky - v sekundárních lymfoidních orgánech spolu s T-lymfocyty d) Cirkulující dendritické buňky - v krvi (0,1% krevních leukocytů) wikipedia (4). Buňky infikované viry - virus napadne tělní buňku a spustí svou replikaci a transkripci svých proteinů - virové proteiny mohou být buňkou odbourány a vystaveny na povrchu v komplexu s MHC I - MHC I + virový antigen je rozeznáván TC-lymfocyty a infikovaná buňka je zničena apoptozou b) Humorální imunita zprostředkovaná specifickými protilátkami produkovanými B-lymfocyty do tělních tekutin a) Buněčná imunita zprostředkovaná T-lymfocyty - TC lymfocyty produkují Fas ligand a perforiny + granzymy → APOPTOZA Apoptóza! Imunoglobuliny (lidské protilátky) - vyskytují se vázané na povrchu B-lymfocytů nebo volné - volné protilátky označují patogen pro zničení fagocyty a komplementem - obecná struktura protilátek je velmi podobná - největší rozdíly jsou na špičce Fab regionu (antigen-binding site), která je extrémně variabilní - to umožňuje existenci milionů jemně odlišných verzí protilátek - klasifikace protilátek je založena na typu Fc fragmentu (těžkého řetězce) Imunoglobulinové třídy: 1. IgA (2 typy) - hlavně na sliznicích (trávící, dýchací..) a ve slinách, mléku... - zabraňuje kolonizaci patogeny - vysoká denní produkce 2. IgD (1 typ) - antigenní receptor na B-lymfocytech - BCR (spolu s IgM) - aktivuje bazofily a mastocyty k produkci antimikrobiálních faktorů 3. IgE (1 typ) - váže se na alergeny - aktivuje bazofily a mastocyty k produkci histaminu - chrání před parazitickými červy 4. IgG (4 typy) - v krevním séru tvoří až 80% všech imunoglobulinů 5. IgM (1 typ) - vázán na membránu B-lymfocytů, kde působí jako receptor pro antigen - BCR - nejúčinnější ve vazbě virových částic Imunoglobuliny (produkovány B-lymfocyty) Protilátky patří do skupiny glykoproteinů, označovaných jako imunoglobuliny Molekula imunoglobulinu je složena min. ze 4 polypeptidových řetězců - 2x těžký (H) řetězec (cca 430 aminokyselin) - 2x lehký (L) řetězec (cca 214 aminokyselin) Fc region Fab region Imunoglobuliny Konstantní oblast (C) - relativně neměnná sekvence aminokyselin - CH pro těžký a CL pro lehký řetězec Variabilní oblast (V) - úsek, v němž se imunoglobuliny příslušného typu liší - VH pro těžký a VL pro lehký řetězec Hypervariabilní oblasti - váží antigen - značně proměnlivá primární struktura Pantová (hinge) oblast - ohebnost usnadňuje vazbu na antigen Glykozylace - připojení sacharidů N-glykozidovou vazbou - na různých místech těžkého řetězce - slouží k ochraně před proteolýzou Domény - lehký řetězec má 2 domény (C a V) - těžký řetězec má jednu V a tři nebo čtyři C domény Klasifikace lehkých a těžkých řetězců Lehké řetězce - 2 typy: κ (kappa) a λ (lambda) Těžké řetězce - 5 typů: γ (gamma), α (alfa), μ (mí), δ (delta), ε (epsilon) - gamma má 4 podtypy a alfa má 2 podtypy Klasifikace protilátek je založena na typu Fc fragmentu (těžkého řetězce) VLCLVHCH indexy lze specifikovat, např. pro IgD: VκCκVδ Cδ Cδ Vδ Cκ Vκ IgD Imunoglobulinové domény - skládají se z antiparalelních β-skládaných listů spojených smyčkou - struktura domény stabilizována vodíkovými vazbami (mezi -NH a -CO) - každá doména je navíc stabilizována disulfidovou vazbou - antigen se váže na aminokyselinové zbytky (antigen binding site) v hypervariabilních úsecích - při vazbě antigenu dochází ke změně konformace domény www.thermofisher.com Molekulární podstata tvorby protilátek dědí se pouze subgeny (genové segmenty) pro tvorbu imunoglobulinů VDJ rekombinace (překupování genových segmentů) - proces při kterém T a B lymfocyty náhodně sestavují různé genové segmenty - k VDJ rekombinaci dochází na DNA buněk v průběhu jejich vývoje, před kontaktem s antigenem - genové segmenty: (V) ... variable (D) ... diversity (J) ... joining Cíl: vytvářet jedinečné antigenní receptory, které společně dokáží rozeznat mnoho druhů antigenních molekul U B-lymfocytů vznikají VDJ rekombinací imunoglobuliny (membránová - BCR - nebo volná forma) U T-lymfocytů vznikají VDJ rekombinací T-cell receptory (TCR) VDJ rekombinace 3 typy genů: 1. pro těžký řetězec: 14. chromosom 2. pro lehký řetězec kappa (κ): 2. chromosom 3. pro lehký řetězec lambda (λ): 22. chromosom - kombinací vzniklých VDJ přesmykem může být u člověka až 1013 - u genů pro lehké řetězce kappa a lambda chybí D segment VDJ rekombinace u těžkého řetězce (2012.igem.org) www.bsse.ethz.ch VDJ rekombinace Mechanismus VDJ rekombinace probíhá pouze na DNA nezralých lymfocytů RSS (recombination signal sequence) - označuje místo sestřihu (vazba RAG) RAG1/RAG2 (recombination-activating genes) - enzymy katalyzující rekombinaci - vazba na RSS Video: VDJ rekombinace VDJ rekombinace ve vývoji B-lymfocytu - subgeny VH, D a JH se přeskupují s Cμ - v kombinaci s lehkým řetězcem (κ nebo λ) vzniká povrchový IgM - stejným způsobem pak vzniká IgD (s Cδ) - oba reagují na stejný (hypotetický) antigen - obrovské kvanta typů protilátek se tvoří před kontaktem s antigeny - IgM a IgD se tvoří jako první, protože Cμ a Cδ následují na DNA hned za VDJ subgeny Přesmyk imunoglobulinových tříd - po přeskupení subgenů může následovat přesmyk tříd z IgM do IgG, IgE nebo IgA - až po stimulaci antigenem v sekundárních lymfoidních orgánech za podpory TH lymfocytů Přesmyk imunoglobulinových tříd - stejný úsek VDJH se připojí k subgenu Cγ, Cα nebo Cε za delece Cμ a Cδ - přesmyk tříd je řízen "signály přesmyku - S", regulační oblasti na koncích C-subgenů s výjimkou Cδ - na S místa na DNA se váží enzymy katalyzující přesmyk https://dokuwiki.noctrl.edu Receptory T lymfocytů (TCR) - u člověka má 95% T lymfocytů TCR receptor složený z α (alfa) a β (beta) řetězce (cca 5% TCR je z řetězců gama a delta - γ/δ) - V, D a J segmenty v β řetězcích - V a J segmenty v α řetězcích - přeskupování probíhá stejně jako u imunoglobulinů - vznik jedinečných receptorů archive.cnx.org Souhrn imunitní reakce - Plazmatické buňky produkují téměř neomezené množství typů protilátek - Každá protilátka je specifická pro svůj antigen - imunitní odpověď se zintenzivňuje v průběhu infekce - imunitní odpověď se "zapamatuje" - při druhém kontaktu se stejným antigenem člověk neonemocní nebo se rychle zotaví - podstata očkování - antigeny jsou rozpoznávány receptory na B a T buňkách - lymfocyty jsou aktivovány vazbou antigenu na receptor - Aktivované lymfocyty jsou klonovány - rychlé buněčné dělení - Lymfocyty přetrvávají ve formě paměťových buněk Vakcinace (očkování) Pravé neštovice (small pox) - infekční nemoc způsobená virem Variola major - mortalita 30-35% - u lidí se pravděpodobně objevila 10 000 let před našim letopočtem - má na svědomí přibližně 300-500 milionů mrtvých v 20. století - bývala zodpovědná za asi 1/3 oslepnutí - v roce 1979 ohlásila WHO úplné vymýcení pravých neštovic díky celosvětovému programu očkování - v 80. letech bylo zastaveno rutinní očkování dětí ve všech zemích (70. léta v Evropě a USA) - jediné známé vzorky viru zůstávají v laboratořích v Atlantě a v Moskvě Snímek viru z elektronového mikroskopu (wikipedia) Vakcinace (očkování) Edward Jenner (1749 - 1823) - doktor z Gloucestershire - při epidemii pravých neštovic si všiml, že dojičky, které prodělali kravské neštovice neonemocní - provedl experiment: - odebral vzorek kravské neštovice z pacientky Sarah Nelmesové - nakazil tímto 8-letého chlapce Jamese Phippse - po zotavení nakazil Jamese pravými neštovicemi - neonemocněl - očkování nepatentoval, aby mohli být léčeni bohatí i chudí wikipediaLatinsky "vacca" znamená "kráva"