Molekulární biologie 11. Apoptóza a imunita Osnova 1. Apoptoza 2. Vývoj a aktivace T- a B-lymfocytů 3. Imunoglobuliny, exprese BCR a TCR Hlavní zdroje: S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie 1-4 Masarykova Universita Brno ISBN 80-902562 M. Muller, Biology of Cells and Organisms University of Illinios, Chicago http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/summer2010/lecturesm10.htm Wikipedia Apoptóza programovaná buněčná smrt Apoptóza - koncept apoptózy od 1950 - intenzivně zkoumána od 1990 - poruchy apoptózy hrají roli v různých nemocech, zejm. rakovině Počet článku zkoumajících apoptozu (PubMed) Excesivní apoptóza např. dystrofie Omezená apoptóza např. rakovina https://pixabay.com/static/uploads/photo/2014/04/02/10/18/scales-303434_640.png Dystrofie - degenerace tkáně z důvodu nemoci nebo špatné výživy Apoptóza - buněčná sebevražda - nezbytná pro vývoj a homeostázi organismu - pouze u mnohobuněčných organismů - přísně regulovaný proces (na rozdíl od nekrózy – nefyziologické faktory) - buněčný stres nebo signalizace od jiných buněk stimuluje pro-apoptotické signální dráhy - tyto dráhy kaskádovitě aktivují proteázy zvané "kaspázy„ = efektory apoptózy - apoptotická buňka vykazuje charakteristické změny morfologie Homeostaza - stálost vnitřního prostředí Buněčný stres/ Signalizace pro-apoptotické signální dráhy Kaspázy APOPTOZA http://secondhand-science.com/images/posts/apoptosis/4_apoptosissigns.jpg Charakteristické morfologické znaky apoptózy 1. Blebbing - nepravidelné záhyby cytoplazmatické membrány - smršťování buňky (shrinkage) - vznikají odpojení cytoskeletu od membrány -degradace vnitřní struktury buňky (membrána neztrácí svou integritu) - vznik apoptotických tělísek 2. Fragmentace jádra - Kaspáza 3 aktivuje endogenní endonukleázu - enzym CAD (Caspase-Activated DNase) - štěpí chromatinovou DNA na fragmenty o délce cca 180bp -na elektroforetickém gelu lze pozorovat 180bp fragmenty DNA a jejich násobky (360, 540...) - 180bp je zhruba délka rozestupu histonů na DNA White DNA bands against a dark grey background, resembling the rungs of a ladder http://www.pbs.org/newshour/wp-content/uploads/2015/12/epigenetics.jpg místa štěpení CAD endonukleázou CAD C:\Users\simara\AppData\Local\Microsoft\Windows\Temporary Internet Files\Content.IE5\LVZ06BSO\sad-face[1].jpg C:\Users\simara\AppData\Local\Microsoft\Windows\Temporary Internet Files\Content.IE5\7AG582IT\Wiki_smile[1].gif žebříček Kdy probíhá apoptóza? Příklady: - zánik nadbytečných buněk v prenatálním období (u embrya, u plodu) - orgány se zakládají jako shluky buněk - duté orgány vznikají tak, že vnitřní buňky zaniknou apoptózou (A) - diferenciace lidských prstů (B) -buňka ztratí kontakt s extracelulární matrix, tzv. anoikis (z řečtiny - bezdomovectví) - buňka, která dostává signály smrti - poškození DNA, které již neumí buňka opravit (D) https://www.researchgate.net/profile/Pothana_Saikumar/publication/12732536/figure/fig2/AS:276990692 216833@1443051135407/Figure-2-Examples-of-apoptosis-in-physiology-and-pathology-showing-the-indispe nsable-but.png researchgate.net Apoptóza vs. Nekróza https://s-media-cache-ak0.pinimg.com/736x/3f/cc/35/3fcc35dccf98f357d9eea5d0131a8570.jpg https://www.pinterest.com/spanglyal/cancer-cell-mapping/ Apoptóza může být indukována dvěma drahami 1. Vnitřní dráha (intrinsic pathway) - mitochondriální - z důvodu buněčného stresu nebo DNA poškození -uvolnění proteinů (hl. Cytochrom C) z prostoru na membráně mitochondrií -tvorba apoptozómu → proteolytické štěpní prokaspázy 9 na iniciační kaspázu 9 2. Vnější dráha (extrinsic pathway) - receptorová - z důvodu vnější signalizace od ostatních buněk - extracelulární ligandy (hl. TNF-α a Fas) se váží na tzv. death-receptory na povrchu buněk - vzniká proapoptický signál → proteolytické štěpní prokaspázy 8 na iniciační kaspázu 8 Metody detekce apoptózy např. při testování léčiv in vitro pomocí světelné mikroskopie – morfologické změny Image result for death smiley Nic Lék na leukemii Image result for smiley Image result for smiley Image result for smiley 1. Barvení buněk Trypanovou modří - proniká a barví pouze mrtvé buňky - počítání ve světelném mikroskopu na sklíčku s mřížkou - nerozliší mezi apoptotickou a nekrotickou buňkou http://eurekabrewing.files.wordpress.com/2012/07/yeastcount.jpg http://i5.walmartimages.com/dfw/dce07b8c-7080/k2-_27a7dc01-9211-4820-a47e-3c8775248319.v1.jpg Image result for cell counter countess Flow cytometry > 2. Průtoková cytometrie Technika pro analýzu velkého množství buněk. Na buňkách je možné analyzovat: - velikost (forward scatter) - tvar (granularitu; side scatter) - fluorescenční barvičku (DNA interkalator; obdoba trypanové modři) - expresi povrchových proteinů (protilátka proti povrchovým antigenům konjugovaná fluorochromem) - expresi intracelulárních proteinů (buňky nutno usmrtit a permeabilizovat membránu) Forward scatter velikost rId1 2. Flow cytometrie Detekce buněčné smrti pomocí DNA interkalátoru (např. propidium jodid PI; nebo DAPI) - PI je fluorescenční barvička, vážící se na DNA - podobně jako trypanová modř proniká a barví pouze mrtvé buňky Histogram barvení propidium jodidem interkalace – vmezeření. I. do DNA – vmezeření určité látky mezi obě vlákna DNA http://www.photobiology.com/photoiupac2000/pierard/intintercal.jpg pozitivní signál, buňky obarvené na PI = mrtvé negativní signál, buňky neobarvené na PI = živé Apoptosis / Necrosis Annexin V (FITC) Viable cells Early apoptotic cells Late apoptotoic or necrotic cells Annexin V FITC staining fosfolipid fosfatidylserin 2. Flow cytometrie – translokace fosfatidylserinu osa x: intenzita fluorescenčního signálu v kanálu FITC (buňky pozitivní na Annexin) osa y: intenzita fluorescenčního signálu v kanálu PerCP-Cy5 (buňky pozitivní na Propidium jodid) Annexin – protein s vysokou afinitou k fosfatidylserinu, který je translokován na povrch apoptických buněk, u nekrotických buněk se váže na fosfatidylserin z vnitřní strany Annexin+PI-... časná apoptoza Annexin+PI+... pozdní apoptoza/nekroza 3. Western blotting - izolace celkového proteinu z buněk a rozdělení proteinů na polyakrylamidové gelu podle své velikosti. - inkubace s protilátkou umožní zjistit, zda je daný protein ve vzorku přítomen a v jakém množství (oproti jinému vzorku na téže membráně - semikvantitativní metoda) - příklady markerů apoptózy: - proapoptotický protein z rodiny Bcl-2: BIM - štěpení (pro)kaspázy - štěpený protein PARP Image result for western blot caspase cleavage Imunitní systém Imunitní systém Existuje fyzická, chemická a buněčná obrana proti invazi bakterií a virů 1. linie obrany - fyzická a chemická a) kůže: vrstva mrtvých buněk - suchá a s nízkým pH b) sliznice: pokryty lysozymem - chemický rozklad bakterií c) cilie (řasinky): výběžky buněk, působí jako filtr a aktivně odstraňují patogeny https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/images/ency/fullsize/19533.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/Hematopoiesis_simple.svg/2000px-Hematopoi esis_simple.svg.png wikipedia Hematopoéza (krvetvorba) Imunitní systém 2. linie obrany - nespecifická imunitní odpověď - Vrozená imunitní odpověď, obecná odpověď na infekci patogenem - Rychlá reakce pomocí které je vyvolán zánět Granulocyty a) Neutrofil - nejběžnější granulocyt (30-85%), fagocytuje bakterie a sekretuje lysozym, který degraduje bakteriální stěny b) Eosinofil - vylučuje enzymy, které zabíjí parazitické červy c) Bazofil - vylučuje histamin pro podporu zánětu d) Mastocyt (mast cell; žírná buňka) - vylučuje signály pro snížení průtoku krve v místě poranění a histamin - signály pro zvýšení průtoku krve a propustnosti kapilár v okolí poranění, aby se fagocyty dostaly do místa poranění e) Makrofágy - fagocyty (big eaters) - fagocytují vše - obsahují MHC (major histocompatibility complex) , který vystavuje antigen - sekrece cytokinů, které přitahují další makrofágy a neutrofily - zvyšují teplotu - v krvi kolují ve formě monocytů Antigen: částice rozeznávaná protilátkou, v imunologii se jedná o cizí patogen Protilátka: částice, která specificky rozeznává antigen a je rozeznávána lymfocyty https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/Hematopoiesis_simple.svg/2000px-Hematopoi esis_simple.svg.png https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/Hematopoiesis_simple.svg/2000px-Hematopoi esis_simple.svg.png https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/Hematopoiesis_simple.svg/2000px-Hematopoi esis_simple.svg.png https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/Hematopoiesis_simple.svg/2000px-Hematopoi esis_simple.svg.png https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/Hematopoiesis_simple.svg/2000px-Hematopoi esis_simple.svg.png MHC-molekuly (proteiny) - Major histocompatibility complex (hlavní histokompatibilní komplex) - u lidí zvaný též HLA-komplex (human leukocyte antigen), velká individuální genetická variabilita - soubor povrchových proteinů - posttranslačně glykozylované proteiny Syntéza MHC - během syntézy zachycují peptidy a fragmenty vzniklé odbouráváním cizorodých proteinů (antigenů) a zanořují je do povrchu buňky - buňka se stává APC (antigen prezentující buňkou) - prezentovaný antigen je rozeznáván TCR-receptorem T-lymfocytů Typy MHC 1. MHC I (první třídy) -prezentace endogenních peptidů: virový antigenní peptid či jinak vadní tělní buňky -nacházejí se na většině jaderných buněk - jsou rozeznávány TC –lymfocyty (cytotoxické), které se aktivují k usmrcení podobných buněk 2. MHC II (druhé třídy) -prezentace exogenních peptidů: peptidové fragmenty z patogenů fagocytovaných APC buňkou -omezená exprese: dendritické buňky, B-lymfocyty, aktivované T-lymfocyty, makrofágy, endotelové buňky, epteliálne buňky. - jsou rozeznávány pouze TH-lymfocyty (pomocné) Zánět -faktory způsobující zánět: patogeny, trauma, teplota, toxiny… -makroskopické projevy zápalu: calor (teplo), rubor (zrudnutí), tumor (otok), dolor (bolest), functio laesa (porucha funkce) - krevní destičky vylučují srážlivé faktory (1) Makrofágy, (2) Neutrofily, (3) Mastocyty - makrofágy a buňky poraněné tkáně vylučují cytokiny, které přivolávají pomoc - změny ve stěnách kapilár umožňují průchod velkého množství leukocytů - mastocyty indukují vazokonstrikci poraněných cév a vazodilataci okolních cév - zvýšení teploty http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/49_03a_inflammatry_respon-L.jpg http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/49_03b_inflammatry_respon-L.jpg Imunitní systém 3. linie obrany - specifická imunitní odpověď -v případě, že první dvě linie obrany nestačí a infekce se šíří -adaptivní imunitní reakce – zúčastňují se humorální komponenty: protilátky a buněčné komponenty: lymfocyty (patří mezi agranulocyty spolu s monocyty) APC buňky (např. makrofágy) vystavují na povrchu cizí antigeny (Antigen Presenting) T-lymfocyty jsou tímto informovány o typu patogenu - Pomocné (Helper) T lymfocyty (TH) aktivují jiné buňky - Cytotoxické T lymfocyty (TC) eliminují infikované a nádorové buňky B lymfocyty a plasmatické buňky produkují protilátky (sekretují do krve nebo umísťují na buňky) Aktivace T a B lymfocytů Při styku s antigenem se lymfocyt zmnožuje a vzniká množství klonů se stejným antigenním receptorem - nazýváme klonální selekce - základní koncept imunologie a očkování Klonální selekcí lymfocytů vznikají dva typy buněk: a) efektorové: krátká životnost, najdou a zničí patogen - z B buněk → plazmatické - sekretují protilátky - z T buněk → - cytotoxické T lymfocyty - helper T lymfocyty b) paměťové: vznikají při primární infekci, nejsou aktivní, ale přetrvávají v těle a při další infekci stejným patogenem jsou rychle reaktivovány k mitóze (imunologická paměť) Imunitní systém 3. linie obrany - specifická imunitní odpověď - každý virus a bakterie má unikátní molekulární markery, které jej identifikují - lymfocyty v těle rozeznávají: - vlastní antigeny - ty je nechávají klidnými - cizí antigeny - spouští mitotickou aktivitu (dělení) Fáze: 1. Rozeznání specifické cizí částice 2. Opakované buněčné dělení a vytvoření obrovské populace klonů lymfocytů 3. Diferenciace do subpopulací efektorových a paměťových buněk Imunitní systém 3. linie obrany - specifická imunitní odpověď Antigen-prezentující buňka - známe 3+1 typ APC: makrofág, B-lymfocyt, dendritická buňka + buňka infikovaná virem - vystavují na svém povrchu antigeny - např. makrofág pohltí bakterii a na svém povrchu vystaví její antigeny - tyto antigeny jsou ve vazbě s MHC - antigeny jsou rozeznávány lymfocyty http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/261.jpg T-lymfocyty (Thymocytes; T-cells) - tvorba v kostní dřeni - putují nezralé do brzlíku (thymus) kde diferencují a zrají - v procesu zrání získávají markery CD4 (T-helper cells TH) a CD8 (Cytotoxic T-cell TC) a antigenně specifické receptory - T lymfocyty ignorují buňky s prázdnými MHC antigeny, stejně jako volně plovoucí antigeny - váží se však na antigeny, vystavené na povrchu APC v MHC komplexu - vazba indukuje rapidní proliferaci do efektorových a paměťových buněk s receptorem pro daný antigen http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/49_14_T_cell_activation-L.jpg Helper T sám nedokáže rozpoznat infikovanou buňku T-lymfocyty (Thymocytes) 1. Efektorové T-helper lymfocyty (CD4) - sekretují interleukiny → stimulace dalších buněk - na povrchu mají protein CD4, který se váže na MHC II molekuly 2. Efektorové cytotoxické T lymfocyty (CD8) - rozpoznávají infikované či jinak vadné buňky a vyvolávají u nich APOPTOZU: a) uvolnění cytotoxických látek (perforiny+gramzymy), které pronikají do cytoplasmy a spouští kaspázovou kaskádu b) exprese povrchového proteinu Fas-ligand, který se váže na Fas-receptor - na povrchu mají protein CD8, který se váže na MHC I molekuly http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/263.jpg http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/49_17_cell-mediated_humor-L.jpg B-lymfocyty - prekurzory se tvoří v kostní dřeni u dospělých a játrech plodu - B-lymfocyt produkuje jeden typ protilátky (imunoglobulin), které se uchytí na povrchu - aby se B-lymfocyt začal dělit potřebuje: - kontakt se specifickým antigenem - aktivaci od T-helper lymfocytu, který už se s daným antigenem setkal na APC buňce (např. makrofágu) - Po aktivaci diferencuje B-lymfocyt do efektorové buňky (= plazmatická buňka) a paměťového B-lymfocytu - Plazmatická buňka produkuje masivní množství volných protilátek - volné protilátky označují patogen pro zničení fagocyty a komplementem - paměťové buňky zůstávají inaktivní během první infekce, ale při druhé infekci se aktivují mnohem rychleji než "virgin" B-lymfocyty - nejmenší část antigenu schopná reakce s protilátkou nebo receptorem T-lymfocytu se nazývá antigenní determinanta neboli epitop Komplement Imunitní mechanismus zvyšující (doplňující, komplementující) účinnost protilátek - Nespecifický (vrozený) a neadaptibilní - soubor malých glykoproteinů (inaktívne prekurzory), tvořených v játrech a cirkulujících v krvi - aktivace: imunokomplex (Ag+Ab), povrchy virů (lipopolysacharid G- bakterií, kyselina teichoová G+ baktérií), navázaní MBP na manózu baktérií… -po aktivaci dochází k proteolytickému štěpení jednotlivých složek komplementu (tzv. faktorů) atakuje membrány patogenů, ve kterých způsobuje póry (kanály) → lyze buňky https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/60/Membrane_Attack_Complex_%28Terminal_Compl ement_Complex_C5b-9%29.png/800px-Membrane_Attack_Complex_%28Terminal_Complement_Complex_C5b-9%29.pn g wikipedia http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/264.jpg Vlastnosti B-lymfocytů 1. Mají na povrchu receptor zachycující volný antigen. Molekula protilátky (imunoglobulin) vázaná na membránu 2. B-lymfocyt se aktivuje k dělení a diferenciaci na plazmatickou buňku teprve po kontaktu s antigenem. Do té doby je v klidu v G0 fázi. Nutno též potvrzení od TH Navíc B-cell fungují jako APC. antigen je nabízen TH-lymfocytům. Neaktivuje se dokud nedostane "potvrzení" od T helper Antigen-presenting cells (APC; buňky prezentující antigen) na povrchu vystavují antigen, který je rozeznáván T-lymfocyty Existují 3+1 typy APC buněk: 1. B-lymfocyty - detekuje volný antigen pomocí receptoru (povrchový IgM) - endocytozou se antigen dostává do vezikuly, kde se rozkládá na peptidy - na ribozomech se syntetizují MHC II-molekuly, které migrují do vezikuly a spojí se s peptidy - komplex MHC II+peptid putuje k povrchu buňky, kde se vystavuje TH-lymfocytům - B-lymfocyty s antigeny se vyskytují v lymfoidních folikulách lymfatických uzlin 2. Makrofágy - pohlcují bakterie a odbourávají jejich proteiny a vystavují v komplexu s MHC II - vrozená (nespecifická) imunita - na povrchu receptory pro různé složky mikrobiálních buněk - rozptýleny po celém těle - lymfatické uzliny, plíce, játra, mozek... - mohou být i pohyblivé a přecházet mezi tkáněmi (amébovitý pohyb) - po vazbě TH-lymfocyt navíc produkuje interferon gamma (INF-γ) a tím se ještě víc aktivuje k pohlcování virů a bakterií - makrofágy též produkují cytotoxické proteiny - v krvi se vyskytuje ve formě monocytu 3. Dendritické buňky - schopné fagocytozy - komplexy antigenů a MHC I i MHC II - aktivují tedy jak TH- tak i TC-lymfocyty Podle místa výskytu dělíme: a) Langerhansovy buňky - v pokožce a mukózních tkáních - přijmou antigen a putují do lymfatických uzlin, kde diferencují na dendritické buňky a stimulují T-lymfocyty b) Intersticiální dendritické buňky - osidlují většinu orgánů (srdce, játra, ledviny...) c) Proplétající se dendritické buňky - v sekundárních lymfoidních orgánech spolu s T-lymfocyty d) Cirkulující dendritické buňky - v krvi (0,1% krevních leukocytů) https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3b/Dendritic_cell.JPG wikipedia https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/Hematopoiesis_simple.svg/2000px-Hematopoi esis_simple.svg.png (4). Buňky infikované viry - virus napadne tělní buňku a spustí svou replikaci a transkripci svých proteinů - virové proteiny mohou být buňkou odbourány a vystaveny na povrchu v komplexu s MHC I - MHC I + virový antigen je rozeznáván TC-lymfocyty a infikovaná buňka je zničena apoptozou http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/49_17_cell-mediated_humor-L.jpg b) Humorální imunita zprostředkovaná specifickými protilátkami produkovanými B-lymfocyty do tělních tekutin a) Buněčná imunita zprostředkovaná T-lymfocyty - TC lymfocyty produkují Fas ligand a perforiny + granzymy → APOPTOZA Apoptóza! Imunoglobuliny (protilátky) - vyskytují se vázané na povrchu B-lymfocytů nebo volné (IgM a IgD slouží jako receptor) - volné protilátky označují patogen pro zničení fagocyty a komplementem - obecná struktura protilátek je velmi podobná - největší rozdíly jsou na N-koncové části (antigen-binding site), která je extrémně variabilní (V oblast) -Variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce vytvářejí vazebné místo → existence milionů jemně odlišných verzí protilátek - klasifikace protilátek je založena na typu Fc fragmentu (těžkého řetězce) Imunoglobulinové třídy: 1. IgA (2 typy) - hlavně na sliznicích (trávící, dýchací..) a ve slinách, mléku... - zabraňuje kolonizaci patogeny - vysoká denní produkce 2. IgD (1 typ) - antigenní receptor na B-lymfocytech - BCR (spolu s IgM) - aktivuje bazofily a mastocyty k produkci antimikrobiálních faktorů 3. IgE (1 typ) - váže se na alergeny - aktivuje bazofily a mastocyty k produkci histaminu - chrání před parazitickými červy 4. IgG (4 typy) - v krevním séru tvoří až 80% všech imunoglobulinů 5. IgM (1 typ) - vázán na membránu B-lymfocytů, kde působí jako receptor pro antigen - BCR - nejúčinnější ve vazbě virových částic Some antibodies form complexes that bind to multiple antigen molecules. Imunoglobuliny (produkovány B-lymfocyty) Protilátky patří do skupiny glykoproteinů, označovaných jako imunoglobuliny Molekula imunoglobulinu je složena min. ze 4 polypeptidových řetězců - 2x těžký (H) řetězec (cca 430 aminokyselin) - 2x lehký (L) řetězec (cca 214 aminokyselin) Fc region Fab region http://www.fastbleep.com/assets/notes/image/6873_1.jpg Imunoglobuliny Konstantní oblast (C) - relativně neměnná sekvence aminokyselin - CH pro těžký a CL pro lehký řetězec Variabilní oblast (V) - úsek, v němž se imunoglobuliny příslušného typu liší - VH pro těžký a VL pro lehký řetězec Hypervariabilní oblasti - váží antigen - značně proměnlivá primární struktura Pantová (hinge) oblast - ohebnost usnadňuje vazbu na antigen Glykozylace - připojení sacharidů N-glykozidovou vazbou - na různých místech těžkého řetězce - slouží k ochraně před proteolýzou Domény - lehký řetězec má 2 domény (C a V) - těžký řetězec má jednu V a tři nebo čtyři C domény Klasifikace lehkých a těžkých řetězců Lehké řetězce - 2 typy: κ (kappa) a λ (lambda) Těžké řetězce - 5 typů: γ (gamma), α (alfa), μ (mí), δ (delta), ε (epsilon) - gamma má 4 podtypy a alfa má 2 podtypy Klasifikace protilátek je založena na typu Fc fragmentu (těžkého řetězce) VLCLVHCH indexy lze specifikovat, např. pro IgD: VκCκVδ Cδ Cδ Vδ Cκ Vκ IgD disulfidové můstky pouze mezi cysteiny, protože protože je síra na konci řetězce (u methioninu je uprostřed) Imunoglobulinové domény - skládají se z antiparalelních β-skládaných listů spojených smyčkou - struktura domény stabilizována vodíkovými vazbami (mezi -NH a -CO) - každá doména je navíc stabilizována disulfidovou vazbou - antigen se váže na aminokyselinové zbytky (antigen binding site) v hypervariabilních úsecích - při vazbě antigenu dochází ke změně konformace domény https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Images/integration/IgG-Structure.gif www.thermofisher.com Molekulární podstata tvorby protilátek dědí se pouze subgeny (genové segmenty) pro tvorbu imunoglobulinů VDJ rekombinace (přeskupování genových segmentů) - proces při kterém T a B lymfocyty náhodně sestavují různé genové segmenty - k VDJ rekombinaci dochází v DNA buněk v průběhu jejich vývoje, před kontaktem s antigenem - genové segmenty: (V) ... variable (D) ... diversity (J) ... joining Cíl: vytvářet jedinečné protilátky, které společně dokážou rozeznat mnoho druhů antigenních molekul U B-lymfocytů vznikají VDJ rekombinací imunoglobuliny (membránová - BCR - nebo volná forma) U T-lymfocytů vznikají VDJ rekombinací T-cell receptory (TCR) https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3e/VDJ_recombination.png VDJ rekombinace 3 typy genů: 1. pro těžký řetězec: 14. chromosom (5 subtypů za sebou) 2. pro lehký řetězec kappa (κ): 2. chromosom 3. pro lehký řetězec lambda (λ): 22. chromosom - kombinací vzniklých VDJ přesmykem může být u člověka řádově 1013 - u genů pro lehké řetězce kappa a lambda chybí D segment http://2012.igem.org/wiki/images/thumb/a/a4/Syn_MR_VDJ-recombination.png/850px-Syn_MR_VDJ-recombina tion.png VDJ rekombinace u těžkého řetězce (2012.igem.org) www.bsse.ethz.ch https://www.bsse.ethz.ch/lsi/research/systems-immunology/_jcr_content/par/fullwidthimage/image.imag eformat.lightbox.1368136327.png VDJ rekombinace http://www.nature.com/nri/journal/v3/n8/images/nri1152-f1.gif Mechanismus VDJ rekombinace probíhá pouze na DNA nezralých lymfocytů RSS (recombination signal sequence) - označuje místo sestřihu (vazba RAG) RAG1/RAG2 (recombination-activating genes) - enzymy katalyzující VDJ rekombinaci -vazba na RSS -U dětí s funkční poruchou RAG1 a RAG2 → těžká imunodeficience, nepřítomnost zralých T- a B-lymfocytů (nevytvoří se ani BCR a TCR) virology_wiki_6_picture_1.jpg Přesmyk imunoglobulinových tříd (izotypový přesmyk) - IgM a IgD se tvoří jako první, protože Cμ a Cδ následují na DNA hned za VDJ subgeny - po VDJ rekombinaci následuje přesmyk tříd z IgM do IgG, IgE nebo IgA - až po stimulaci antigenem v sekundárních lymfoidních orgánech za podpory TH lymfocytů - stejný úsek VDJH se připojí k subgenu Cγ, Cα nebo Cε za delece Cμ a Cδ - přesmyk tříd je řízen "signály přesmyku - S" https://dokuwiki.noctrl.edu Receptory T lymfocytů (TCR) - u člověka má 95% T lymfocytů TCR receptor složený z α (alfa) a β (beta) řetězce (cca 5% TCR je z řetězců gama a delta - γ/δ) - V, D a J segmenty v β řetězcích - V a J segmenty v α řetězcích - přeskupování probíhá stejně jako u imunoglobulinů - vznik jedinečných receptorů http://archive.cnx.org/resources/4dfaa6804787ee7e22b513e991566e17093e41c4/2215_Alpha-Beta_T_Cell_Re ceptor.jpg archive.cnx.org Vakcinace (očkování) tvorba paměťových lymfocytů po setkání s antigenem (větš. oslabený kmen nebo jeho část) Pravé neštovice (small pox) - infekční nemoc způsobená virem Variola major - mortalita 30-35% - u lidí se pravděpodobně objevila 10 000 let před našim letopočtem - má na svědomí přibližně 300-500 milionů mrtvých v 20. století - bývala zodpovědná za asi 1/3 oslepnutí - v roce 1979 ohlásila WHO úplné vymýcení pravých neštovic díky celosvětovému programu očkování - v 80. letech bylo zastaveno rutinní očkování dětí ve všech zemích (70. léta v Evropě a USA) - jediné známé vzorky viru zůstávají v laboratořích v Atlantě a v Moskvě Snímek viru z elektronového mikroskopu (wikipedia) Smallpox virus virions TEM PHIL 1849.JPG https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/92/Smallpox_keep_out_of_this_house..JPG Vakcinace (očkování) Edward Jenner (1749 - 1823) - doktor z Gloucestershire - při epidemii pravých neštovic si všiml, že dojičky, které prodělali kravské neštovice neonemocní - provedl experiment: - odebral vzorek kravské neštovice z pacientky Sarah Nelmesové - nakazil tímto 8-letého chlapce Jamese Phippse - po zotavení nakazil Jamese pravými neštovicemi - neonemocněl - očkování nepatentoval, aby mohli být léčeni bohatí i chudí Edward Jenner by James Northcote.jpg wikipedia Latinsky "vacca" znamená "kráva"