Otázky z minula
Jak dlouho přežila myš treatovaná krevními progenitory z iPSC s opraveným genem pro sickle cell anemia?
"All three mice demonstrated stable engraftment based on the presence of GFP+ cells in the peripheral blood for up
to 12 weeks after transplantation". Hanna et al., Science 2007
Může se intron též překládat do proteinu?
Výjimečně ano. Intron retention většinou u rostlin, méně u živočichů.
a) Introny nebo jejich části mohou být výjimečně přepisovány do proteinů antigen
na lidském melanomu (Lupetti 1998) nebo isoforma proteinu
CEACAM6 (Kurio 2008).
b) Sestřihlá mRNA se zachovanými introny vycestuje z jádra, při translaci ale
dojde kvůli intronu k předčasnému ukončení a transkript je degradován regulační
mechanismus - zabrání se translaci.
c) Introny mohou zůstat v UTR (untranslated region) kde regulují translaci,
ale samy se nepřekládají (Remy 2014)
Humanized sickle cell anemia mouse model
(geny pro myší globin jsou nahrazeny
lidským hβA (zdravý) a hβS (anemie) homozygoti
hβS mají příznaky srpkovité
anemie, životnost 18 měsíců
Molekulární biologie
5. Translace genomu
Osnova
Translace bakteriální mRNA
Translace eukaryotické mRNA
Posttranslační procesy
Translace (překlad): tvorba proteinů na ribozomech podle mRNA
Hlavní zdroje:
S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie 1-4
Masarykova Universita Brno
ISBN 80-902562
B. Staveley, Principles of Cell Biology
Memorial University of Newfoundland
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/CBhome.html
M. Muller, Biology of Cells and Organisms
University of Illinios, Chicago
http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/summer2010/lecturesm10.htm
Wikipedia
Translace bakteriální mRNA
Část první: Bakteriální translace
- na ribozomech se tvoří polypeptidové řetězce za účasti tRNA podle informace obsažené v mRNA
- výchozími látkami je 20 standardních aminokyselin + selenocystein a pyrrolysin
- aminokyseliny se nejprve aktivují enzymem aminoacyl-tRNA-syntetázou
- dojde k vazbě aminokyseliny na tRNA a vzniká aminoacyl-tRNA (aa-tRNA)
1. Iniciace: tvorba iniciačního komplexu z ribozomů 70S, mRNA a tRNA
2. Elongace: prodlužování polypeptidového řetězce
3. Terminace: zakončení syntézy polypeptidového řetězce, signalizováno terminačním
kodonem.
kodon
antikodon
aminoacyl-tRNA
Aminokyselinový (poly-peptidový) řetězec (protein)
- AA spojeny peptidovou vazbou mezi -NH2 a COOH
- rozlišujeme N-konec a C-konec
- na tRNA se váže C-koncem
Trp
Lys
Asp
Phe
NH2 - Amin; COOH - karboxylová kyselina
Trp (tryptofan; W; kodon UGG); Lys (lyzin; K; AAA a AAG); Asp (kyselina asparagová; D; GAU a GAC); Phe (fenylalanin; F; UUU a UUC)
Transferová RNA (tRNA)
- sekvence CCA na 3'-konci
- obsahuje neobvyklé báze - zpřesňují syntézu proteinů
- jednotlivé tRNA uskutečňují přenos jednotlivých aminokyselin
(existuje více tRNA pro jednu aminokyselinu)
Sekundární struktura - jetelový lístek (komplementární sekvence)
- 4 hlavní ramena
- variabilní smyčka
a) krátká (3-5 nukleotidů)
b) dlouhá (13-21n., 75%RNA)
připojení aminokyseliny
5-methyluridin
Transferová RNA (tRNA)
Terciární struktura
- vodíkové vazby mezi bazemi dihydrouridinového ramena a preudouridinového ramena
Aktivace aminokyselin
Připojení aminokyseliny (AA) k příslušné tRNA
- ve dvou krocích za katalýzy enzymem aminoacyl-tRNA-syntetázou (esterifikace)
1. AA + ATP ↔ AA-AMP + PP
2. AA-AMP + tRNA ↔ AA-tRNA + AMP
Estery: organické sloučeniny, ve kterých je -OH skupina (např. z karboxylu COOH) nahrazena organickým zbytkem vzniklým
z alkoholu po odštěpení vodíku.
Esterifikace: chemická reakce, při které ester vzniká
1. 2.
+
HO
AMP
ATP
Aktivace aminokyselin enzymem aminoacyl-tRNA-syntetázou
- AA + ATP vstupuje do aktivního místa enzymu
- ATP ztrácí pyrofosfát (PP) a AMP se kovalentně váže na AA
- PP je hydrolyzován na dvě fosfátové skupiny
- tRNA se kovalentně váže na AA a nahrazuje tak AMP
- AA-tRNA se uvolňuje z enzymu
Vazebná rozpoznávací místa na enzymu:
1. pro aminokyselinu
2. pro ATP
3. pro tRNA
Enzym aminoacyl-tRNA-syntetáza
- každá aminoacyl-tRNA-syntetáza je specifická jen pro jednu aminokyselinu a k ní odpovídající varianty
tRNA (příbuzné)
- evolučně konzervovaná: 70% homologie mezi bakteriemi a savci
- patří mezi nejstarší enzymy, spjat s vývojem genetického kódu
Vazba enzymu na příslušnou tRNA:
- mimořádně přesná (mutace v jednom nukleotidu způsobí nerozpoznání)
- rozpoznávací místa leží na akceptorovém a antikodonovém rameni
antikodonové rameno
akceptorové rameno
Aktivace aminokyselin - souhrn
Aminokyseliny
Kde se berou?
Syntéza AA probíhá v biochemických drahách za katalýzy enzymy
Ne všechny organismy dokáží syntetizovat všechny AA
Člověk nedokáže syntetizovat 9 z 21 AA (esenciální aminokyseliny)
Esenciální AA přijímá člověk v potravě
Základním kamenem pro aminokyseliny je dusík (též pro nukleotidy)
Hlavním problémem v přírodě je získat dusík v použitelné formě
Atmosferický dusík N2 (N≡N) je relativně inertní a netvoří snadno sloučeniny
Řešení: mikroorganismy redukují atmosferický dusík N≡N na amoniak (čpavek, NH3) a ten pak používají
rostliny pro tvorbu aminokyselin
* za určitých patofyziologických podmínek může být syntéza těchto AA omezena
** pyrrolyzin není zahrnut v tabulce, jelikož se nevyskytuje u člověka (zdroj: Wikipedia)
Ribozom
Nukleoproteinová částice (proteiny + rRNA)
Funkce: Katalyzuje připojování aminokyselin podle kodu v mRNA
Poprvé popsán rumunským vědcem Georgem Emilem Paladem v 1950s
- v elektronovém mikroskopu se jevily jako "husté částice" či "granula"
- r. 1974 obdržel Nobelovu cenu
Termín "ribozom" byl navrhnut na konferenci "Syntézy proteinů" r. 1958
Obr.: www.nobelprize.org
Prokaryotické ribozomy 70S
- Sedimentační koeficient 70S
- Podjednotky: 30S a 50S
Proteiny - fialová; rRNA oranžová/žlutá
Podjednotka 30S Podjednotka 50S
Ribozom
Vazebná místa na prokaryotickém ribozomu
1. pro mRNA
- na podjednotce 30S
- obsahuje proteiny a 3'-konec 16S-rRNA
2. Aminoacylové místo (A-místo)
- vazba AA-tRNA
- na obou podjednotkách
3. Peptidylové místo (P-místo)
- na obou podjednotkách
- připojení nové AA (na tRNA) k nascentnímu polypeptidovému řetězci
4. Výstupní místo pro deacylovanou tRNA (exit; E-místo)
- výstup pro tRNA bez AA
- na podjednotce 50S
PROCES TRANSLACE
Průběh translace - Iniciace
- bakteriální mRNA se váže do mRNA binding site ribozomu 5'-koncem (Shine-Dalgarno sekvencí)
- začíná AUG a končí stop kodonem (UAG, UAA nebo UGA) a za ním nekodující sekvence na 3'-konci
- tyto sekvence jsou společné pro všechny prokaryotní geny
- u prokaryot jsou geny polycistronní (více genů na jedné mRNA) a tyto sekvence má každý gen zvlášť
Shine-Dalgarno sequence
Průběh translace - Iniciace
- první se zařazuje aminokyselina formylmethionin
- vznik katalyzován transformylázou
- k formylaci dochází až po připojení metioninu k tRNA (fMet-tRNAfMet)
- vazba na kodon AUG, pokud je na začátku → fMet-tRNAfMet, pokud není → Met-tRNAMet
- po prodloužení na 15-30 AA se (50/50):
a) deformyluje na zpět methionin (katalyzováno deformylázou)
b) odbourává (katalyzováno aminopeptidázou)
- tedy cca 50% polypeptidů začíná methioninem a zbytek tou druhou AA (kterákoli)
Aldehyd: organická sloučenina, která obsahuje aldehydickou funkční skupinu formyl (-CHO)
neplést s alkoholem (R-CH2-OH)
Aldehyd
Formaldehyd
Metionin N-formylmetionin
transformyláza
deformyláza
Průběh translace - Iniciace
Iniciaci řídí iniciační faktory IF1, IF2 a IF3
Bakteriální mRNA je polygenní (polycistronní), proto se
iniciace opakuje před každým novým genem
1. Disociace ribozomu na jednotky 30S a 50S
- vazba IF na 30S mj. zabraňuje znovuspojení
- mRNA se spojuje Shine-Dalgarno sekvenci
s podjednotkou 30S
2. IF2 se váže s fMet-tRNAfMet a ten nasedne na AUG
3. Odpojení IF1 a IF2 za hydrolýzy GTP je signálem pro
připojení velké podjednotky - zůstává fMet-tRNAfMet na
AUG kodonu mRNA v peptidylovém místě - iniciační
komplex na úplném ribozomu
Obrázky: http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-22/CB22.html
Průběh translace - Elongace
Elongaci řídí elongační faktory:
1. EF-Tu (přináší aminocyl tRNA)
2. EF-G (posunuje ribozom o 1 kodon)
1. binární komplex EF-Tu.GTP → ternární komplex
EF-Tu.GTP.AA-tRNA (všechny AA s vyjímkou fMETtRNAfMet)
kodon AUG je čten vždy jako metionin
2. ternární komplex řídí vazbu aa-tRNA do A-místa
ribozomu. Vazba na kodon mRNA a nukleotidy 16SrRNA
a 23S-rRNA. Hydrolýza GTP a uvolnění EF-Tu
3. přesun z A-místa do P-místa. Tvorba peptidové
vazby se sousední AA. Z E-místa je vytěsněna
deacylovaná tRNA
4. Ribozom se posune o jeden kodon (3 nukleotidy)
směrem ke 3'-konci mRNA. Vlivem EF-G Do A-místa
se dostává nový kodon. Prodloužení
polypeptidového řetězce o jednu AA. Označujeme
jako translokace ribozomu.
binární
komplex
ternární
komplex
EF-G
posunuje
o kodon
Latinsky: "binarius" = složený ze 2 částí; "ternarius" = složený ze 3 částí
Průběh translace - Terminace
Nutná přítomnost terminačního kodonu a
terminačních faktorů
Terminaci řídí "release" faktory RF1, RF2 a RF3
RF1: rozeznává kodony UAA a UAG
RF2: rozeznává kodony UAA a UGA
RF3: váže GTP a stimuluje činnost RF1 a RF2
Průběh terminace:
faktory uvolní tRNA z karboxylového konce
polypeptidového řetězce - zastaví jeho
prodlužování. Následuje uvolnění polypeptidu a
rozpad ribozomu na podjednotky
Video: Bakteriální translace
RF3
RF1/2
RF1/2
RF3
Pojmenování STOP kodonů:
UAG Amber
UGA Opal
UAA Ochre
Nejprve byl objeven STOP kodon UAG a jeho objevitelé Richard Epstein a Charles Steinberg pojmenovali
"Amber" po svém kamarádovi Harrisi Bernsteinovi. Další 2 STOP kodony byly pojmenovány pro
zachování "pojmenování barevných nerostů".
der Bernstein............. Amber.........................Jantar
der Opal..................... Opal............................Opál
das Ocker....................Ochre..........................Okr
Rychlost syntézy polypeptidu
- v E. coli se řetězec prodlužuje 10-20 AA/sek (cca 40 nukleotidů/s)
- na jedné molekule mRNA obvykle 10-15 ribozomů (polyribozom)
Tabulka mRNA kodonů
pokud je AUG na začátku řetězce je rozpoznán formylmethioninem, jinde pouze methioninem
21. aminokyselina Selenocystein je rozpoznávána stop kodonem Opal (UGA) za specifických podmínek (vč. člověka)
22. aminokyselina Pyrrolysin je rozpoznávána stop kodonem Amber (UAG) za specifických podmínek (pouze prokaryota)
Celkem 64 kodonů (4 x 4 x 4; dle tabulky) kóduje 20 + 1 + 1 aminokyselin
Platný pro prokaryota i eukaryota
Kodování aminokyselin:
- Celkem 64 kodonů na mRNA (4 x 4 x 4; dle tabulky) kóduje 20 + 1 + 1 aminokyselin
- Antikodonů na tRNA, které rozeznávají kodony na mRNA je vždy méně a liší se dle skupiny organismů
- Tedy, jedna tRNA, která přináší aminokyselinu dokáže rozpoznat více kodonů na mRNA (na posledním třetím
- místě kodonu nemusí odpovídat komplementární baze)
= Pravidlo o kolísavém párování bazí (wobble base pairing)
- v závislosti na druhu organismu může existovat více tRNA pro jednu AA
- E. coli: 40 antikodonů (tRNA) pro 64 kodonů (gramnegativní bakterie)
- Grampozitivní bakterie: 33 tRNA; mykoplasmata: 28 tRNA
Mykoplasmata: drobné bakterie bez buněčné stěny. Resistentní vůči antibiotikům cílícím na buněčnou stěnu (např. Penicilin)
Pravidlo o kolísavém párování bazí
Gramnegativní bakterie: 40 antikodonů* (tRNA) pro 64 kodonů
Neobvyklé baze typické v tRNA
(na posledním místě*)
Lyzidin (L)
- specifický pro isoleucin
- vazba na adenin
Queuosine (Q)
- specifický pro histidin, tyrosin,
kyselinu asparagovou a asparagin
- vazba na uracil a cytosin
Inosine (I)
- specifický pro arginin
- vazba na uracil a cytosin
* Antikodon v tabulce nutno obrátit zrcadlově
21. aminokyselina Selenocystein (Sec)
- je obsažen v tzv. "selenoproteinech" (např. enzym glutathion peroxidáza)
- vyskytuje se i u člověka
- přenášen speciální tRNA (tRNASec)
- na tRNASec se nejprve váže serin, který je pomocí selenocysteinázy přeměněn na selenocystein
- rozpoznává Opal kodon UGA (normálně terminační); známo od r1986*
- aby nebyl UGA rozpoznán jako terminační, je nutná vlásenka (hairpin) na mRNA a protein SELB
- selenocysteyl-tRNASec je do ribozomu přenášena specifickým elongačním faktorem SELB
L-cystein
SelenocysteinSerin
selenocysteináza
Glutathion peroxidáza: enzym, který v těle mění jedovatý peroxid vodíku na vodu a molekulární kyslík
*Chambers et al., Zinoni et al.
22. aminokyselina Pyrrolysin (Pyl)
- obsažena v některých archea a bakteriích, ne u člověka
- rozpoznává Amber kodon UAG (normálně terminační)
- objeven v r. 2002*
- vyskytuje se v aktivním místě enzymu methyltransferázy u archeí produkujících metan
- syntetizován ze 2 molekul lysinu
- podobně jako u selenocysteinu, přítomnost RNA vlásenky (PYLIS; Pyl insertion structure) za UAG
místem umožňuje inserci Pyrrolysinu v archaea.
- ostatní varianty lysinu (např. hydroxylysin, methyllysin) nejsou kódovány samostatným kodonem a
vznikají post-translační modifikací lysinu
2x L-lysin Pyrrolysin
* Srinivasan et a., Science 2002
Translace v elektronovém mikroskopu
www.env.boblupo.com
Translace eukaryotické mRNA
Část druhá: Eukaryotická translace
a) u živočichů v cytoplasmě a v mitochondriích
b) u rostlin v cytoplasmě, mitochondriích a chloroplastech
Cytoplasmatické ribozomy: liší se od prokaryotických; 80S
Mitochondriální a chloroplastové ribozomy: stejné jako u prokaryot; 70S
Rozdíly v eukaryotické (cytoplasmatické) translace oproti prokaryotické:
1. Počáteční AA je methionin (na N-konci polypeptidového řetězce)
- iniciační tRNAi
Met není formylována in vivo*
- stejný iniciační kodon AUG
- po prodloužení řetězce bývá odštěpen aminopeptidázou
2. Vyšší počet iniciačních faktorů než u prokaryot
* pokusy prokázaly, že in vitro ji lze formylovat formylázou z E. coli
první AA v řetězci je methionin
Eukaryotní mRNA:
- narozdíl od prokaryotní mRNA neobsahuje Shine-Dalgarno sekvenci (ribosome binding site)
- startovací kodon se nachází v "sekvenci Kozakové" CAAAAUG, kam je položena první AA Met-tRNAMet
proti kodonu AUG (ne, formylmethionin)
- oproti prokaryotům, obsahuje navíc:
- čepička na 5'-konci (5 prime cap; m7G - 7-metylguanozin) - váže CBP-proteiny* nezbytné
pro iniciaci translace (posadí mRNA na ribozom)
- polyadenylace 3'-konce (3 prime poly(A) tail) - ochrana proti účinku exonukleáz
*CREB-binding protein (poprvé izolován jako nukleární protein, který se váže na CREB protein)
Shine-Dalgarno
Cytoplasmatický ribozom 80S:
- 2 podjednotky složené z:
- 4 molekuly rRNA (18S, 5S, 5,8S a 28S u savců)
- 70 proteinů
- Sedimentační koeficient závisí na druhu organismu:
- celkem kolem 80S
- podjednotky cca 40S a 60S
a) Volné ribozomy: volně v cytoplasmě
- většinou syntéza intracelulárních proteinů
b) Vázané ribozomy: vázané na endoplazmatické retikulum (ER)
- pokryté části ER (drsné ER) a nepokryté
části ER (hladké ER)
- většinou syntéza extracelulárních proteinů
(cirkulující v krvi a membránové)
slideshare.net
Signální rozpoznávací částice (SRP)
- SRP slouží pro vazbu proteinů na endoplasmatické retikulum (pro transport ven z buňky či zabudování
do membrán) u eukaryot*
- SRP se vyskytuje též u prokaryot u proteinů cytoplasmatické membrány*
- N-konec polypeptidu obsahuje signální sekvenci (15-25 AA)
- Během syntézy vazba na SRP a zastavení elongace
- Komplex nascentního polypeptidu + SRP se váže na specifický receptor v membráně ER
- SRP je odštěpen
- po dokončení
translace je
ribozom uvolněn
z ER
*Nagai et al., EMBO 2003
Průběh cytoplasmatické translace
Iniciace
Účastní se soubor eukaryotických iniciačních faktorů - "eIFs"
- eIF-3 (na malé podjednotce) a eIF-3A (na velké) udržují
ribozomové podjednotky od sebe
- Důležitou roli hraje eIF-2, který váže iniciační tRNAMet na
malou ribozomální podjednotku 40S (43S-translační komplex)
- mRNA se napojí na malou podjednotku ribozomu (43Skomplex)
pomocí CBP-proteinů 5'-konci mRNA (m7G)
- Není zde Shine-Dalgarno sekvence za kterou by následoval
AUG kodon - probíhá tzv. skenování (hledání začátku AUG)
- 40S podjednotka se pohybuje po mRNA od 5'-konce k 3'konci
až nalezne "sekvenci Kozakové" CAAAAUG
- Met-tRNAMet je položena na peptydylové místo proti kodonu
AUG
- Uvolněním faktorů eIF-3 a eIF-3A se ribozomové
podjednotky spojí
CBP-proteiny
eIF-2
eIF-2
43S-translační komplex
Průběh cytoplasmatické translace
Elongace
- Řízena elongačními faktory EF-1 a EF-2
- Oba faktory značně homologní s bakteriálními EF-T a EF-G
- Elongace probíhá stejně jako u bakterií
Terminace
- Na rozdíl od prokaryot (3 RFs) pouze jeden terminační faktor: eRF (eukaryotic release factor)
- Rozeznává stejné 3 terminační kodony jako u prokaryot a uvolňuje polypeptidový řetězec z ribozomu
UAG Amber
UGA Opal
UAA Ochre
Kódování aminokyselin u eukaryot
- Standardní genetický kód
- Platí pravidlo o kolísavém párování bazí: 45 tRNA pro 64 mRNA
- z neobvyklých bazí se vyskytuje pouze inosine (I) (vazba na uracil a cytosin)
* Antikodon v tabulce nutno obrátit zrcadlově
Translace v mitochondriích
- translace podobná jako u bakterií (podpora endosymbiotické teorie)
- začíná formylmethioninem
- ribozomy 70S
- probíhá uvnitř mitochondrie, ale není úplně autonomní
- závislá na některých proteinech tvořených v cytoplasmě
- aminoacyl-tRNA-syntetázy; ribozomové proteiny a iniciační a elongační faktory
- vlastní tRNA
Genetický kód:
- pouze 22 tRNA (bez neobvyklých bazí)
- nejnižší známý počet druhů tRNA schopný zajistit translaci
* Antikodon v tabulce nutno obrátit zrcadlově
Translace v chloroplastech
- podobná jako u bakterií a mitochondrií
- začíná formylmethioninem
- ribozomy 70S
- 30 druhů tRNA (bez neobvyklých bazí)
* Antikodon v tabulce nutno obrátit zrcadlově
Posttranslační procesy
Posttranslační procesy
- U prokaryot i eukaryot
- translací končí přenos genetické informace ze strukturního genu na protein
- vlastnosti proteinu určuje primární struktura: tvar, chemické vlastnosti...
Úpravy polypeptidového řetězce
a) kotranslační - úprava nascentního* řetězce polypeptidu
b) posttranslační - vzniká funkční polypeptidový řetězec
Úrovně organizace proteinu (3D tvar)
1. Primární struktura: pořadí aminokyselin v řetězci
2. Sekundární struktura: prostorové uspořádání hlavního řetězce (α-helix a β-skládaný list)
3. Terciární struktura: prostorové uspořádání celého řetězce (vč. reakce na okolí hydrofobní)
4. Kvartérní struktura: uspořádání více podjednotek (oligomerní protein)
*Nascentní řetězec: ještě se prodlužující (rozlišujte mezi nascentním řetězcem mRNA a polypeptidu)
Někdy nebývá rozlišována kotranslace a posttranslace a oba děje jsou spojeny do posttranslačních modifikací
N-acetyl-galactosamine
a) KOTRANSLACE
Úprava nascentního* řetězce
- Deformylace
- u prokaryot; u eukaryot pouze v mitochondriích a chloroplastech
- odstranění formylové skupiny z formylmethioninu na N-koci polypeptidového řetězce
- enzym: deformyláza
- Odštěpení aminokyselin
- u prokaryot i eukaryot
- odštěpení první AA (N-terminálního methioninu) (popř. i dalších AA)
- enzym: aminopeptidáza
- Chemická modifikace aminokyselin polypeptidu
- modifikace R-zbytků aminokyselin
a) Fosforylace - připojení fosfátu (serin, treonin a tyrozin)
b) Glykolizace - připojení cukru (asparagin a serin)
c) Hydroxylace - připojení hydroxylové skupiny (-OH; lyzin a prolin)
- katalýza příslušnými enzymy
*Nascentní řetězec: ještě se prodlužující
a) KOTRANSLACE
- Tvorba disulfidových vazeb (SS můstek)
- proti sobě položené sulfhydrylové skupiny mohou být oxidovány - tvorba disulfidových vazeb
- pouze u cysteinu (vodíky se odštěpí a vytvoří peroxid vodíku)
- tvorba terciární struktury polypeptidového řetězce
- disulfidová vazba je kovalentní
- spontánně se tvoří pomalu oxidací (hodiny), v buňce je však katalyzována enzymem
proteindisulfidizomerázou (sek.)
Kovalentní vazba: dva prvky sdílí jeden nebo více párů elektronů, vysoká vazebná energie
Nekovalentní vazby: nižší vazebná energie, např. iontová nebo vodíková
a) KOTRANSLACE
- Tvorba disulfidových vazeb (SS můstek)
Nekovalentní vazby:
- iontová: jeden prvek přitáhne elektron(y) druhého a stane se aniontem (-), druhý prvek kationtem (+). Prvky jsou
vázány elektrostaticky. Slabší vazba než kovalentní
- vodíková (též vodíkový můstek): podstatně slabší než kovalentní a iontová. Vodík je vázán na silný elektronegativní
prvek (kyslík, fluor, dusík). Jediný elektron vodíku je odčerpán a (např. kyslíkem) kladně nabité jádro je odhaleno a
vzniká parciální kladný náboj, který poutá okolní elektronegativní prvky (např. kyslík)
Kovalentní vazba:
dva prvky sdílí jeden nebo více párů elektronů, vysoká vazebná energie
Disulfidová vazba spojuje
a) cysteiny stejného řetězce (např. u ribonukleáz)
b) cysteiny různých řetězců (např. glutathion, inzulín)
Mikroorganismy žijící v extrémně vysokých teplotách
mají ve svých bílkovinách mnohem více SS můstků
než ostatní organismy
Definice nekovalentních vazeb účastnících se tvorby terciární struktury proteinu:
a) KOTRANSLACE
- Vytváření sekundární a terciární struktury
- Spontánní tvorba sekundární a terciární struktury ještě před dokončením syntézy polypeptidu
- Sekundární strukturu proteinu určují vodíkové vazby mezi CO- a NH- skupinami
- α-helix nebo β-skládaný list
Obr: www.studyblue.com
Skládání proteinů (folding)
- pro správnou funkci musí být protein správně složen
- Primární sekvence je někdy dostatečná pro přímé skládání
Chaperony
- Čerstvě vytvořené nebo denaturované proteiny často potřebují pomoc "chaperonů" pro složení do
správného tvaru
- Funkce: Chrání nesbalené proteiny a pomáhají jejich správnému sbalení
- Nejznámějšími chaperony jsou heatshock proteiny rodiny Hsp70 (velikost 70 kDa), které v podobné
struktuře existují u všech organismů
- Prokaryota exprimují 3 proteiny Hsp70 rodiny: DnaK, HscA (Hsc66) a HscC (Hsc62)
- Heatshock proteiny se také tvoří vlivem stresu (např. vysoké teplotě)
- Proteiny denaturované teplem mohou být renaturovány pomocí chaperonů
b) POSTTRANSLAČNÍ ÚPRAVY
Chemická modifikace, kterou vzniká funkční polypeptidový řetězec
- Vyštěpení peptidů
- odstraňují se větší úseky polypeptidu
- podobně jako u pre-mRNA dochází ke "splicingu"
- vyštěpují se "inteiny" a zůstávají "exteiny"
- Tvorba kvartérní struktury
- spojení více polypeptidových řetězců do "oligomerních proteinů"
- většinou vodíkové můstky a jiné nekovalentní vazby
- dimer, trimer, tetramer...
- oligomer se v živé soustavě chová jako jedna molekula s biologickou funkcí
- Sestavování nadmolekulárních struktur
- enzymové komplexy, ribozomy, proteinové filamenty, membrány aj.
- Přidání prostetických skupin (kofaktorů)
- kofaktor: nepolypeptidová jednotka nutná pro funkci určitého proteinu
- prostetická skupina: kofaktor pevně vázaný na protein (i kovalentně)
- nachází se v aktivním místě enzymu
a) organická: vitamín, lipid, cukr
b) anorganická: iont kovu
POSTTRANSLAČNÍ ÚPRAVA HEMOGLOBINU
- transportní metaloprotein červených krvinek obratlovců
- Funkce: transport kyslíku z plic do tkání a odstraňování oxidu uhličitého z tkání do plic
- u dospělého člověka se skládá ze 4 podjednotek (2x α, 2x ß)
- každá podjednotka obsahuje
a) bílkovinnou část – globin
b) prostetickou část – hem (s železem)
Struktura hemoglobinu: Proteiny 2x α (červená) a 2x ß (modrá) a
hemové skupiny (zelená) (zdroj: wikipedia)
Hemová skupina (zdroj: wikipedia)
POSTTRANSLAČNÍ ÚPRAVA HEMOGLOBINU
- podle polarity aminokyselin v globinu se molekula ve vodě uspořádá do terciární struktury
(hydrofobní interakce)
a) hydrofilní AA vně molekuly
b) hydrofobní AA dovnitř molekuly (tzv. hydrofobní kapsa)
- do hydrofobní kapsy je vložena molekula hemu (dvojmocné železo chráněno proti oxidaci Fe2+ →
Fe3+)
- kvartérní struktura určuje prostorové uspořádání podjednotek tetrameru hemoglobinu a
interakce mezi nimi (hydrofobní a iontové interakce).
Hemová skupina. železo ve středu
tetrapyrrolového jádra (zdroj: wikipedia)
Některé nemoci jsou charakteristické chybným tvarem určitých proteinů
Alzheimerova nemoc (AD)
- 70% případů demence je způsobeno AD
- ztráta krátkodobé paměti → problémy s řečí, dezorientace, výkyvy nálad, nevhodné chování → ztráta
tělních funkcí a smrt
- doba přežití od diagnozy: 3-9 let
- příčiny: genetické predispozice (70%), vysoký tlak, deprese
- fyzické a duševní cvičení pomáhá, léčba neexistuje
Crews and Masliah, Human Molecular Genetics 2010; Wikipedia
Molekulární podstata AD
Amyloid prekurzorový protein (APP)
- membránový protein
- koncentrován v synapsích neuronů
- regulátor tvorby synapsí, neurální plasticity a exportu železa
- je prekurzorem molekuly beta amyloidu (Aβ) - polypetidu 37-49 AA
- oligomery Aβ způsobují amyloidní plaky na mozku pacientů s AD
Sekretáza
- enzym, který štěpí APP
- 3 formy:
1. α-sekretáza (hodná)
2. β-sekretáza (zlá)
3. γ-sekretáza (neutrální)
- pokud štěpí nejprve β-sekretáza a pak
γ-sekretáza → vzniká Aβ
- α-sekretáza štěpí blíže buněčné membráně
a po štěpení γ-sekretázou nevzniká Aβ
Crews and Masliah, Human Molecular Genetics 2010; Wikipedia
α-sekretáza
Molekulární podstata AD
Progresivní akumulace toxických Aβ oligomerů vede k:
1. disbalanci mezi hladinou produkce, agregace a odstraňování Aβ
2. poškození synapsí - tvorba membránových pórů
3. změny signálních drah účastnících se neurogeneze a správné tvorby synapsí (GSK3b, CDK5)
pozn. Existuje také "Tau hypotéza", která přisuzuje vznik AD špatně fungujícímu Tau proteinu, který má za úkol stabilizovat
mikrotubuly v neuronálních synapsích
β-sekretáza
γ-sekretáza
Pro podporu teorie akumulace Aβ oligomerů v AD hovoří výskyt nemoci (kolem věku 40 let) u Downova
syndromu (trizomie 21 páru, kde se nachází gen pro APP)
Molekulární podstata AD
4. aktivaci imunitního systému
- shluky Aβ oligomerů, tvořící amyloidní plaky, stimulují vyplavování chemoaktraktantů
poškozenými neurony, makrofágy, mikroglii (druh makrofágu v mozku) a astrocyty (výživové,
strukturní a imunitní buňky)
- cytokiny jako IL-1β, IL-6 a TNF-α působí pro-zánětlivě a přivábí neutrofily
- tato imunitní reakce má bránit mozek, ale v důsledku vede ke chronickému zánětu a je
jedním z hlavních faktorů rozvoje nemoci :(
www.rndsystems.com
Molekulární podstata AD
Látky pro možnou léčbu AD
- anti-agregační látky - blokují tvorbu oligomerů
- regulátory APP proteolýzy - blokace β-sekretázy
- redukce produkce APP - např. siRNA
- odstranění Aβ oligomerů - např. protilátkami
- blokátory hyperaktivních signálních drah a jejich receptorů, které jsou aktivovány neurotoxickými Aβ
oligomery (Fyn kináza, GSK3b, CDK5 inhibitory)
Crews and Masliah, Human Molecular Genetics 2010
mRNA pro APP
siRNA proti APP
monomer
Priony
- přirozeně se vyskytující proteiny v mozku zvířat a lidí jsou-li správně složené jsou neškodné
- špatně složené způsobují nemoci
- BSE u dobytka (Bovinní spongiformní encefalopatie; nemoc šílených krav)
- Creutzfeldt-Jakobova nemoc u lidí
Mayo Clinic