Molekulární biologie 12. Metody molekulární biologie a základy genového inženýrství Osnova metody pro studium genomu, transkriptomu a proteomu genetické manipulace M. Muller, Biology of Cells and Organisms University oflllinios, Chicago http://www.uic.edu/classes/bios/biosl00/summer2010/lecturesml0.htm Wikipedia Hlavní zdroje: S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie 1-4 Masarykova Universita Brno ISBN 80-902562 Genové inženýrství Snaha o manipulaci se sekvenci DNA organismu Cíle genového inženýrství: - vylepšit naše vědomostí o tom jak fungují geny - vytvářet produkty nebo léčit nemoci Příklad: produkce hormonů pomocí technologie rekombinantní DNA - např. produkce růstového hormonu při poruchách růstu Plasmid Malá kruhová DNA - hlavní část bakteriálního genomu je uložena ve velké kruhové molekule DNA - tam jsou "důležité" geny - na plasmidech jsou "doplňující" geny - bakterie dokáže přijímat cizí DNA z okolí (hlavně pod stresem) - Transformace - Konjugace - výměna plasmidů mezi bakteriemi - za normálních podmínek není bakteriální ani eukaryotická cytoplazmatická membrána pro DNA propustná Bacterium Metody pro navození propustnosti membrány: - Elektroporace - krátký elektrický šok vytvoří póry v membráně Bacterial chromosome Plasmid - Chlorid vápenatý (calcium chloride; CaCI2) - membrána normálně propustná pro chloridové ionty - nepropustná pro vápníkové ionty - vstupem CaCI2 se do buněk dostává i voda a DNA - Teplotní šok - při 42°C se v bakterii aktivují tzv. heat-shock geny zajišťující přežití ve vyšší teplotě - použití teplotního šoku po ovlivnění CaCI2 zvyšuje účinnost transformace Reštrikční endonukleázy Enzymy, které štípou DNA - štěpení probíhá v místě kódovaném specifickou sekvencí nukleotidů - přirozeně používány bakteriemi pro štěpení virové DNA EcoRI A A I T C - G - C I T A A G cut Restrikční místa (rozpoznávací sekvence pro štěpení): -jsou často palindromy na komplementárních řetězcích - methylovány (-CH3) aby chránily bakteriální DNA a štěpily pouze virovou - často zanechávají "sticky ends", např. EcoRI ("eco R one") u E. coli - "sticky ends" jsou využívány pro vložení genu do plasmidu Exonukleáza: štěpí DNA od krajů Endonukleáza: štěpí DNA od prostředku Helikáza: oddaluje řetězce DNA nebo RNA Ligáza: spojuje DNA řetězce RACE CAR GO. DOG'. EVILOUVE. Genové inženýrství v praxi Growth-hormone deficiency (GHD; pituitary dwarfism) - Nedostatek růstového hormonu - hypofýza (pituitary gland) neprodukuje dostatek růstového hormonu (GH; growth hormone; somatotropin) - léčba: injekce hormonu GH - do roku 1985 GH získáván autopsiíz hypofýzy (větš. mrtvá těla, častá kontaminace) - od roku 1985 je GH vyráběn v geneticky upravené bakterii E. coli technologií rekombinantní DNA (rHGH; recombinant human growth hormone) Výroba rekombinantního GH CREATING A cDNA LIBRARY THAT CONTAINS THE HUMAN GROWTH HORMONE GENE - izolujeme mRNA z buněk hypofýzy (různé typy mRNA, nejen mRNA pro GH) - pomocí reverzní transkriptázy přepíšeme mRNA do cDNA - připojení míst, která rozeznává endonukleáza ke koncům každé cDNA - vložíme do přichystaného plasmidu s genem na resistenci proti vybranému ATB - při štěpení endonukleázou vznikají tzv. "sticky ends" (komplementární baze) - cDNA "vlepí" do plasmidu tzv. ligacíza katalýzy DNA-ligázou - vložíme plasmidy do bakterií E. coli - ATB v mediu -> přežijí pouze bakterie, které přijmuly plazmid - takovou kolekci bakterií nazýváme cDNA knihovna - nyní musíme najít pouze bakterie, které přijmuli GH gen (různé cDNA podle různých mRNA) cDNA (complementary DNA): dvojšroubovicová DNA syntetizovaná podle templátu mRNA za katalýzy enzymem reverzní transkriptáza DNA-ligáza: enzym usnadňující spojení DNA řetězců katalýzou formace fosfodiesterové vazby cDNA knihovna: kombinace cDNA vložených do hostitele, které tvoří část transkriptomu. cDNA podle sestřižené mRNA už neobsahuje introny a je v prokaryotním organismu připravena k translaci 1. Isolate mRNAs from cells JJ, (bez intronu) 2. Use reverse transcriptase to synthesize a cDNA from each mRNA. cDNA mRNA Éii.iiijii>»iiiiiii..niiH,'||"",tiiiiiiiiii 5' GAATTC CTTAAG 3' Reverse ľ] transcriptase 3' GAATTC CTTAAG 5' fCTTAA „G AATTC CTTAA g Oj Antibiotic resistance gene V Recombinant plasmid 0 3. Attach a restriction endonuclease recognition site to ends of each cDNA. 4. Cut cDNAsand plasmids with restriction endonucleases; remaining sticky ends join by complementary base pairing. 5. Ligate cDNAs and plasmids with DNA ligase. 6. Introduce recombinant plasmids into £. coli cells via treatment that makes cells permeable to DNA. Grow cells in presence of antibiotic. Cells that can grow become part of cDNA library. Each cell contains one type of recombinant plasmid and thus one cDNA. Výroba rekombinantního GH FINDING THE GROWTH HORMONE GENE IN A cDNA LIBRARY - na Petřino misky s koloniemi položíme filtrační papír - kolonie se přilepí - rozdělíme dvojšroubovici DNA na jednořetězce a inkubujeme se sondou - sonda - krátká sekvence DNA, která odpovídá sekvenci v požadovaném genu (značená radioaktivně) - RTG film vytvoří značky na místech s radioaktivní DNA sondou - tyto kolonie namnožíme Video: Genové inženýrství 1. Grow E.coli cells containing plasmids on many plates. Each colony contains a different cDNA. 2. Lay a filter on each plate, then remove. Some cells from each colony stick to filters. 3. Treat filters with chemical to make DNAs single stranded. 4. Probe filters with labeled DNA (short sequence inferred from amino acid sequence of growth hormone). 5. Labeled probe and growth hormone cDNA base pair. Lay X-ray film over filters; black spot marks location of 6. On original plates, find colony of E. coli cells that contains growth hormone gene. Sample cells, grow, and analyze. Figure 19-4 Biological Science, 2/e ©2005 Pearson Prentice Hall, Inc. Další příklady genového inženýrství v praxi Chymosin - enzym používaný pro výrobu sýru - první rekombinantní protein schválený v potravinářství - produkce v E. co li Inzulín - rekombinantní inzulín kompletně nahradil inzulín izolovaný ze zvířecích tkání - lidský gen pro inzulín vložený do E. coli nebo kvasinek Saccharomyces Cerevisiae Faktor VII - plazmatický koagulační faktor pro hemofiliky - dříve izolován z krve dárců - riziko přenosu nemocí Vakcína proti žloutence typu B - produkce povrchových antigénu viru v kvasinkách - virus hepatitídy B nelze pěstovat in vitro (jako např. virus obrny - Poliovirus) Rostliny rezistentní k herbicidům - např. sója, kukuřice, bavlna -vložen rekombinantní gen zajišťující rezistenci proti herbicidu glyphostatu (Round Genové inženýrství v praxi Úprava genomu eukaryotických organismů - geneticky modifikované potraviny 1. Agrobacterium tumefaciens - gramnegativní bakterie - rostlinný parazit s přirozenou schopností genového transferu - infikuje dvouděložné rostliny (brambory, rajčata a tabák) - začleňuje do genomu rostliny Ti-plazmid (T-DNA) - Ti-plazmid obsahuje geny pro produkci rostlinných hormonů - tvorba nádoru produkujícího aminokyseliny "opiny", sloužící agrobakteriím jako energetický zdroj - Ti-plazmid je nahrazen umělým plazmidem 2. Gene gun - pro rostliny, které nejsou napadány Agrobakterií (jednoděložné: pšenice či kukuřice) - DNA je zkombinována s částečkami zlata a pod tlakem "vstřelena" do buněk - v buňce se DNA oddělí a je transportována do jádra 3. Elektroporace - pro živočišné buňky a rostlinná pletiva, která neobsahují buněčnou stěnu 4. CRISPR - vektorový systém pro editaci genomu eukaryotických buněk - rostlinné i živočišné buňky CRISPR - krok 1: vytvoření DNA DSB (double strand break) Clustered regularly interspaced short palindromic repeats - editace genomu budoucnosti - přesně nalezne místo na genomu, které chceme upravit - mechanismus adaptivní imunity bakterií (CRISPR/Cas) - RNA-guided DNA-nukleáza je přirozeně využívána bakteriemi k inaktivaci virové DNA - modifikován pro využití k úpravě genomu eukaryot (CRISPR/Cas typ II z Streptococcus pyogenes) - 2 komponenty 1. Cas9 protein (endonukleáza) 2. nekódující guide RNA (gRNA) - zvolíme si 20 nukleotidů dlouhou sekvenci na gRNA (target-specific crRNA), komplementární s místem na genomu, které chceme štěpit - po navázání gRNA na toto místo, Cas9 zde vytváří na DNA dvojzlom (DSB) DSB lze využít a) sám o sobě k umlčení genu b) vložení jiného genu 6*\ Cas9 u u u u u a tracrRNA " Target-specific crRNA /mh« H »»• luoai tHguutffufgNfufiJff*" !fó|jM^^"!to|jM GCATTICGGTAľGCATAlC Target genomic Loci PAM www. lifetechnologies. com/crispr CRISPR - krok 2: vložení genu do místa DNA DSB - DNA dvojzlomy mohou být opraveny dvěma mechanismy: 1. Non-homologous end joining (NHEJ) 2. Homologní rekombinace (HR) - pokud do buňky zároveň vložíme templátovou DNA, pak je šance na zabudování teto nové DNA právě ve zvoleném místě, kde jsme vytvořili dvojzlom pomocí CRISPR/Cas CRISPR/Cas 1. NHEJ Gl 2. HR S/&2 Minimal end processing -no n-homologous end joining DNL4 I "Classic" NHEJ Alternative NHEJ Actuation of 5'-3' resection -homologous recombination Conservative repair templet ie: 1. sesterská chromatida v S/G2 2. nesesterská chromatida v Gl 3. exogénni DNA templet Ekkok PRONE ERROR FfcEE www.microbiology.columbia.edu GENOVÉ KOREKCE - proof-of-principle: Korekce defektního genu pro (3-globin, způsobujícího srpkovitou anémii (sickle cell anemia); na myším modelu* * Hanna J. et al, Science 2007; reviewed in Simara P. et al, Transl Res 2013 PCR - Polymerase Chain Reaction Metoda pro masivní replikaci úseku DNA Kary Mullis - metodu vynalezl počátkem 80. let - 1993 - Nobelova cena - jediná za výzkum v komerční biotechnologické firmě (Cetus) - používal dva primery, které ohraničili úsek DNA, který chtěl amplifikovat - nově vytvořená DNA se musela denaturovat (oddělit oba řetězce) při teplotě nad 90°C další cyklus amplifikace - teplotou nad 90°C se ovšem inaktivovala DNA Polymeráza I - musela tedy být přidána nová Polymeráza při každém cyklu Taq Polymeráza - původně izolována r. 1976 z termofilní bakterie Thermus aquaticus - bakterie žije v termálních pramenech (gejzír v parku Yellowstone; 70°C) - optimální aktivita Taq Polymerázy je 75-80°C (vydrží 95°C až 40 min) - při 73°C připojuje 100 bazíza sekundu Patent - Roche koupil r. 1993 patent na PCR od Cetus Corp. za $330 milionů - odhadovaný výdělek pro Roche je $2 miliardy to De replicated 1. Denaturation (90°C) 2. Annealing (55°C) 3. Extension (73°C) « 1** 3' 5' DNA primer 3' e 3' nucleotide PCR - Polymerase Chain Reaction Reakce probíhá v přístroji zvaném termo-cykler, který velmi rychle střídá teploty. 3' 5' 30s 94°C • • ■ O ©O * < 6323 ooo n Engine OOO T 30s55°C I c O 30s 73°C Video: PCR I 3 Si Ä Ä li"0 1. Start with a solution containing template DNA, synthesized primers, and an abundant supply of the four dNTPs. 2. Denaturation Heating leads to denaturation of the double-stranded DNA. 3. Primer annealing At cooler temperatures, the primers anneal to the template DNA by complementary base pairing. 4. Extension During incubation, DNA polymerase uses dNTPs to synthesize complementary DNA strand, starting at the primer. 5. Repeat cycle of three steps (2-4) again, doubling the copies of DNA. 6. Repeat cycle again, up to 20-30 times, to produce millions of copies of template DNA. PCR - Polymerase Chain Reaction - velikost výsledného DNA fragmentu je ověřena na elektroforetickém gelu - v elektrickém poli putují záporně nabité molekuly DNA k anodě (+) - gel tvořen Agarozou a kratší molekuly DNA v něm putují rychleji než delší - pro vizualizaci fragmentů DNA je gel napuštěn etidium bromidem, který se váže na DNA a po ozáření UV světlem svítí molecules www. bioll51.nicerweb.com PCR v laboratorní praxi Detekce kontaminace buněčné kultury mykoplasmaty 5x Green buffer lOul PCR Nucleotide mix (20mM) 0,5ul (final 0,2mM) F primer (lOOuM) 0,25ul (final O^uM) R primer (lOOuM) 0,25ul (final 0,5uM) Taq DNA polymeráza 0,25ul (final 1,2511) Tem plátová DNA x ul (final lOOng) Doplnit vodou pro PCR na 50ul Increased sensitivity to inducers of apoptosis Cell death \ I Chromosomal aberrations Disruption oř nucleic acid synthesis Changes in cell membrane antigenicity / Inhibition of cell growth Alteration of DNA transfection efficiency Inhibition of cell A metabolism Compromised production of viruses DNA fragmentation due to mycoplasma nucleases. NOT apoptosis Cycler byl nastaven: název programu - MYCOPLAS „Calculated" step 1: teplota a čas (iniciální 2min 94°C) step2:0:30min94°C - ^evvCvWcO-te, step 4: 0:30min 73°C - £X step 5: GoTo step 2 35cycles step 6: final extension 5min 73°C step 7: 4°C forever (zadat čas 0) ^ <^ step 3: 0:30min 55°C - C\nA£C,\^^ Mycoplasma: nejmenšfa nejjednodušší rod bakterií (cca 0,l\xm), nemají buněčnou stěnu (neúčinkují běžná ATE), často patogenní. V buněčných kulturách negativně ovlivňují růst buněk. PCR v laboratorní praxi Detekce kontaminace buněčné kultury mykoplasmaty - PCR primery navrženy tak, aby nasedaly pouze na sekvence přítomné v DNA mykoplasmat - PCR produkt vzniká pouze pokud je přítomna DNA mykoplasmat - velikost produktu je 370bp - do gelu přidán EtBr (DNA interkalátor) - vizualizuje DNA pod UV lampou 370bp 500bp 400bp 300bp 200bp lOObp 1. pozitivní kontrola - mykoplazmatická DNA 2. negativní kontrola - genomová DNA 3. vzorek č. 1 4. vzorek č. 2 5. vzorek č. 3 20bp a 27bp zbytky primerů PCR v kriminalistice - DNA fingerprinting - STR navrhnul Alex Jeffreys r. 1984 sledují se nekódující regiony DNA zvané Short Tandem Repeats (STR) - krátké sekvence o 2-5 bazích opakující se 5-50x - každý člověk má unikátní sestavu (s výjimkou jednovaječných dvojčat) primery jsou navrženy před a za STR sekvencí DNA vyizolovaná z buněk je amplifikována pomocí PCR v nekódujících úsecích DNA vytipovaných pro STR na elektroforetickém gelu se detekuje velikost fragmentu :v:- Wikipedia STR STR gene gene gene STR STR gene gene gene STR STR ■j i y\ /\ z11111 i: ,/v. ,/v y\ \/\ /v ľ \\ \\ W! /v v\ . gene gene gene /7ttps://u/M/M/.yoL/tL/jbe. com/watch ?v=DbR9xMXuK7c PCR v kriminalistice - DNA fingerprinting - STR - porovnání s DNA nalezenou na místě činu (z krve, semene, kůže za nehty...) - používají se STR s 4- nebo 5-nukleotidovými repeticemi https://www.youtube. com/watch ?v=DbR9xMXuK7c; Wikipedia PCR v kriminalistice - DNA fingerprinting - STR - FBI má databázi DNA zvanou CODIS (Combined DNA Index System) - dle pravidel CODISu se testuje a uchovává 13 STR genetických markerů na různých somatických chromozomech (2 alely - tzn. max 26 bandu) + amelogenin pro určeni pohlaví - AMEL: na chromozomu X obsahuje intron 1 6bp deleci, na rozdíl od Y (muž XY: bandy 106 a 112; žena XX pouze 1 band 106) 13 CODIS Core STR Loci with Chromosomal Positions D13S317 il D5S818 FGA B § LCSF1P0^ BBC 23456789 10 11 12 AMEL D16S539 ■ D18S51 D O Ô O 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 - H s * " D21S11 S - 1 ■S U U AMEL ■ Y DNA fingerprinting - RFLP EcoRI - G A A I T C - Restriction fragment length polymorphism (RFLP) - C I I A A G - CUt - starší metoda pro testování identity na základě DNA - reštrikční enzymy naštípou DNA ve specifických místech a vznikají různě dlouhé fragmenty DNA unikátní pro každého člověka Nevýhody RFLP oproti STR - pomalá, náročná metoda a méně přesná metoda - vyžaduje velké množství DNA ĽcoH 1 site i-Target Sequence-1 EeoR I site ..TAAGAGTTGAATTGAÄTTGCATGCATGCATGCATGCATTTACTGAATTGGATCGAGTCA.. ..ATTCTGAAGTTAAGTTAACGT ACGTACGT ACGTACGTAAAT GAGTTAAGCTAGGTGAGT.. _ I-Probe Sequence -1 v .TAAGAGTT^ AATTGAATTGCATGCATGCATGCATGCATTTAGTG AATTGGATCGAGTCA. . AT T G T G AAC T T AA GT T AAC GT AC GT AC GT AC GT AC GT AAAT GAG T T AA GC T AGGT G AGT . Testování otcovství - dříve bylo používáno hlavně vyloučení otcovství na základě krevních skupin či dalších leukocytárních antigénu - přesnější je testování DNA metodou RFLP, v současnosti hlavně STR - typickým výsledkem je 0% pro negativní a 99,99% pro pozitivní test - každý proužek na štěpené DNA dítěte musí odpovídat proužku na vzorku otce nebo matky nebo obou - je zde zanedbatelná možnost unikátního fragmentu, který u dítěte vznikne v důsledku crossing-overu a/nebo mutace Video: Testování otcovství Kvantifikace exprese genů 1. pro určení množství transkribované mRNA z určitého genu a) Real-time PCR b) Microarrays 2. pro určení množství vyrobeného proteinu určitého genu a) Western blotting b) Flow cytometrie Centrální dogma MB Transcription Translation Gene -► Transcript - ——► Polypeptide (DNA) (RNA) (amino acids) Replication Reverse ĺ I transcription ^ vzniká cDNA la) Real-time PCR (kvantitativní; qPCR) Měření nárůstu nově syntetizované DNA po každém cyklu PCR Funkce: určit výchozí množství m RNA ve vzorku a tím sledovat aktivitu genů Postup: 1. izolujeme mRNA (pomocí kitu) 2. přepis mRNA do komplementární DNA (cDNA) pomocí enzymu reverzní transkriptázy 3. provedeme PCR podle principu popsaného výše, ale přidáme navíc fluorofor* 4. PCR reakci provedeme ve speciálním termo-cykleru s detektorem fluorescenčního záření 5. software vyhodnotí relativní genovou expresi (počet kopií mRNA) * Fluorofor (=fluorochrom): molekula, která po osvícení světlem určité vlnové délky absorbuje energii tohoto záření a prakticky okamžitě jí ztratí emisí záření o delší vlnové délce. Tomuto jevu se říká fluorescence. Fluoroforem může být malá molekula, typicky organická sloučenina s aromatickým jádrem, nebo i celý protein (např GFP). (Wikipedia) la) Real-time PCR (kvantitativní; qPCR) Dvě základní techniky qPCR: 1. dsDNA fluorofory (nejčast. SYBR Green) - fluorofor mění své strukturní vlastnosti po navázání na dvoj'řetězcovou DNA (dsDNA) a rozsvítí se - detekuje veškerou dsDNA, takže i možné nespecifické produkty, či příp. dimery primerů 2. Reportérové sondy - krátké sekvence komplementární DNA označené fluoroforem (reproter) a zhášečem (quencher) -jsou specifické pro sledovaný PCR produkt (gen) - mnohem přesnější než barvení dsDNA - komerčně dostupná tzv. "Universal ProbeLibrary - UPL" - soubor DNA 100 sond - software navrhne vhodnou sondu pro vybraný gen a také vhodné primery tak, aby vznikal pokud možno jeden produkt PCR (amplikon) a pouze na něj pasovala vybraná sonda la) Real-time PCR (kvantitativní; qPCR) Vyhodnocení dat z qPCR - 4 křivky v triplikátu - pozdější nárůst = méně cDNA (menší exprese mRNA) - sledování poklesu exprese genu OCT3/4 v průběhu diferenciace embryonálních kmenových buněk (hESC) - OCT3/4 je exprimován nejvíce v kmenových buňkách a u diferencovaných buněk je umlčen Amplification Plot 0.000001 —'-'-'-'—■—'-i—i-i—i—'—'-'—'—'—■—'—i—1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Cycle lb) Microarray Mikroskopické spoty DNA fixované na pevném povrchu (chip, microarray) Funkce: zjištění míry genové exprese simultánně u obrovského množství genů - každý spot (sonda, probe) je větš. krátký usek genu, který se hybridizuje s cDNA Fully complementary Partially complementary strands bind strongly strands bind weakly Sample Aqueous Phase Phenol Phase niRNA Protein DNA Purification mRNA Aminoallyl Reverse Nucleotides , Transcriptase cDNA Cy Dyes /or Cy5 Cy3 cDNA labelled cDMA RT Coupling Hybridization and washes I \ I Filter laser Scanning intensity ratio Normalization and analysis Wikipedia lb) Microarray Srovnávají se mRNA dvou vzorků, např. - vzorek/referenční DNA - zdravý/nemocný - před/po léčbě Gastric cancer -u" i- > H. n - rf. ■ . M. "jut. Cancer Cells Normal Cells mRNA RNA Isolation Reverse Transcriptase Labeling I mRNA I CDNA cDNA "Red Flourescent" Probes "Green Fluorescent" Probes Combine Targets Hybridize to Microarray například: upregulace proto-onkogenů downregulace tumor supresorů •0.7 0.8 Genes centered, log intensities saturated at: -4.6 to 6.6 2a) Western blotting Určení množství určitého proteinu ve vzorku 1. vyizolovat celkový protein ze vzorků a změřit jeho koncentraci 2. zahřát s mercaptoethanolem a SDS pro přidělení negativního náboje a rozpojení disulfidických můstků 3. smíchat s barvičkou a nanést ve stejných koncentracích na polyakryamidový gel http://www. biologyexams4u. com/ 2a) Western blotting 4. přenést proteiny z gelu na nitrocelulozovou membránu 0 Cathode http://www. leinco. com/ 2a) Western blotting 5. inkubovat membránu s primární protilátkou proti sledovanému proteinu 6. inkubovat se sekundární protilátkou konjugovanou s enzymem (např. křenová peroxidáza; HRP) 7. nanést na membránu vyvolávací roztok se substrátem pro daný enzym (např. luminol) Detection Signal Membrane Containing Tran&ferred Protein http://www. leinco. com/ 2a) Western blotting 8. vyvolat membránu - HRP katalyzuje oxidaci luminolu na 3-aminoftalát za emise světla - nízká intenzita světla při 428nm - přítomnost dalších chemikálií (fenoly) ve vyvolávacím roztoku amplifikuje světlo až lOOOx - tato amplifikace se nazývá "enhanced chemiluminescence - ECL" detekce pomocí CCD kamery vyvolání na fotografický film 24 h 48 h 24 h 48 h dasalinib 1 nM dasatinib 100 nM washout BIM GAPDH p-CRKL CRKL p-ERK ERK P-STAT5 STAT5 PARP c-PARP + 1x 1x + + + + 2x 3x 2x 3x Figure 2. Effect of intermittent high-dose TKI treatment on signaling pathways in the K562 cell line. The cells were exposed to imatinib (A) or dasatinib (B) at a low dose continuously (2.5 uM imatinib or 1 nM dasatinib), a high dose continuously (32.5 nM imatinib or 100 nM dasatinib) or a high dose transiently (washout 1x, 2x, or 3x). The cells were then lysed and analyzed by Western blotting. The incubation time was 24 and 48 hr. Simara et ai, AJH 2013 2b) Flow cytometrie Technika pro analýzu velkého množství buněk. Na buňkách je možné rozlišit - velikost (forward scatter) - tvar (granularitu; side scatter) - expresi povrchových proteinů (protilátka proti povrchovým antigenům konjugovaná fluorochromem) - expresi intracelulárních proteinů (buňky nutno usmrtit a permeabilizovat membránu) Fluorescent Channels Bandpass Fiter Forward Scatter Detector 2b) Flow cytometrie Vyhodnocení: Leukocyty - bílé krvinky hledání NK buněk CD3 - T cell receptor CD16 - povrchový antigen na NK buňkách, neutrofilech, monocytech a makrofázích CD56 - povrchový antigen NK buněk Granulocyty Neutrophils Eosinophils Basophils Lymphocytes Monocytes 4 Platelets o •Jb Erythrocytes o - to Granulocyt '.-.aw oo Height 1 i ■ ■ 1 1 i 800 1000 1 NK eel ■1 * i .. ■ . •' v v: ■', / N KT cell m t* • :',t.£ . . -j^l'' T cell FSC- R1 (lymphocyte) gating CD3 FITC CD37CD16+/CD56+(upper right) part reading Natural killer cell (Large granular lymphocyte) Common lymphoid progenitor r—1-. Small lymphocyte T lymphocyte NKcells - imunitní odpověď proti rakovinným buňkám a buňkám infikovaným virem Granulocyty - přítomnost granulí v cytoplazmě a zaškrceníjádra B lymphocyte I Plasma cell www. biosbcc.net, www. ogscience. org wikipedia Frederick Sanger (1918 - 2013) Vynálezce metody dideoxy sekvenování DNA (též Sangerovo sekvenování) - dvojnásobný držitel Nobelovy ceny za chemii (1958 a 1980) - 1952 definoval pořadí aminokyselin ve dvou řetězcích bovinního inzulínu - 1977 publikoval dideoxy metodu pro rychlé a přesné sekvenování Sangerovo sekvenování Sekvenování je určování pořadí nukleotidů v molekule DNA - principem je použití dideoxyribonukleosid trifosfátu (ddNTP) namísto deoxyribonukleosid trifosfátu (dNTP) - při replikaci se normálně připojuje nový dNTP na OH-skupinu posledního dNTP na 3'-konci řetězce - pokud se připojí ddNTP - elongace končí ddNTPs terminate DNA synthesis. Base OH Normal dNTP (extends DNA strand) Figure 19-6a Biological Science, 2/e Base No OH ddNTP (terminates synthesis) e 2005 Pearson Prentice Hall, Inc. Sangerovo sekvenování - smícháme templátovou DNA + DNA polymerázu + dNTP (T, A, C, G) + 1 ddNTP (např. G) + radioaktivně značený primer -> elongace řetězce se zastaví na místech zabudování ddGTP - vznikají nám různě dlouhé řetězce DNA Template DNA ddGTP terminates synthesis where C's occur; ddCTP, ddATP, and ddTTP terminate synthesis where G's,Tfs, and A's occur, respectively ainiai i i I II I H 3' Primer with radioactive label Figure 19 6b Biological Science, 2/e 12005 Pearson Prentice Hall, Inc. dATP - deoxyadenozin trifosfát, dGTP - deoxyguanozin trifosfát, dCTP - deoxycytidine trifosfát, dTTP - deoxythymidine trifosfát Sangerovo sekvenování - Reakci provedeme 4x, pro každý dideoxyribonukleosid zvlášť (ddATP, ddCTP, ddGTP a ddTTP) - produkty těchto 4 reakcí naneseme do 4 jamek elektroforetického gelu a roztřídíme podle délky - sekvence DNA je jasná z gelu Smaller fragments Larger fragments 5' end 3' end °"\\ Am',V 5' caacgacaatcc 3' Non-template DNA 3' gttgctgttagg 5' Template DNA Figure 19-6c Biological Science, 2/e © 2005 Pearson Prentice Hall, Inc. Modernizace Sangerova sekvenování - ddNTP jsou značeny fluorescenčně, každý jinou barvičkou a proto lze všechny 4 ddNTP smíchat do jedné reakce a není potřeba radioaktivně značený primer - fragmenty jsou separovány v kapilárách naplněných gelem - automatické zaznamenávání délky jednotlivých fragmentů FLUORESCENT MARKERS IMPROVE SEQUENCING EFFICIENCY. .T„ . .MP ddCTP ' frrp ***** dATP ddTTPÄ ddGTP dGTP DNA polymerase Template DNA Long fragments Short fragments Capillary Output tube 1. Do one sequencing reaction instead of four. Reaction mix contains dd ATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP with distinct fluorescent markers. (With radioactive labels, four reactions are needed—one labeled ddNTP at a time.) 2. Fragments that result have distinctive labels. 3. Separate fragments via electrophoresis in mass-produced, gel-filled capillary tubes. Automated sequencing machine reads output. Figure 20-1 Biological Science, 2/e > 2005 Pearson Prentice Hall, Inc. Buněčné reprogramace Příprava lidských indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC) Tyto jsou schopny diferencovat do tkání všech třech zárodečných listů Jedním z možných využití je příprava progenitorů pro transplantace (např. krevní, pankreatické, jaterní...) Shinya Yamanaka nar. 1962 Nobelova cena 2012 (sdílená s J. Gurdonem) Obr.: Wikipedia Sebeobnova (self-renewal) a diferenciace "Stem cell is capable of self-renewal and gives rise to a specialized cells" Typy kmenových buněk" Totipotentní. Pluripotent™. dává vznik celému organismu např. zygota; časná blastomera diferencuje do všech 3 zárodečných listů, ale ne do extraembryonální tkáně např. inner cell mass; ESC; iPSC pouze v embryu Multipotentní. Unipotentní. diferencuje do různých buněčných typů v rámce určité linie např. hematopoietic stem cell diferencuje pouze do jednoho buněčného typu např. spermatogonium existují i v dospělých * Amabile and Meissner. Induced pluripotent stem cells: current progress and potential for regenerative medicine. 2009. Cell Reset do embryonálního stavu - diferenciace probíhá většinou jednosměrně a reprogramace či transdiferenciace je vzácná (např. některé nádory) - avšak jádro většiny buněk si zachovává schopnost resetovat se do embryonálního stavu: • Nukleární transfer - jádro somatické buňky je vystaveno faktorům oocytu 1952, Briggs, 1962 Gurdon: transplantace jádra z buňky blastuly do žabích vajíček 1997, Wilmut: ovečka Dolly, první nakloňovaný savec neprovedeno na lidech; je potřeba značné množství oplozených vajíček • Přímá reprogramace - indukovaná overexprese definovaných transkripčních faktorů 2006, Takahashi a Yamanaka: transformovali myšší fibroblasty do pluripotentních buněk vložením 4 genů - Oct3/4, Sox2, Klf-4, c-Myc (OSKM) 2007, Takahashi; Yu: iPSC z lidských fibroblastů Jak připravit lidské iPSC? Genome-integrating risk of tumorigenicity Retrovirus Lentivirus individual viral vectors one viral vector STEMCCA Integration-free potential for clinical use Sendai virus Episomal vectors excisable STEMCCA synthetic mRNA Recombinant proteins Zdrojové buňky Povrch pro kultivace iPSC a) MEF feeders iPSCs kultivovány na vrstvě ozářených myších embryonálních fibroblastů (MEFs; 50Gy) MEFy získávány přímo z myších embryí b) Geltrex™ feeder-free systém Kultivační misky pokryty membránovým matrix Nepřítomnost xenogenních buněk je vhodnější pro klinické aplikace Reprogramming timeline DO reprogramming D10 first colonies D19 clones picked on fresh MEFs or Gelrex D31 succesfull expansion Potenciál iPSC v regenerativní medicíně Patient Patient-specific iPSCs - Detection of high-quality iPSCs Specialized cells Availability of efficient differentiation protocols Proper preclinical animal models - Reproduction of disease-specific phenotype - Scalability of assay for drug screens Drug screening ('Disease modelling') Cell therapy Successful engraftment Teratoma risk Maturation level and functionality of cells - In vivo efficacy - Toxicity in large population Treatment of multiple patients Single treated patient ■ In vivo efficacy Costs associated with patient-specific therapy * Wu, S. and Hochedlinger, K. 2011. Nature Cell Biology; reviewed in Inoue H. et al, EMBO 2014 Buněčné transdiferenciace - vydiferencovaná buňka má schopnost, změny na jinou buňky, při použití vhodných transkripčních faktorů - z kožního fibroblastu lze vytvořit svalový myocyt (1970s) nebo neuron (2000s) - lze přeskočit mezikrok kmenová buňky Marius Wernig, Sy-Stem conference, Vienna 2018 Chimerní organismus Tvorba chimerních organismů a) vložit orgán jednoho organismu do jiného - pravdepodobne bude odmítnut imunitním systémem hostitele b) vložení kmenových buněk jednoho organismu do embrya jiného organismu - buňky lze směrovat do určitého orgánu tak, že v hostitelském embryu pomoci CRISPR/Cas9 vyřadíme např. geny pro vývoj slinivky a slinivka vyroste pouze z buněk dárce - km. buňky dárce ovšem mohou proniknout částečně i do jiných orgánů (mozek, spermie) Mouse Wu et alv Interspecies Chimerism with Mammalian Pluripotent Stem Cells. Cell. Volume 168, Issue 3, p473-486.el5, 26 January 2017 Tvorba chimerních organismů z lidí Lidské embryonální buňky mají schopnost integrovat se do embrya jiného druhu a diferencovat tam Wu et al., Interspecies Chimerism with Mammalian Pluripotent Stem Cells. - vložili 3-10 buněk lidských hiPSC do prasečího embrya (167 embryí; blastocysta 7dní) - embrya vložena do děloh bachyní a analyzována po 3-4 týdnech vývoje - chimerní embrya měla sice zpomalený růst oproti kontrolním prasečím embryím, ale obsahovala v průměru 100 000 lidských buněk Human iPSCs An image of a pig blastocyst being injected with human cells. Wu et alv Interspecies Chimerism with Mammalian Pluripotent Stem Cells. Cell. Volume 168, Issue 3, p473-486.el5, 26 January 2017