Molekulární biologie pro informatiky - 9 Regulace buněčného cyklu 2001 - Nobelova cena za objevy v oblasti buněčného cyklu Leland Hartwell - specifické geny řídící buněčný cyklus - pojem kontrolní body buněčného cyklu Paul Nurse - cyklin-depenentní kinázy - evoluční konzervativnost Timothy Hunt - cykliny - degradace během buněčného cyklu Historie objevů buněčného cyklu „When a cell arises, there must be a previous cell, just as animals can only arise from animals and plant from plants.“ Rudolph Virchow, 1858 http://image.slidesharecdn.com/nobel-2014-141228232251-conversion-gate01/95/nobel-prize-in-physiolo gy-or-medicine-ideas-changing-the-world-2014-49-638.jpg?cb=1419809059 https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/8/8a/Rudolf_Virchow_NLM4.jpg/800px-Rudolf_Virc how_NLM4.jpg http://image.slidesharecdn.com/nobel-2014-141228232251-conversion-gate01/95/nobel-prize-in-physiolo gy-or-medicine-ideas-changing-the-world-2014-49-638.jpg?cb=1419809059 http://image.slidesharecdn.com/nobel-2014-141228232251-conversion-gate01/95/nobel-prize-in-physiolo gy-or-medicine-ideas-changing-the-world-2014-49-638.jpg?cb=1419809059 „Omnis cellula e cellula.“ http://www.slideshare.net/SaifulAlom/nobel-2014-43059120 https://en.wikipedia.org/wiki/Rudolf_Virchow#/media/File:Rudolf_Virchow_NLM4.jpg Dělení buněk Prokaryota •příčné dělení buněk Eukaryota •dělení buněk nezbytné pro - růst organizmu - náhradu poškozených a starých buněk - šíření genetické informace: mitóza, meióza https://uchicagomed.files.wordpress.com/2015/05/de-mitosis-lg.jpg http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap01/cell-1.gif •před rozdělením se buňka musí zvětšit, zduplikovat chromozomy a přesně je rozdělit do dceřiných buněk •koordinace procesů v rámci buněčného cyklu •dělení buněk je přísně řízeno •abnormální vývoj může být příčinou nádorů http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap01/week01.html http://sciencelife.uchospitals.edu/2015/05/22/cutting-through-a-cell-division-mystery/ Buněčný cyklus Interfáze •růst buňky, duplikace organel, zvýšený metabolismus G1 syntéza RNA a proteinů příprava na syntézu DNA (replikační proteiny, histony) S syntéza DNA, duplikace chromozomů G2 pokračuje syntéza RNA a proteinů příprava na M fázi (mitotické vřeténko) http://gaskinsanatomy.wikispaces.com/file/view/CellCycle_L.jpg/252096666/CellCycle_L.jpg M fáze •mitóza, cytokineze •kondenzace chromatinu •rozpad jaderné membrány •tvorba vřeténka a kinetochorů •separace chromatid •rozpad vřeténka •dekondenzace chromatinu •tvorba membrány, rozdělení buňky Kondenzující chromozomy Centromera Sesterské chromatidy Mitotické vřeténko Separace sesterských chromatid Tvorba dceřiných buněk MITÓZA CYTOKINEZE http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html http://www.bio.utexas.edu/faculty/sjasper/bio212/mitosis.html Buněčný cyklus Syntéza DNA během buněčného cyklu •DNA se replikuje před vlastním rozdělením buňky •duplikace chromozomů • buňka v G2 fázi má 2x vyšší obsah DNA než v G1 fázi •kopie chromozomů jsou spojeny v oblasti centromery •sesterské chromatidy, které se při dělení jádra oddělují Sesterské chromatidy Syntéza proteinů a RNA během buněčného cyklu •stejně rychlá během interfáze •v M fázi klesá syntéza proteinů a zastavuje se syntéza RNA •histony se tvoří pouze v G1 a S fázi http://genes.atspace.org/Figs/G791.gif sphweb.bumc.bu.edu http://genes.atspace.org/27.1.html Buněčný cyklus Časové nároky buněčného cyklu •buňky bez schopnosti se dělit (neurony, svalové b., červené krvinky) •buňky dělící jen za určitých podmínek (jaterní buňky, lymfocyty) •rychle se dělící buňky (epiteliální, krevní kmenové buňky) •většinu doby zabírá interfáze •proliferující lidská buňka má cca 22 hodinový cyklus •kvasinky 1,5 - 3 hod, střevní epitel 12 hod, savčí fibroblasty v kultuře 20 hod, savčí játra cca 1 rok •klidová fáze G0 Bod restrikce •v pozdní G1 fázi •na přechod z G1 do S je potřeba mimobuněčný signál •bez tohoto signálu buňka cyklus opustí a vstoupí do G0 Bod restrikce Růstové faktory http://clinicalgate.com/wp-content/uploads/2015/02/B9781416022558500541_gr2.jpg http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html http://clinicalgate.com/introduction-to-the-cell-cycle/#cetextbox3 G1 fáze •první růstová fáze, dosažení původní velikosti buňky mateřské •u raných embryí chybí fáze G1 a G2, buňka se dělí a zmenšuje •tvorba cytoplazmy a nových organel, syntéza RNA a strukturních i regulačních proteinů •příprava na S fázi (syntéza replikační proteiny a histony) •v optimálních podmínkách 9 - 11 hod http://gaskinsanatomy.wikispaces.com/file/view/CellCycle_L.jpg/252096666/CellCycle_L.jpg •genetický materiál ve formě dekondenzovaného chromatinu, 2n molekul DNA (46 u lidí) •1. kontrolní bod buněčného cyklu (vnější faktory) i) vstup do G0 fáze: absence růstových faktorů, senescence, diferencované buňky ii) vstup do S fáze: přítomnost růstových faktorů 2 buňky 4 buňky 5 buněk 6 buněk 8 buněk 10 buněk •u raných embryí chybí fáze G1 a G2, buňka se dělí a zmenšuje http://unexpected-grace.blogspot.cz/2013/06/day-3-update.html S fáze •semikonzervativní replikace DNA •v místech ori založeny obousměrné replikační vidlice •syntéza DNA vyžaduje templátový DNA řetězec a RNA primer •vedoucí řetězec, opožďující se řetězec (Okazakiho fragmenty) •telomeráza zajišťuje replikace konců lineárních chromozomů http://gaskinsanatomy.wikispaces.com/file/view/CellCycle_L.jpg/252096666/CellCycle_L.jpg Směr pohybu replikační vidlice Místo spoje fragmentů Opožďující se řetězec Okazakiho fragment RNA-primer Vedoucí DNA řetězec http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/telom02.jpg http://hope4katy.com/wp-content/uploads/2010/03/shutterstock_1221071.jpg •správnost replikace - přesnost a proofreadingová aktivita DNA polymerázy - oprava chybného párování bází •zdvojení genetického materiálu, chromozomy složené ze sesterských chromatid G2 fáze •druhá růstová fáze •příprava na M fázi - proteiny mitotického vřeténka, duplikace centriolu •2 x 2n molekul DNA, dekondenzovaný chromatin •2. kontrolní bod buněčného cyklu (celistvost DNA, správnost replikace) Centriola •párová organela, samostatné dělení •devět trojic mikrotubulů, centrální dutina •duplikace v S a G2 fázi •spolu se svým okolím tvoří centrozom, který organizuje mitotické vřeténko http://gaskinsanatomy.wikispaces.com/file/view/CellCycle_L.jpg/252096666/CellCycle_L.jpg Triplet mikrotubulů Spojovací vlákna Příčný řez centriolou Uvolnění centriol M / brzká G1 S G2 Mitóza Centrozm Duplikace a elongace Zrání a separace http://www.nature.com/nrm/journal/v8/n6/fig_tab/nrm2180_F2.html http://novazeme.ning.com/forum/topics/tajemstv-skryt-ho-v-dom?xg_source=activity http://www.osel.cz/8311-jsou-centrioly-nositelkami-informace.html M fáze •dělení jádra (mitóza, karyokineze) a cytoplazmy (cytokineze) http://gaskinsanatomy.wikispaces.com/file/view/CellCycle_L.jpg/252096666/CellCycle_L.jpg http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision_files/image010.jpg D:\Hema\2007\uDec\z12th\slides\images\nrm2310-f2.jpg http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision_files/image010.jpg 1) Profáze •kondenzace chromozomů •posun centrozomů na opačné strany buňky •v centrozomech zahájena tvorba mitotického vřeténka 2) Prometafáze (pozdní profáze) •tvorba kinetochorů (proteinový komplex) - vazba chromozomů na mikrotubuly vřeténka - vnitřní vrstva váže DNA - prostřední vrstva - vnější vrstva váže (+) konce mikrotubulů http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision.htm http://www.nature.com/nrm/journal/v9/n1/fig_tab/nrm2310_F2.html 2) Prometafáze (pozdní profáze) •rozpad jaderné membrány a jadérka •ustálení centrozomů na opačných stranách buňky •pohyb chromozómů do středu buňky •mitotické vřeténko - kinetochorové mikrotubuly: připojeny ke kinetochorům - polární mikrotubuly: připojeny k tubulům z opačného pólu vřeténka - astrální mikrotubuly: připojeny k proteinům plazmatické membrány M fáze http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision_files/image010.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/25/Kinetochore.jpg Centrozom Kinetochorové mikrotubuly Polární mikrotubuly Astrální mikrotubuly Dynamika tubulinových podjednotek https://en.wikipedia.org/wiki/Spindle_apparatus#/media/File:Kinetochore.jpg http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision.htm http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html M fáze 3) Metafáze •seřazení chromozomů v ekvatoriální rovině mezi póly vřeténka (metafázní destička) •sesterské chromatidy každého chromozomu připojeny k opačným pólům vřeténka •karyotyp z buněk zastavených v metafází (kolchicin) http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision_files/image012.jpg Klasický karyogram Spektrální karyogram Metafázní chromozomy G1 chromozomy http://electronicimaging.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=1100191 https://en.wikipedia.org/wiki/Karyotype#/media/File:Sky_spectral_karyotype.png M fáze 4) Anafáze •separace sesterských chromatid •pohyb chromatid k pólům vřeténka •u každého pólu vřeténka shromážděna stejná sada genetické informace, základ dceřiných buněk http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision_files/image013.jpg http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/19_27.jpg 5) Telofáze •příprava na cytokinezi •chromozomy začínají dekondenzovat •rozpad kinetochorů, rozpad mitotického vřeténka, tvorba jadérka •obnova jaderné membrány http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision_files/image013.jpg http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision_files/image013.jpg Pohyb chromozomů k pólům vřeténka Vzdalování pólů vřeténka http://facweb.bhc.edu/academics/science/robertsk/biol100/celldivision.htm http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html http://www.fisio.cinvestav.mx/posgrado/biologia-celular/lodish/ch21/figure-21-20.jpg Jaderná membrána během M fáze G2 Profáze Metafáze Kondenzace chromatinu Rozklad jaderných pórů a jaderné laminy Tvorba ER s proteiny jaderné membrány Fragmentace jaderné membrány Brzká anafáze Pozdní anafáze Telofáze Tvorba jaderné membrány Sestavování jaderných pórů a příprava laminů Dokončení jaderných pórů Sestavení jaderné laminy Nuclear Pore Complexes (NPCs) are large multi-protein complexes that form aqueous channels bridging the cytoplasm and nucleus of all eukaryotic cells. http://www.nature.com/nrm/journal/v10/n3/full/nrm2641.html Cytokineze •rozdělení cytoplazmy po rozdělení chromozomů k opačným pólům vřeténka •vznik dvou identických dceřiných buněk •výjimečně replikace a dělení jádra bez cytokineze (endocykly) - např. brzká vývojová stádia D. melanogaster Živočišná buňka •kontraktilní prstenec z aktinových filament tvoří dělící rýhu Rostlinná buňka •buněčná destička mezi dceřinými buňkami Emil Heitz Živočišná buňka Kontraktilní prstenec Dceřiné buňky Dělící rýha Rostlinná buňka Dceřiné buňky Původní buněčná stěna Tvorba buněčné destičky http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html; http://america.pink/emil-heitz_1423728.html; http://slideplayer.com/slide/6821210/ Meióza Nepohlavní rozmnožování •vznik dvou identických dceřiných buněk •např. mitóza, binární dělení Pohlavní rozmnožování •spojení dvou buněk za vzniku nové buňky (zygota) je odlišné od těch původních Meióza (redukční dělení) •vznik gamet (vajíčka, spermie) •interfáze s replikací chromozómů, dvě meiotická dělení •původní buňka je diploidní (2n), vznik čtyř haploidních (n) buněk Diploidní - 2n 92 dsDNA Diploidní - 2n 46 dsDNA Haploidní - n 46 dsDNA Čtyři pohlavní buňky (haploidní, n, 23 dsDNA) Pár homologních chromozomů Sesterské chromtaidy Replikace DNA Meióza I Meióza II Spermatogeneze Spermatidy (haploidní) Spermie (haploidní) Spermatogonium (diploidní) Oogeneze Polární tělíska (haploidní) Oocyt (haploidní) Oogonium (diploidní) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-20/CB20.html Meióza I - redukční dělení •separace homologních chromozomů s různými alelami genu Profáze I •párování homologních chromozomů, chromozomy spojeny synapsí •crossing-over (homologní rekombinace) - výměna částí chromozomů, zajišťuje genetickou rekombinaci u potomků •kondenzace chromozomů, tvorba dělícího vřeténka, rozpad jaderné membrány Kondenzace duplikovaných chromozomů Jaderná membrána Rozpad jaderné membrány Tvorba bivalentu Chiazma Tvorba synaptonemálního komplexu Zahájení synapse Dokončení synapse crossing-over Rozpad synapse viditelná chiazmata Zrekombinované chromozomy Gen X Homologní chromozomy (stejné geny, různé alely) Sesterské chromatidy (stejné geny, stejné alely) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-20/CB20.html Meióza I - redukční dělení Metafáze I •seřazení párů homologních chromozomů v ekvatoriální rovině Anafáze I •separace homologních chromozomů a jejich pohyb k pólům dělícího vřeténka •sesterské chromatidy zůstávají spojeny v oblasti centromer Telofáze I •rozpad dělícího vřeténka, obnova jaderné membrány •cytokineze dělí buňku na dvě Centrozomy Jaderná membrána Chromatin Chiazmata Vřeténko Tetráda Sesterské chromatidy Kinetochorové mikrotubuly Metafázní destička Centromera s kinetochorem Separace homologních chromozomů Sesterské chromatidy nedotčeny Dělící rýha Dvě haploidní buňky; chromozomy stále zdvojeny Rozchod homologních chromozomů Seřazení tetrád v ekvatoriální rovině Párování homologních chromozomů Výměna segmentů Replikace chromozomů Interfáze Profáze I Metafáze I Anafáze I Telofáze I http://satameiosis.weebly.com/meiosis-slideshow.html Meióza II - separační dělení •separace sesterských chromatid, které obsahují stejnou genetickou informaci Profáze II rozpad jaderné membrány, tvorba dělícího vřeténka Metafáze II seřazení chromozomů v ekvatoriální rovině Anafáze II separace sesterských chromatid a jejich pohyb k opačným pólům vřeténka Telofáze II rozpad dělícího vřeténka, obnova jaderné membrány, cytokineze Gen X Sesterské chromatidy (stejné geny, stejné alely) Telofáze I Profáze II Metafáze II Anafáze II Telofáze II Dělící rýha Dvě haploidní buňky; chromozomy stále zdvojeny Během meiózy II dochází ke konečné separaci sesterských chromatid. Vznikají čtyři haploidní dceřiné buňky, které obsahují jednu kopii každého chromozomu. Sesterské chromatidy http://satameiosis.weebly.com/meiosis-slideshow.html Mitóza Meióza Replikace DNA Během interfáze, před mitózou Během interfáze, před meiózou, pouze jednou Počet dělení 1 2 Synapse homologních chromozomů Neprobíhá Probíhá spolu s crossing-overem mezi nesesterskými chromatidami během profáze I. Počet dceřiných buněk a jejich genetický obsah Dvě diploidní (2n) dceřiné buňky, genetický identické s rodiči. Čtyři haploidní (n) dceřiné buňky, obsahují polovinu počtu chromozomů rodičovské buňky, genetický odlišné od rodičů i mezi sebou. Úloha v lidském těle Produkce buněk pro růst a opravy organismu. Produkce gamet které zajišťují genetickou rozmanitost při sexuálním rozmnožovaní. Meióza •čtyři haploidní buňky s jednou kopií každého chromozomu •crossing-overem vznikají různé kombinace alel různých genů v rámci chromozomu •meióza je základem pro pohlavní rozmnožování •potomstvo je geneticky odlišné od svých rodičů i sourozenců http://www.zo.utexas.edu/faculty/sjasper/images/f10.10.jpg •genetická rozmanitost pochází z: i) nezávislý výběr chromozomů během meiózy I ii) náhodné oplodnění: náhodné oplození vajíčka spermií iii) crossing-over: nové kombinace alel v rámci chromozomu http://www.zo.utexas.edu/faculty/sjasper/bio301l/division.html Řízení buněčného cyklu •při dělení reagují buňky na svoji velikost a extracelulární signály (přítomnost živin, růstových faktorů, stresových faktorů, poškození DNA) •u savců převládá vliv růstových faktorů a mitogenů Principy řízení buněčného cyklu •mitóza neproběhne před koncem replikace DNA, replikace DNA neproběhne bez rozdělení buňky •poškozená DNA se nesmí replikovat a předat do dceřiných buněk •chybně spárované chromozomy nesmí dokončit mitózu i) posttranslační modifikace proteinů - fosforylace: reverzibilní, proteinkinázy - proteolýza: ireverzibilní, ubikvitinem + proteazom ii) kontrolní body buněčného cyklu Zdravá tkáň: řízený růst buněk Nádor: nekontrolovaný růst buněk http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/control/ Řízení buněčného cyklu - historie Potu Rao, Robert Johnson (1970) •fúze buněk v různých fázích cyklu, vznik heterokaryonu •buněčný cyklus řízen signály v cytoplazmě •řízení cyklu ve dvou místech - G1/S přechod, G2/M přechod S G1 M G1 M M S S S G2 S G2 Cytoplazma buňky v S fázi obsahuje faktory, které indukují syntézu DNA v jádře ve fázi G1 Existuje cytoplazmatický faktor, který indukuje M fázi, a ke kterému je jádro citlivé po celý buněčný cyklus Opětovná syntéza DNA v G2 jádře G2 nenastává. Inhibice opakované replikace je odstraněna mitózou. Yoshio Masui, Clement Markert (1971) •faktor MPF (mitosis-promoting factor), dimer složený z proteinkinázy (CDK) a cyklinu •Xenopus laevis - modelový organismus, velké oocytům African clawed frog Odběr cytoplazmy ze zralého oocytu Injekce cytoplazmy do nezralého oocytu Meióza Zralý oocyt http://csls-text3.c.u-tokyo.ac.jp/active/13_01.html http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html; http://www.slideshare.net/ayesexy/cell-cycle-9451819 Cyklin-dependentní-proteinkinázy (Cdk) •fosforylace specifických proteinů •aktivita regulována i) aktivita v komplexu s cyklinem ii) Tyr fosforylační místa - aktivační, inhibiční - fosforylace specifickými kinázami, defosforylace fosfatázami iii) inhibitory •u člověka 5 enzymů G1 CDK4, CDK2, CDK6 S CDK2 G2 CDK2, CDK1 M CDK1 Faktory zajišťující řízení buněčného cyklu CDK Cyklin Aktivní CDK Aktivační kináza Inaktivační kináza Aktivační fosfatáza http://slideplayer.com/slide/2304039/ Fáze BC Cyklin CDK Funkce G1 D, E CDK4, CDK6, CDK2 Umožňují překonat bod restrikce v pozdní G1 S A, E CDK2 Umožňují zahájit replikaci DNA G2 A CDK2, CDK1 Navádějí buňku k M fázi M B CDK1 Podporují mitotické děje Cykliny •komplexy s Cdk, aktivují Cdk a určují jejich substrátovou specifitu •jejich koncentrace kolísá během fází BC - specifická syntéza / ubikvitinace a proteolýza Faktory zajišťující řízení buněčného cyklu http://d3j7rmlenclvo7.cloudfront.net/content/ppbioscirep/30/4/243/F1.large.jpg •u člověka 4 rodiny http://cnx.org/content/m44466/latest/Figure_10_03_02.jpg Proteazom Ubikvitin CDK Cyklin http://www.bioscirep.org/content/30/4/243 http://tbl.med.yale.edu/cell_growth_control_reading.php https://www.boundless.com/biology/textbooks/boundless-biology-textbook/cell-reproduction-10/control -of-the-cell-cycle-89/regulator-molecules-of-the-cell-cycle Řízení buněčného cyklu - raná G1 Cyklin D - CDK4/6 •cyklin D - senzor mitogenních signálů •aktivace transkripčních faktorů, které zajišťují expresi replikačních proteinů a cyklinu E •sestavení pre-replikačních komplexů v místech ori •odpověď na mitogenní signály př. EGF - EGFR - GEF faktor - Ras protein - MAP kinázy - transkripční faktory - exprese cyklinu D •inhibice antimitogenními signály př. TGFβ - TGFβR - transkripční faktor Smad3, Smad4 - exprese CDK inhibitoru Mitogenní signalizace Receptorová tyrozinproteinkináza GEF faktor Cyklin D Transkripce Jun Fosforylace Antimitogenní signalizace Fosforylace Smad3 Receptorová serin/ threonin kináza Transkripce Cyklin D neaktivuje CDK4 http://tbl.med.yale.edu/cell_growth_control_reading.php Cyklin D - CDK4/6, cyklin E - CDK2 •transkripce cyklinu E řízena transkripčními faktory E2F •Rb protein (pRb) aktivní v nefosforylované formě, inhibován fosforylací •v G0 a G1 inhibuje pRB expresi cyklinu E •po fosforylaci (cyklin D - CDK4/6) se pRb uvolňuje a E2F spouští expresi cyklinu E, cyklinu A a replikačních proteinů •pozitivní zpětná vazba - cyklin E tvoří komplex s CDK2 a dokončuje fosforylaci pRb Řízení buněčného cyklu - přechod G1/S Transkripce cyklinu E Funkce pRB v řízení BC Pozitivní zpětná vazba http://tbl.med.yale.edu/cell_growth_control_reading.php Řízení buněčného cyklu - S fáze Cyklin A - CDK2 •fosforylace složek pre-iniciačního komplexu •výsledkem S fáze je vznik dvou sesterských chromatid každého chromozomu spojených molekulami kohezinu Mitogens Trigger Cell Division S G1 S S S G2 S G2 Cytoplazma buňky v S fázi obsahuje cyklin E - CDK2 a cyklin A - CDK2. Již není třeba mitogenní signál. V jádře G2 buňky neproběhne opakovaná S fáze v důsledku absence pre-iniciačních komplexů. kohezin G1 S M - profáze M - metafáze http://tbl.med.yale.edu/cell_growth_control_reading.php http://genesdev.cshlp.org/content/22/22/3089/F2.expansion.html MPF (mitosis-promoting factor) = cyklin B - CDK1 •koncentrace cyklinu B roste průběžně během celé interfáze •CDK1 - inhibiční fosforylace (Wee1) odstraněna fosfatázou (Cdc25), aktivační fosforylace (CAK) •nárůst aktivity MPF je skokový, při maximální hladině cyklinu B a po odstranění inhibiční fosforylace http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/19_35.jpg Řízení buněčného cyklu - přechod G2/M Cyklin B CDK1 CAK Wee1 Aktivační Inaktivační Inaktivní Cdc25 Aktivní Cdc25 Aktivní MPF Jaderné membrány Jaderný pór Jaderná lamina MPF Laminové dimery MPF fosforyluje cílové proteiny brzké fáze mitózy •kondenzace chromatinu - aktivace kondenzinů •rozpad jaderné membrány - depolymerace laminů •tvorba mitotického vřeténka - aktivace centrozomů http://tbl.med.yale.edu/cell_growth_control_reading.php http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/_14thecellcycle.html http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html Řízení buněčného cyklu - M fáze APC, anaphase-promoting complex •aktivován v pozdní mitóze působením MPF •funguje jen po připojení proteinu Cdc20, ten je blokován proteiny Mad a Bub, které ho uvolňují až po správném připojení kinetochorů všech chromozomů k mikrotubulům vřeténka •připojuje ubikvitin k proteinům, které řídící mitózu i) sekurin •jeho rozklad uvolňuje separázu, která degraduje proteiny spojující sesterské chromatidy ii) cyklin B •inaktivace MPF, konstitutivně aktivní fosfatázy odstraňují fosfátové skupiny z proteinů, které byly fosforylovány MPF, zakončení mitózy, vstup do nové G1 Volný chromozom Chromozom připojený k vřeténku Proteiny Mad a Bub Cdc20 APC Komplex Mad/Bub inhibuje Cdc20 Inaktivní APC Aktivní APC MPF Cdc20 Sekunrin Inaktivní separáza Aktivní separáza Mitotické vřeténko Kohezin Rozštěpený kohezin Ubikvitinace a degradace sekurinu G2 Metafáze Anafáze APC Degradace cyklinu B Vzrůstající koncentrace cyklinu B G2/M přechod https://www.studyblue.com/notes/note/n/adv-cell-bio-chapter-17-exam-iii/deck/8669501 http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html Inhibitory CDK (CKI) Rodina INK4 (INhibitors of Kinase 4) •p16, p15, p18, p19 •inhibují cyklin D - CDK4/6, zástava v G1 Rodina CIP (CDK Inhibitory Proteins) •p21 (cílový gen proteinu p53), p27, p57 •inhibují cyklin D - CDK4/6, cyklin E - CDK2, cyklin A - CDK2, cyklin B - CDK1 Farmakologické inhibitory CDK •deregulace CDK u různých chorob, farmakologické inhibitory blokující ATP vazebné místo CDK •selektivní účinek inhibitorů možno využít pro léčebné účely - nádory, neurodegenerativní choroby (Alzheimerova choroba, ALS, mrtvice) - kardiovaskulární choroby (ateroskleróza, hypertrofie srdce) - virové infekce (HCMV, HIV, HSV, HPV) - parazitická protozoa (malárie, spavá nemoc) aktivní p16 cyklin D CDK4 cyklin D CDK4 p16 chybí aktivní Rb inaktivní Rb aktivní E2F exprese genů S fáze NEPROLIFERUJÍCÍ BUŇKA PROLIFERUJÍCÍ BUŇKA Human cytomegalovirus (HCMV), Herpes simplex virus (HSV) Kontrolní body buněčného cyklu •vnímají vnější i vnitřní podněty a zajišťují správný chod BC •kontrola dokončení předchozí fáze a splnění podmínek pro fázi následující https://adapaproject.org/images/biobook_images/Checkpoints1.jpg Kontrolní bod G1 - bod restrikce •vnější faktory - živiny, mitogeny, antiproliferační faktory •po jeho překonání mohou BC zastavit už jen vnitřní faktory - celistvost DNA - velikost buňky (kvasinky) Kontrolní bod G2 •dokončení replikace DNA •celistvost DNA •velikost buňky (kvasinky) Kontrolní bod M •přechod metafáze-anafáze •správné připojení chromozomů k mitotickému vřeténku https://sharonap-cellrepro-p2.wikispaces.com/The+Cell+Cycle https://adapaproject.org/bbk_temp/tiki-index.php?page=Leaf%3A+What+happens+at+each+of+the+cell+cycl e+checkpoints%3F Kontrolní body buněčného cyklu Vnější podněty - chemické •živiny, signály pro růst, dělení a přežití i) mitogeny - stimulují dělení buněk, přechod G1/S ii) růstové faktory - stimulují růst buněk, syntézu makromolekul iii) faktory pro přežívání - potlačují apoptózu Vnější podněty - fyzikální •prostor a povrch pro adherenci Účinky PDGF na fibroblasty pojivové tkáně Fragmentace pojivové tkáně Degradace ECM Zisk fibroblastů Umístění buněk do kultivačních nádob Bez PDGF Přídavek PDGF Normální buňka Nádorová buňka Závislost na povrchu pro adherenci Inhibice růstu nedostatkem prostoru http://www.slideshare.net/msarwa/the-cell-cycle-15819946 https://www.studyblue.com/notes/note/n/ch-12-mitosis-lecture/deck/6936213 Kontrolní body buněčného cyklu Vnitřní podněty •celistvost DNA, připojení chromozomů k dělícímu vřeténku Poškození DNA •fyzikální a chemické mutageny, zástava v BC v G1 nebo G2 •opravitelné poškození - zastavení BC do doby opravení DNA x rozsáhlé poškození - apoptóza •nádorové supresory ATM, ATR - rozpoznání poškozené DNA, aktivace CHK1 / CHK2 CHK1, CHK2 - aktivace p53, inhibice Cdc25 p53 - zvýšení hladin CKI Inaktivní Inaktivní Aktivní ds zlom UV poškození apoptźa ds zlom Checkpoint kinase 1 (CHK1) http://www.nature.com/nrm/journal/v8/n8/fig_tab/nrm2227_F4.html http://www.nature.com/nrg/journal/v2/n3/fig_tab/nrg0301_196a_F2.html Kontrolní body buněčného cyklu p53 •nádorový supresor •nízká hladina, průběžná degradace, Mdm2 zajišťuje transport p53 z jádra k proteazomu •stabilizován ve stresových situacích (poškození DNA) •působí jako transkripční faktor, indukuje - zastavení BC: exprese p21/CIP - zastavení replikace DNA: inaktivace DNA polymerázy δ - zastavení mitózy: inaktivuje cdc25 - apoptózu: exprese Bax, Puma http://www.medicalrealm.net/uploads/1/2/7/3/12737542/434658_orig.jpg Deficit p53 •průchod BC s poškozenou DNA •Li-Fraumeniho syndrom - dědičný syndrom, inaktivační mutací p53 - zvýšené riziko vzniku nádoru (sarkomy, nádory mozku, prsu,…) - 50 % riziko nádoru do 40 let věku, 90% do 60 let věku CHK1, CHK2 Poškozená DNA Aktivace Aktivace Degradace Inhibice CKI Cyklin - CDK Nedochází k fosforylaci pRb Nedochází k inhibici apoptózy Inhibice ZASTAVENÍ BC APOPTÓZA http://www.medicalrealm.net/what-is-genetic-disorder---li-fraumeni-syndrome.html http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html Kontrolní body buněčného cyklu Kontrolní bod dělícího vřeténka •vstup do anafáze, připojení chromozomů na kinetochorové mikrotubuly dělícího vřeténka •poškození tohoto kontrolního mechanismu vede k poškození a nondisjunkci chromozomů http://www.nature.com/onc/journal/v23/n11/images/1207374f1.jpg i) kontrolní bod zapnut •nepřipojené kinetochory aktivují Mad a Bub •komplex APC-Cdc20 v inaktivním stavu ii) kontrolní bod vypnut •správná vazba chromozomů na kinetochorové mikrotubuly vyvolává v chromozomech mechanické napětí • netvoří se komplex Mad-Bub •komplex APC-Cdc20 degraduje sekurin http://www.nature.com/onc/journal/v23/n11/fig_tab/1207374f1.html Faktory ovlivňující průchod BC •mitogeny - exprese cyklinu D •antimitogení, diferenciační faktory - exprese CKI •stárnutí buňky - exprese CKI •poškození DNA - zástava BC přes p53 •virové infekce (např. HPV, lidský papilomavirus) - inhibice p53 a pRb Poškození DNA Senescence Diferenciace Mitogeny http://www.nature.com/nrc/journal/v11/n1/full/nrc2982.html Poruchy řízení buněčného cyklu Nádorová onemocnění •nádorové buňky nepotřebují k dělení růstové faktory •zvýšená proliferace buňky podpoří její transformaci do buňky nádorové •nádor je v podstatě selhání kontroly buněčného dělení, nekontrolovatelný růst buněk •protoonkogeny - aktivují proliferaci buněk - při abnormální aktivaci či ztrátě jejich inhibice podpo- rují vznik nádoru - př. růstové faktory, cykliny, CDK, E2F, Mdm2, Ras •nádorové supresory - potlačují dělení buněk - inaktivace či zvýšená inhibice podporuje vznik nádoru - př. pRb, p53, p21, p14, p16, TGF-β, ATM Protoonkogen Mutovaný protoonkogen - onkogen Normální růst buněk Ztráta kontroly růstu Normální růst buněk Normální růst buněk Ztráta kontroly růstu Normální růst buněk Mutovaný nádorový supresor Mutované obě alely genu https://www.quora.com/How-does-the-cell-cycle-play-a-role-in-cancer Poruchy řízení buněčného cyklu Početní změny chromozomů (aneuploidie) •normální karyotyp 46, XX(Y) monozomie - např. 45, X trizomie - např. 47, XY +21 •chyby v kontrolním bodu dělícího vřeténka i) chyby v mitóze •opoždění chromozomu v anafázi a jeho nezačlenění do dceřiného jádra •vnik mozaicismu ii) chyby v meióze •nondisjunkce - vznik nulizomické / trizomické gamety, monozomie/trizomie po oplození •opoždění chromozomu v anafázi: vnik nulizomické gamety Opoždění chromozomu v anafázi BC Nondisjunkce chromozomů v meióze n+1 n+1 n-1 n-1 n+1 n-1 n n http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html http://www.nature.com/onc/journal/v32/n39/fig_tab/onc2012615f2.html http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/19_41.jpg G2/M přechod Bod restrikce Přechod metafáze - - anafáze Odbouraný mitotický cyklin Odbouraný G1 cyklin APC Aktivní mitotický komplex cyklin-CDK Aktivní G1 komplex cyklin-CDK Cyklin E/A - CDK2 Cyklin A - CDK2 Cyklin A/B - CDK1 Vstup do S fáze Cyklin D - CDK4/6 ATM/R p53 p21 Poškozená DNA Poškozená DNA ATM/R p53 p21 Cdc25A p21 Poškozená DNA Vstup do M fáze ATM/R p53 p21 Cdc25C CHK1 ATR Poškozená DNA Nezreplikovaná DNA Mad2 Kontrola připojení chromozomů k dělícímu vřeténku Mitogeny p53 p21 Cdc25A p21 ATM/R http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html Otázky k procvičení Kolik buněk vzniká z jedné buňky, která podstoupí meiózu? Do jakých dvou hlavních fází se rozděluje buněčný cyklus? Jaké buňky se množí pomocí mitózy? Jaký typ mikrotubulů je zodpovědný za vazbu chromozomů během M fáze BC? Jak se nazývá fáze buněčného cyklu, při které se buňka fyzicky rozdělí na dvě? Jaká struktura zastává při mitóze funkci obdobnou chiasmatům při meióze? Vstup do jaké fáze buněčného cyklu signalizuje aktivní komplex MPF? Ke vstupu do jaké fáze buněčného cyklu vede degradace G1 fázových cyklinů? Rozpad jaderné membrány odpovídá začátku prometafáze (ANO/NE) Při mitóze jsou jádra dceřiných buněk geneticky shodné s jádrem mateřské buňky (ANO/NE) Během mitotické profáze obsahuje každý chromozom dvě chromatidy (ANO/NE) Homologní chromozomy se párují během mitotické profáze (ANO/NE) Začátek anafáze je inhibován až do seřazení všech chromozomů v ekvatoriální rovině (ANO/NE) Buňky v G0 fázi buněčného cyklu obsahují stejné množství DNA jako ve fázi G2 (ANO/NE) Otázky k procvičení Co je cílem ubikvitnace komplexem APC na začátku anafáze? a)sekurin b)separáza c)kohezin d)tubulin Jaké z následujících tvrzení porovnávajících mitózu a meiózu není pravdivé? a)oba procesy využívají dělící vřeténko z mikrotubulů b)po obou procesech následuje cytokineze c)oba procesy jsou pečlivě regulovány d)v obou procesech probíhá během profáze crossing-over e)oba procesy zahrnují redukci obsahu DNA v dceřiných buňkách Jaké z následujících tvrzení o anafázi buněčného cyklu není pravdivé? a)zmenšuje se vzdálenost mezi kinetochory a póly dělícího vřeténka b)zvětšuje se vzdálenost mezi dvěma sadami dceřiných chromatid c)rozpadají se mikrotubuly dělícího vřeténka d)zvětšuje se vzdálenost mezi oběma póly dělícího vřeténky e)dochází k cyklin-dependentní aktivaci CDK1 http://www.australianscience.com.au/wp-content/uploads/2013/09/hela-spiral-copy.jpg