Molekulární biologie
4. Transkripce
Osnova
1. Transkripce (prokaryotického)
bakteriálního genomu
2. Transkripce eukaryotického genomu
3. Posttranskripční úpravy RNA a
mechanizmy sestřihu
Transkripce (přepis) genetické informace z DNA do RNA
Hlavní zdroje:
S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie 1-4
Masarykova Universita Brno
ISBN 80-902562
B. Staveley, Principles of Cell Biology
Memorial University of Newfoundland
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/CBhome.html
M. Muller, Biology of Cells and Organisms
University of Illinios, Chicago
http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/summer2010/lecturesm10.htm
Wikipedia
Transkripce
Informace z DNA se nepřekládá do proteinu přímo, ale
přes prostředníka - mRNA (messenger; mediátorová)
Část první: Bakteriální transkripce
Transkripce (přepis) genetické informace z DNA (chromozomové a plazmidové) do RNA pomocí
enzymu RNA-polymerázy
RNA-polymeráza (transkriptáza)
- váže se na promotor
- katalyzuje syntézu dlouhých primárních transkriptů
- u bakterií stejná RNA-polymeráza pro všechny typy RNA
Primární transkripty:
Většinou obsahují přepisy více genů (polygenní/polycistronní).
Na DNA: promotor - geny - terminátor
3 hlavní skupiny RNA
1. mRNA (mediátorová; messenger)
matrice pro syntézu polypeptidů. U bakterií nepodléhá
posttranskripčnímu sestřihu
2. rRNA (ribozomová)
posttranskripčně upravována z pre-rRNA
3. tRNA (transferová)
posttranskripčně upravována z pre-tRNA
Váže se na ni aminokyselina, obsahuje antikodon
B. Staveley, Principles of Cell Biology
Memorial University of Newfoundland
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/CBhome.html
Fáze transkripce
1. Iniciace: Navázání RNA-polymerázy na
promotor a zahájení syntézy
2. Elongace: Připojování nukleozid-5'-monofosfátu
k 3'-konci RNA řetězce podle matricového řetězce
3. Terminace: Zastavení elongace na terminátoru
a uvolnění z matricového řetězce
amolecularmatter.tumblr.com
sigma faktor
Operon:
- Transkripční jednotka, která je spolu s promotorem řízena také operátorem
- Mezi promotorem a startovacím nukleotidem se nachází regulační oblast - OPERÁTOR.
- Na operátor se může vázat regulační protein - REPRESOR. Ten zastavuje transkripci
Operon: transkripční jednotka řízená promotorem a operátorem
Oprerátor: regulační oblast na DNA, na níž se může vázat represor
Transkripční jednotka: oblast na DNA, která se přepisuje do mRNA
Promotor:
Sekvence na DNA před transkripční jednotkou, nasedá na něj RNA-polymeráza
- Podobné u všech transkripčních jednotek, ale ne totožné. Liší se mírou afinity k RNA-polymeráze.
- Silný/slabý promotor - vysoká/nízká frekvence iniciace transkripce
- Silnější promotor se více blíží konvenční sekvenci v místech:
a) kolem nukleotidu -35: 5' TTGACAT 3'
b) Pribnowův box* (-10): 5' TATAAT 3'
T
operátor
*Podobný TATA boxu u eukaryot
Bakteriální RNA-polymeráza
- Rozeznává promotory všech transkripčních jednotek
- Složena z podjednotek (holoenzym):
- 2 α: udržují stabilitu molekuly
- 1 β: umožňuje vazbu ribonukleotidů na polymerázu
- 1 β': umožňuje spojení polymerázy s matricovým DNA řetězcem
- 1 ω (omega) stabilizuje molekulu
- 1 σ (sigma faktor): podmiňuje vazbu RNAP na promotor. Nemá katalytickou funkci, bez ní
polymeráza funguje, ale začíná na libovolném místě
Holoenzym: enzym se všemi kofaktory (podjednotkami) nutnými k jeho funkci; úplný enzym
Apoenzym: enzym, který vyžaduje kofaktory pro svoji funkci, ale nemá je; momentálně nefunkční
1. Iniciace
Navázání RNA-polymerázy (sigma faktoru) na promotorové sekvence -35 (rozpoznávací) a Pribnowův
box (otevírá binární komplex)
a) tvorba "Uzavřeného transkripčního binárního
komplexu" (holoenzym RNA-polymerázy + promotorová
oblast dsDNA) - řetězce dsDNA ještě nejsou rozvinuty
b) RNA-polymeráza v komplexu mění konformaci,
prodlužuje se a pokrývá gen v rozsahu -50 až +20 bp
c) RNA-polymeráza se váže na oba řetězce DNA,
ale pevněji na pozitivní-kódující (přepisuje se podle negativního-templátového)
d) V Pribnowově boxu se uvolňují vazby mezi pozitivním a negativním řetězcem DNA →
otevřený binární komplex
e) Při iniciaci transkripce zůstává RNA-polymeráza na místě, ale od startovacího
nukleotidu (+1) začíná katalyzovat tvorbu nového řetězce RNA (fosfodiesterová
vazba mezi dvěma ribonukleotidy) → první dinukleotid
f) Otevřený transkripční ternární (ze tří částí) komplex = vazba tří molekul
(1. DNA, 2. RNA-polymeráza, 3. RNA)
Latinsky: "binarius" = složený ze 2 částí; "ternarius" = složený ze 3 částí
2. Elongace
Prodlužování RNA
- Katalyzována RNA-polymerázou bez Sigma-faktoru (uvolňuje se po vytvoření počátečního fragmentu
RNA a je nahrazen NusA-proteinem)
- RNA-polymeráza se posunuje po negativním řetězci DNA (40 nukleotidů/sek; 37°C) směrem od 3' →
5'-konci DNA
- cca 18bp dlouhá rozvinutá oblast DNA; hybrid RNA-DNA dlouhý cca 2-5bp
- RNA v hybridní dvojšroubovici se pevněji váže k RNA-polymeráze než k DNA
- Syntéza RNA řetězce směrem od 5' → 3'-konci
- S NusA proteinem dorazí RNA-polymeráza až k terminátoru
Průběh transkripce bakteriálního genomu
3. Terminace
Zastavení pohybu RNA-polymerázy - uvolnění hotové RNA - uvolnění RNA-polymerázy
A) závislá na Rho-faktoru
B) nezávislá na Rho-faktoru
Rho-faktor: protein katalyzující uvolnění dokončeného RNA-řetězce z templátového (negativního) DNA-řetězce
3A) Terminace závislá na Rho-faktoru
Rho-faktor: protein katalyzující uvolnění dokončeného RNA-řetězce z matricového (negativního) DNA-řetězce
- Rho protein aktivní ve formě hexameru
- váže se během transkripce na 5'-konec mRNA a pohybuje se za RNA-polymerázou
- v terminátoru se RNA-polymeráza zastaví, rho-faktor ji dostihne
- Rho-faktor katalyzuje uvolnění mRNA z DNA-řetězce a uvolnění RNA-polymerázy (za spotřeby ATP)
Rho
3B) Terminace nezávislá na Rho-faktoru
- Tvorba vlásenky na RNA, na konci se sekvencí UUUUUU - nestabilní hybrid DNA-RNA → rozpad
- Uvolnění NusA-proteinu
Komplementární sekvence
Jedinečná sekvence
Sekvence UUUUUU
představuje signál pro
uvolnění polymerázy
matricový (negativní) DNA-řetězec
Strukturní geny – mRNA
Překládají se do polypeptidu
- Transkripcí transkripční jednotky obsahující strukturní geny vzniká mRNA
- mezi promotorem (popř. za operátorem) a prvním strukturním genem leží vedoucí sekvence s
Shineovou-Dalgarno sekvencí, která zajišťuje vazbu na ribozom a nepřekládá se.
Shineova-Dalgarno sekvence v mRNA: 5' AGGA 3'
- vazba na ribozom (k 16 S-rRNA podjednotky 30S): 3' UCCU 5'
- pokud primární transkript neobsahuje Shineovu-Dalgrinovu sekvenci, nemůže se vázat k ribozomu a
působí jako funkční RNA
Funkční RNA: RNA, které nejsou určeny k translaci (tRNA, rRNA, miRNA, siRNA)
mRNA se strukturními geny
- Na 5'-konci obsahuje přepis vedoucí sekvence s Shineovou-Dalgarnovou sekvencí, nepřekládá se
- Na 3‘-konci za stop-kodonem obsahuje nepřekládanou sekvenci
- Jeden strukturní gen se překládá do jedné molekuly polypeptidového řetězce
- U prokaryot jsou geny polycistronní (více genů na jednom transkriptu mRNA)
- každý gen na transkriptu obsahuje svůj start a stop kodon a svou Shine-Dalgarno sekvenci pro
vazbu ribozomu
- na DNA mají jeden společný promotor a jednu terminační sekvenci na 3‘-konci. Promotor
není součástí transkripční jednotky.
Shine-Dalgarno sequence
DNA
mRNA
5'
Shine-Dalgarno sequence
3'
Bakteriální mRNA
- posttranskripčně se neupravuje a slouží přímo pro tvorbu polypeptidu
- rozpad během několika minut účinkem ribonukleázy (RNázy) ve směru 5' → 3'
- translace molekuly mRNA na ribozomu probíhá současně s její transkripcí. Polypeptidový řetězec se
začne syntetizovat ještě před ukončením transkripce
- rychlosti: 40 nukleotidů za sekundu; 13 aminokyselin za sekundu; až 15 iniciací transkripce za minutu u
jedné transkripční jednotky
- Polyribozom: více ribozomů na jedné mRNA urychluje transkripci
- Spojení transkripce s translací umožňuje efektivní syntézu proteinů (např: 15 molekul mRNA, každá
pokryta 30 ribozomy)
Bakteriální rRNA
- geny pro rRNA na chromozomu v 5-9 kopiích
- každá transkripční jednotka má 2 promotory (P1, P2) a 2 terminátory (T1, T2)
- mezi některými geny jsou vmezeřeny geny pro tRNA
- nejprve přepis do pre-rRNA: sedimentační koeficient 30S
- 30S jsou štěpeny RNázou III na sekvence 5S, 16S a 23S
Jednotka S (Svedberg) - sedimentační koeficient
(veličina udává čas, za který proběhne sedimentace dané makromolekuly při její ultracentrifugaci)
30S
Bakteriální tRNA
- u E coli 2 multigenní transkripční jednotky s geny pro tRNA
- jen jeden promotor, poslední gen je strukturní (např. pro elongační faktor EF-Tu)
- strukturní gen umožňuje vazbu na ribozom, protože obsahuje Shineovu-Dalgarnovu sekvenci
CRISPR (Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats)
- adaptivní (získaná) imunita bakterií - obrana cizímu genetickému materiálu (např. virální DNA)
- segment prokaryotické DNA se "spacer DNA" obsahujícími části DNA virů z předešlých infekcí
- při nové infekci je třeba vytvořit novou "spacer DNA"
- Transkripce do crRNA (CRISPR RNA), komplementární s virovou DNA, spolu s CAS (crispr-associated)
proteiny
- crRNA s CAS proteiny tvoří "interference komplexy"
- párování s odpovídající sekvencí virové DNA a její inaktivace
spacer DNA
interference complex
CRISPR-Cas9
Velké uplatnění v editaci lidského genomu: vhodná guide RNA + Cas9 protein štěpí DNA ve zvoleném místě
(inaktivace nebo vložení jiné sekvence)
CRISPR-Cas9: a Bacterial Immune System Repurposed as a
Transformative Genome Engineering Technology
by Emmanuelle Charpentier
(Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany)
Professor Charpentier is best known for her role in deciphering the molecular mechanisms of the
bacterial CRISPR/Cas9 immune system and repurposing it into a tool for genome editing. In
collaboration with Jennifer Doudna's laboratory, Charpentier's laboratory showed that Cas9 could be
used to make cuts in any DNA sequence desired
21st March 2019
at 5 PM
Emmanuelle Marie
Charpentier (born 11
December 1968) is a French
professor and researcher
Mendelův refraktář, Mendelovo muzeum
2. Transkripce eukaryotického genomu
Rozlišujeme transkripci jadernou, mitochondriální a chloroplastovou.
Transkripce jaderné složky
- jaderné geny jsou na chromozomech
- tvoří primární transkripty
Typy RNA
1. Kódující RNA
- informace z DNA je přenesena mRNA do ribozomu, kde je přeložena do sekvence
aminokyselin tvořících proteiny
- asi jen 3% všech transkriptů
2. Nekódující RNA
- cca 97% transkriptů
- zejm. introny vystřižené z mRNA, rRNA, tRNA
a regulační RNA
Rozptýlené
repetice
(44%)
Alu
sekvence
(10%)
Tandemové
repetice
(15%)
Jedinečná
nekódující DNA
(15%)
Introny strukturních
a funkčních genů
(24%)
Exony strukturních a funkčních genů (1,5%)
Alu sekvence - transpozonální DNA (schopná měnit pozici), funkce větš. neznámá, hraje roli při buň. dělení
DNA
Polycistronní vs. monocistronní mRNA
Na rozdíl od prokaryot mají eukaryota pouze monocistronní mRNA
Eukaryotická mRNA
- obsahuje kódující sekvenci pouze pro jeden polypeptid (monocistronní)
- jeden iniciační a jeden terminační kodon
Prokaryotická mRNA
- obsahuje kódující sekvenci pro několik genů, většinou jedné metabolické dráhy
- mRNA transkript obsahuje hodně iniciačních a terminačních kodonů
http://www.majordifferences.com/
Typy RNA
1. Kódující RNA
- pre-mRNA: prekurzorová mRNA (též hnRNA - heterogenní jaderná RNA)
- primární transkript obsahující přepisy strukturních genů
- je upravován do mRNA
2. Nekódující RNA
- pre-rRNA: prekurzorová ribozomová RNA
- posttranskripční úpravou se štěpí na a) 5,8S-rRNA, 18S-rRNA a 28S-rRNA u savců
b) 5,8S-rRNA, 16S-rRNA a 25S-rRNA u rostlin
- pre-tRNA: prekurzorová transférová RNA
- štěpí se na různé druhy tRNA
- 5S-rRNA: tvoří se transkripcí genů pro 5S-rRNA
- Malé RNA: Nízkomolekulární stabilní RNA (80-300 nukleotidů)
- řídí sestřih a posttranskripční úpravy pre-RNA (katalyzovány RNA-polymerázami II a III)
a) malé jaderné RNA (snRNA)
b) malé jadérkové RNA (snoRNA)
c) malé cytoplazmatické RNA (scRNA)
d) regulační RNA (miRNA a siRNA)
snRNA se účastní sestřihu pre-mRNA ve spliceazomu
Transkripční faktory (TF)
- regulační proteiny
- vážou se na regulační oblasti promotoru nebo zesilovače (enhancer) transkripce
- nutné pro zahájení transkripce
- působí ve skupině, nasednou na promotor a na ně se váže RNA-polymeráza
Typy TF:
1. Obecné TF: ve většině eukaryot, geny potřebné pro základní funkce všech buněk
2. Speciální TF: vyskytují se v určitých tkáních v určitý čas
Transkripční aktivita = rychlost syntézy RNA: počet primárních transkriptů za minutu
1. Bazální transkripční faktory:
- nízká aktivita, minimální požadavky buňky
- umožňují zahájení transkripce
2. Konstitutivní transkripční faktory:
- zvýšená aktivita
- konstitutivní TF se přidávají k bazálním TF
3. Indukovatelné transkripční faktory:
- úprava transkripční aktivity v reakci na vnější podmínky
- význam při diferenciaci
Eukaryotické DNA-dependentní RNA-polymerázy
Každá má svůj specifický promotor (bakterie jeden typ RNA-polymerázy a jeden typ promotoru)
1. RNA-polymeráza I
- katalyzuje syntézu pre-rRNA
- pouze v jadérku*
2. RNA-polymeráza II
- syntéza mRNA (strukturní geny) a malých RNA
- v jádře
3. RNA-polymeráza III
- syntéza pre-tRNA, 5S-rRNA a malých RNA
- v jádře
*v jadérku se skládají ribozomy z proteinů a rRNA
Promotor pro RNA-polymerázu II obsahuje krátké sekvence
1. TATA-box (též Hognessův box): T A T A A A A
-34 až -26 od startovacího nukleotidu
- vazba TF TFIID - specificky rozeznáván RNA-polymerázou II
2. CAAT-box: G G C C A A T C T
- nukleotidy -75 až -80
- vazba TF CTF/NF1, zvyšuje
sílu promotoru (enhancer)
3. GC-box: G G G C G G
- nukleotid -90
- vazba TF SP1, zvyšuje sílu promotoru (enhancer)
- je fosforylován proteinkinázou vázanou na DNA - stimulace tvorby
přediniciačního komplexu
- umožňuje vazbu TFIID na TATA-box
4. Oktamer: A T T T G C A T
- váže se na konstitutivní TF OCT-1
5. Startovací nukleotid: Iniciátor (Inr-element)
- obvykle A uvnitř úseku s pyrimidinovými bazemi (C nebo T)
Tyto se vyskytují ve většině promotorů RNA-polymerázy II
Iniciace transkripce polymerázou II
- Transkripční faktor TFIIF umožňuje umístnění RNApolymerázy
na promotor (3.)
- Uzavřený transkripční komplex je ještě inaktivní (3.)
- Transkripční komplex je aktivován až TFIIH tak, že
fosforyluje RNA-polymerázu (4, 5)
- Všechny TF kromě TFIID a TFIIA se uvolní a aktivní
RNA-polymeráza elonguje pre-mRNA (hnRNA) (5.)
Význam transkripčních faktorů:
"Umožňují rozeznat místa, kam se má navázat RNApolymeráza
II a aktivují ji."
Pokud promotor nemá TATA-box, začíná transkripce na Inr-elementu
Terminace transkripce polymerázou II
Polyadenylační signál: T T A T T T na negativním
řetězci DNA
- do pre-mRNA přepsán jako A A U A A A
- označuje terminaci transkripce
- sekvence je rozeznána endonukleázou - štěpí 10-30
nukleotidů za signálem
- poly(A)-polymeráza katalyzuje polyadenylaci 3'-konce
- helikáza rozdělí zbytek hybridní DNA-RNA a zbytková
RNA je rozštěpena exonukleázou
Exonukleáza: štěpí nukleotidy od krajů
Endonukleáza: štěpí nukleotidy od prostředku
Helikáza: oddaluje řetězce DNA nebo RNA
Video: Eukaryotická transkripce
RNA polymeráza nasedá na TATA box
UTR - untranslated region
Eukaryotické mRNA jsou monocistronní - obsahují kodující sekvenci pouze pro jeden polypeptid
Translace:
- začíná na mRNA na "sekvenci Kozakové" CAAAAUG (což na DNA odpovídá sekvenci TAC)
- končí na mRNA na stop kodonech UAG (Amber), UGA (Opal), UAA(Ochre) - na DNA odpovídá (ATC, ACT, ATT)
www.fatespace.com
Regulační RNA
- krátké molekuly RNA se sekvencí komplementární k určitým částem mRNA nebo DNA
- působí mechanismem RNA interference (RNAi)
- typicky inhibují genovou expresi vazbou na mRNA
- 2006 Nobelova cena za fyziologii a medicínu pro A. Fire a C. Mello za výzkum RNAi
- epigenetická posttranskripční regulace exprese a též obrana buněk proti parazitickým
nukleotidovým sekvencím (např. RNA virům)
- hrají roli též ve vývoji
- s tzv. Argonaute proteiny tvoří komplex zvaný RISC (RNA-induced silencing complex)
- využívána ve výzkumu pro supresi exprese specifických genů
1. miRNA (microRNA; 22 nukleotidů)
- endogenní původ, transkripcí genomové DNA
2. siRNA (small inhibitory RNA; 20-25 nukleotidů)
- exogenní původ (např. virový)
siRNA a miRNA jsou si velmi podobné
Epigenetická regulace genové exprese
1. miRNA (microRNA; 21-22 nukleotidů)
- vlásenka pri-miRNA je štěpena RNAázou
"Drosha" na pre-miRNA (70 nukleotidů)
- export pre-miRNA do cytoplasmy - štěpení
Dicerem na miRNA 21-22 nukleotidů
- spolu s proteiny tvoří tzv. miRISC (miRNAinduced
silencing complex)
1. miRNA (microRNA; 21-22 nukleotidů)
- Funkce: RNA silencing a posttranskripční regulace genové exprese
- párování s komplementárními sekvencemi mRNA (nemusí být 100% komplementární)
- mechanismy silencingu:
a) štěpení řetězce mRNA na dva kusy (endonukleázami)
b) destabilizace mRNA zkracením poly(A) konce (dřívější degradace exonukleázami)
c) snížení účinnosti translace do proteinu na ribozomu (fyzicky blokuje)
- vyskytuje se nejprve ve formě shRNA (short hairpin RNA) - štěpena enzymem zvaným "Dicer"
- lidský genom kóduje přes 1000 miRNAs - evolučně konzervované
2. siRNA (small inhibitory RNA; 20-25 nukleotidů)
- Funkce: posttranskripční RNA silencing
- dvojřetězec (štěpena také enzymem Dicerem)
- exogenní původ
- spolu s proteiny tvoří tzv. siRISC (siRNA-induced
silencing complex)
- jeden řetězec degradován
- vazba siRISC na cílovou mRNA
- při 100% párování s cílovou sekvencí se mRNA štěpí
3. Posttranskripční úpravy RNA a mechanizmy sestřihu
Posttranskripční úpravy
Primární transkripty jsou dlouhé molekuly a musí být zkráceny, aby mohly být transportovány z jádra
do cytoplasmy
a) modifikace, které neovlivňují primární strukturu
- tvorba komplexů jaderné pre-mRNA s proteiny
- úprava 5'-konce pre-mRNA tzv. čepičkou
- polyadenylace 3'-konce pre-mRNA
b) úprava primární struktury (sestřih; editace; vystřižení intronů)
Intron (intragenic region): nekódující sekvence RNA uvnitř genu, která je vystřižena
Exon (expressed regions): kódující sekvence RNA, přeložená do proteinů
Modifikace, které neovlivňují primární strukturu
Tvorba komplexů jaderné pre-mRNA s proteiny
- proteiny, které se vážou na pre-mRNA se označují RNP-proteiny
- komplex RNA s RNP-proteiny nazýváme spliceozom
Funkce: RNA-proteiny uvádějí RNA do stavu přístupného k posttranskripčním úpravám
Úprava 5'-konce čepičkou
- čepička: m7G
- 7-metylguanozin se váže na mRNA ve směru 5' - 5'
Funkce: čepička váže proteiny nezbytné pro iniciaci translace
7-Methylguanosine
hnRNA (heterogenous nuclear RNA) je synonymum pro pre-mRNA
RNP - ribonucleoprotein
Modifikace, které neovlivňují primární strukturu
Polyadenylace 3'-konce
- K polyadenylačním signálu AAUAAA na 3'-konci pre-RNA se připojí sekvence 50 - 250 nukleotidů (A)
- katalyzována poly(A)-polymerázou
Funkce: ochrana proti účinku exonukleáz (dýl trvá než se dostanou přes AAAA ke kódující sekvenci)
Video: m7G a polyadenylace
Sestřih pre-mRNA (hnRNA) → mRNA
- Úprava primární struktury RNA
Intron (intragenic region): nekódující sekvence RNA uvnitř genu, která je vystřižena
Exon (expressed regions): kódující sekvence RNA, přeložená do proteinů
Sestřih pre-mRNA → mRNA
Objev intronů:
- při hybridizaci DNA s mRNA pod elektronovým mikroskopem
- určité části na DNA přebývaly (introny)
- tvorba smyček DNA (na obr. A až F)
Intron (intragenic region): nekódující sekvence RNA uvnitř genu, která je vystřižena
Exon (expressed regions): kódující sekvence RNA, přeložená do proteinů
Konstitutivní vs. alternativní sestřih
a) Konstitutivní: po sestřihu vždy stejná molekula mRNA → stejný protein
b) Alternativní: vzniká více druhů molekul mRNA → různé izoformy proteinů
- regulace exprese
- regulace poměrů izoforem
Intron (intragenic region): nekódující sekvence RNA uvnitř genu, která je vystřižena
Exon (expressed regions): kódující sekvence RNA, přeložená do proteinů
- konstitutivní exon: při všech posttranskripčních úpravách působí jako exon
- potenciální exon: při některých posttranskripčních úpravách působí jako exon, jindy jako intron
Izoformy proteinů: funkčně příbuzné proteiny, liší se v primární struktuře
Alternativní sestřih
potenciální exon
potenciální exony
13 variant alternativního sestřihu u genu SYNGAP1
22 exonů (písmeny označeny exonové jednotky)
˄ intron
. spojení dvou exonových jednotek
Mechanismus sestřihu mRNA
- Úprava primární struktury mRNA - pouze za účasti spliceozomu
- Proces řídí snRNP částice (komplex snRNA- a proteinů) - tvoří spliceozom
- primární struktura intronu určuje místo sestřihu: GU-AG
- Intron: 5'-konec GU; 3'-konec AG; uprostřed místo větvení A
- Vlastní sestřih probíhá pomocí chemické reakce: Transesterifikace
Transesterifikace v sestřihu pre-mRNA → mRNA
- přeměna fosfátového esteru v jiný bez hydrolýzy za nepřítomnosti ATP nebo GTP
- energie fosfodiesterové vazby zůstává zachována
Estery: organické sloučeniny, ve kterých je -OH skupina nahrazena organickým zbytkem vzniklým z alkoholu po odštěpení
vodíku.
Esterifikace: chemická reakce, při které ester vzniká
Nukleové kyseliny jsou polymery: vlákno nukleotidů navzájem spojených fosfodiesterovou vazbou. Dusíkatá báze (A, T/U,
C, G) + cukr – pentoza (ribóza/deoxyribóza) + fosfát (mono- v řetězci, tri- volně)
Nucleosid (cytidin)
Cytidin monofosfát (CMP)
Cytidin trifosfát (CTP)
β-N- glykosidová
vazba
Fosfodiesterová
vazba
-
-
První transesterifikace:
- spojení exonu1 a intronu přes OH-
skupiny
- odpad z vazby (H2O) je použit na
zakončení 3'-konce exonu 1 (OH) a
zakončení 5'-konce intronu (H)
Druhá transesterifikace:
- spojení obou exonů do výsledné mRNA
- intron se odpojí ve formě lasovité RNA
Sekvence pro transesterifikaci jsou
rozeznávány snRNP-částicemi a tvoří
komplexy katalyzující sestřih - Spliceozom
Transesterifikace v sestřihu pre-RNA → mRNA
OH
H
Spliceozom
- velká elipsoidní částice, sedimentační koeficient 60S
- uvnitř jádra
- funkce: odstraňuje introny z pre-mRNA (katalyzuje sestřih
mRNA)
- tvořen komplexem 5 snRNA (U1, U2, U4, U5, U6) a různými
proteiny
- složitostí podobný ribozomům, pozorovatelný elektronovým
mikroskopem
Lariat - laso
Spliceozom
Video: mRNA sestřih (splicing)
mRNA je výsledkem spojení exonů na stejné molekule primárního transkriptu (výjimečně
dvou různých molekul - bimolekulární sestřih)
Posttranskripční úpravy pre-rRNA
- transkripce RNA polymerázou I
- pre-rRNA obsahuje přepisy genů pro 5,8S, 18S a 28S rRNA
- geny jsou lokalizovány v DNA jadérka, kde probíhá též jejich transkripce do pre-rRNA
- introny jsou vyštěpeny, ale exony se nespojují
- štěpení pomocí endonukleáz
- 3 jednotky rRNA jsou využity ke stavbě ribozomů spolu s ribozomovými proteiny
Posttranskripční úpravy pre-tRNA
jednotlivé tRNA uskutečňují přenos jednotlivých aminokyselin
1. Odstranění vedoucí sekvence na
5'-konci
2. nahrazení dvou nukleotidů na 3'konci
sekvencí CCA (tam se připojí
AMK)
3. chemická modifikace vybraných
bazí → tvorba "neobvyklých bazí"*
4. vystřižení intronů
*neobvyklé báze zpřesňují syntézu proteinů (4-thiouridin, dihydrouridin, 1-methylguanozin...)
Posttranskripční úpravy genoforu mitochondrií
- nepodléhají úpravě 5'-konce čepičkou
- začínají vedoucím kodonem AUG
- nejdůležitější úpravou je polyadenylace
Editace RNA
- probíhá v mitochondriích trypanzom, vyšších rostlin a v genu pro apolipoprotein savců
- cílena inzerce, delece nebo substituce nukleotidu mRNA s cílem pozměnit výsledný protein
- Kryptogen: strukturní gen s možností editace mRNA
- proces regulován tzv. gRNA (guide RNA)
Zajímavosti o RNA
- většina molekul mRNA rychle degraduje
- bakteriální mRNA má poločas rozpadu v řádu minut
- eukaryotická mRNA má poločas rozpadu v řádu hodin až dní
- tRNA a rRNA jsou stabilnější než mRNA
- transkripce umožňuje amplifikaci genetické informace díky množství kopií mRNA