Molekulární biologie 12. Molekulární podstata nádorových onemocnění Osnova základní vlastnosti nádorové buňky onkogeny, protoonkogeny, nádorové supresory dědičné nádory Hlavní zdroje: S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie 1-4 Masarykova Univerzita Brno ISBN 80-902562 B. Staveley, Principles of Cell Biology Memorial University of Newfoundland http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/CBhome.html http://fis.org/x-graphics/05-02-graph2.gif Rakovina Komplexní onemocnění vycházející z poruch buněčného cyklu. Způsobena maligním nádorem. - v civilizovaném světě je šance na vznik rakoviny zhruba u 50 % populace - druhá nejčastější příčina úmrtí po kardiovaskulárních nemocech - vývoj rakoviny je postupný proces kumulace změn - vyšší riziko s věkem Nádor (tumor, neoplazma, novotvar) - patologický útvar tvořený v tkáni mnohobuněčného organismu, jehož růst se vymkl kontrole - dělení buněk není omezováno žádným regulačním mechanismem Kancerogeneze = Karcinogeneze - proces vzniku a vývoje nádoru www.fis.org Benigní nádor - pomalý růst - podobnost s původní tkání - ohraničenost - většinou neohrožují život - utlačuje okolní tkáň Maligní nádor - vysoká proliferace - změny v morfologii, velikosti a tvaru buněk - nižší stupeň diferenciace - tvorba metastáz Rakovina - Úvod http://image.slidesharecdn.com/tumor-immunology-key-questions-how-do-tumor-cells-evade452/95/tumor- immunology-key-questions-how-do-tumor-cells-evade-8-728.jpg?cb=1287485683 Adenom/Adenokarcinom: nádor vzniklý z epitelu. Nezhoubný nádor se označuje jako adenom, zhoubný jako adenokarcinom. Typy 1. (Adeno) Karcinomy - z epiteliálních buněk - 90 % všech rakovin - např. kůže, játra, slinivka, štítná žláza, plíce, prsa, prostata, tlusté střevo, vaječníky, ledviny... 2. Sarkomy - v podpůrných tkáních - např. kost, chrupavka, sval... 3. Krevní a lymfatické - nevyskytují se jako pevné útvary - lymfomy a leukémie Epitel kryje vnější nebo vnitřní povrchy organizmu a má žlázovou funkci. Fylogeneticky nejstarší typ tkáně. Vzniká ze všech 3 zárodečných listů. Endotel - jednovrstevný dlaždicový epitel (vrstva buněk) vystýlající vnitřní povrch cév a srdce. Mezodermální původ. Rakovina Distribution of Cases and Deaths for the Top 10 Most Common Cancers in 2020, GLOBOCAN 2020. Roční úmrtnost na vybrané typy rakoviny www.clevelandclinicmeded.com http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/diseasemanagement/pulmonary/lung-cancer/images/figu re-2.jpg http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/diseasemanagement/pulmonary/lung-cancer/images/figu re-3.jpg ♀ ♂ Cigarety a rakovina http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_06.jpg http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_01.jpg Rakovina kůže - vrstva epiteliálních buněk z bazální vrstvy začne přerůstat okolní buňky a tvoří tumor - defektní mechanizmy kontroly buněčného cyklu http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_01.jpg http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_01.jpg http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_01.jpg Tumory vznikají nekontrolovaným dělením při ztrátě rovnováhy mezi proliferací a diferenciací Stádia rakoviny http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_09.jpg Rakovina není monogenní onemocnění •Odhadem 4-7 událostí nezbytných pro nádorovou transformaci buňky •Desítky možných genů, jejichž mutace povede k podpoře vzniku rakoviny Klonální expanze transformované buňky má dva základní rysy, které jsou klíčem k pochopení její molekulární podstaty. O nádorech mluvíme jako o onemocněních genomu, protože základem jejich vzniku jsou především genetické změny, tzv. mutace. K přeměně normální zdravé buňky v buňku plně maligní nestačí mutace jediná. Kancerogeneze je vícestupňový proces postupného hromadění několika mutací. Mutace, které vedou k vývoji nádorů, postiženým buňkám neškodí, ale naopak je zvýhodňují v soutěži o přežití se sousedními buňkami. A právě tato výhoda, kterou individuální buňka s danou mutací získává, ohrožuje život celého nohobuněčného organismu Nádor je komplexní tkáň 1. Nádorové stroma: •Podpůrné buňky – zejm. fibroblasty - udržují tvar, produkují extracelulární matrix. •Nové cévní zásobení (endoteliální buňky) - transport živin a kyslíku, možnost invaze a metastází. •Buňky imunitního systému - indukce zánětu. 2. Nádorový parenchym: •vlastní nádorové buňky •heterogenní, k mutacím dochází i během jeho růstu má dva základní rysy, které jsou klíčem k pochopení její molekulární podstaty. O nádorech mluvíme jako o onemocněních genomu, protože základem jejich vzniku jsou především genetické změny, tzv. mutace. K přeměně normální zdravé buňky v buňku plně maligní nestačí mutace jediná. Kancerogeneze je vícestupňový proces postupného hromadění několika mutací. Mutace, které vedou k vývoji nádorů, postiženým buňkám neškodí, ale naopak je zvýhodňují v soutěži o přežití se sousedními buňkami. A právě tato výhoda, kterou individuální buňka s danou mutací získává, ohrožuje život celého nohobuněčného organismu Obecné vlastnosti nádorové buňky Byly porušeny překážky buněčné proliferace → Neomezené dělení buňky a její „nesmrtelnost“ Hanahan a Weinberg 2011 porušení prekážek bunecné proliferace. Jsou 2 základní skupiny genu, jejichž poruchy vedou k neomezenému bunecnému delení Speciální vlastnosti nádorové buňky při in vitro kultivaci 1. Nepotřebují ukotvení - většina zdravých buněk potřebuje podklad a v kultuře tvoří jednu vrstvu - rakovinné buňky dokážou růst v suspenzi 2. Snížená citlivost ke kontaktním signálům (kontaktní inhibice) - zdravá buňka se přestane dělit, pokud není místo (v kultuře tvoří pouze jednu vrstvu) - rakovinná buňka se dělí dál a utlačuje okolní tkáň (v kultuře přerůstá do více vrstev, 3D útvary) Angiogeneze - tvorba vlastního cévního zásobení - tumor potřebuje cévní zásobení pro výživu, okysličení a odvod živin, v opačném případě roste pouze max. 1-2 mm - rakovinné buňky produkují směsi angiogenních faktorů (např. VEGF a FGF) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_03.jpg Duhovka (iris) je dobře prokrvená Cornea - rohovka Obsah obrázku text, interiér Popis se vygeneroval automaticky. Metastáze a invaze - primární nádory lze odstranit chirurgicky Invaze migrace a penetrace rakovinných buněk do sousední tkáně Metastáze migrace rakovinných buněk krevním oběhem do vzdálených tkání a tvorba sekundárních ložisek - změny adheze a produkce proteáz, které degradují proteiny bazální laminy http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_04.jpg Extravasation is the movement of cells from the capillaries to the tissues surrounding them Metastáze a invaze - rakovinné buňky mohou v sekundárních ložiscích přetrvávat ve stádiu dormance, těžko odhalitelné zobrazovacími metodami - relaps onemocnění po letech RNA primer pro Okazakiho fragment musí nasednout před Telomery Opakující se sekvence na konci každé chromatidy. Pro obratlovce: sekvence TTAGGG (opakuje se asi 2500× u lidí). Při každé replikaci dojde ke zkrácení chromatidy. To může být dorovnáno enzymem telomerázou. U většiny lidských somatických buněk telomeráza není aktivní. Aktivní telomeráza znakem nádorových a kmenových buněk – až 90 %. http://2014hs.igem.org/wiki/images/b/bc/Telomere-what-we-lose-with-age.gif http://2014hs.igem.org/wiki/images/d/d7/Tert1.jpg Neomezený replikační potenciál rakovinných buněk Telomeráza je enzym pracující jako reverzní transkriptáza, který je schopen prodlužovat konce eukaryotických chromozomů (tzv. telomery). Molekulární podstata rakoviny Změny v genech, které hrají roli v kontrole buněčného cyklu a opravách DNA. 1. Proto-onkogeny - geny stimulující proliferaci - při mutacích způsobujících jejich hyperaktivitu je nazýváme onkogeny - "Gain-of-function" mutace - často geny signalizační kaskády růstových faktorů - např. Ras, Myc... - aktivace je dominantní - stačí porucha v jedné alele pro abnormálně zvýšenou funkci 2. Tumor-supresory - geny zastavující buněčný cyklus - při rakovině často nefunkční - "Loss-of-function" mutace - např. p53, Rb1, BRCA1 a BRCA2... - aktivace je recesivní - nutný defekt v obou alelách pro vyřazení z provozu CELL CYCLE CELL CYCLE Proto-onkogeny a nádorové supresorové geny kódují proteiny, které se účastní řízení růstu buněk 1. Růstové faktory - např. PDGF, EGF... 2. Receptory pro růstové faktory - např. PDGFR, EGFR... 3. Nitrobuněčné přenašeče - např. Ras, Src... 4. Transkripční faktory - např. Myc, Fos... 5. Regulátory apoptózy - např. proteinové rodina Bcl2 6. Proteiny řídící buněčný cyklus - např. cykliny a cyklin-dependentní kinázy 7. Proteiny zapojené do oprav DNA - např. BRCA, ATM, ATR, γH2AX... http://static1.squarespace.com/static/547bed52e4b0f8c457062764/t/5493a439e4b07e1a0a110424/141896197 8113/RepairMario.png?format=1500w TF CDK cyclin Apoptóza Bax Bim Bad Bcl-2 Bcl-xL PDGF - Platelet-derived growth factor, EGF - Epidermal growth factor •Patologická aktivace proto-onkogenů • • •Interfáze •G1 fáze - období růstu buňky •postup fází G1 je řízen dvěma kontrolními body: • a) bodem restrikce (kontrola velikosti buňky, vnější signály) • b) kontrolním bodem sledujícím stav DNA •S fáze – replikace DNA •G2 fáze – růst buňky, příprava na mitózu •kontrolní bod G2 sledující poškození DNA - kontrola struktury DNA • • Buněčný cyklus Mitóza M kontrolní bod - kontrola sestavení mitotického vřeténka dostatek živin a růstových faktorů růst buňky, vysoká metabolická aktivita nedostatek živin nebo anti-proliferační signál zpomalení postupu fází G1 nebo opuštění cyklu do fáze G0 G0 fáze, ve které se nachází většina buněk mnohobuněčných organismů (jsou diferencované k výkonu určité funkce, nedělí se) „klidová“ resp. nedělivá fáze ALE aktivní proteosyntéza, sekrece, pohyblivost,… možnost opětného vstupu do buněčného cyklu po přijetí určitého signálu (v případě, že je nalezena nezreplikovaná nebo poškozená DNA, dojde k zastavě cyklu, což znemožní zahájení mitózy) CDK- cykliny heterodimerní protein kinázové komplexy zajišťující fosforylaci proteinů nezbytných pro průběh buněčného cyklu Cykliny - regulační podjednotky komplexu - zapínají kinázovou (fosforylační) aktivitu CDK - jejich hladiny během cyklu pravidelně kolísají - ve specifických fázích cyklu podléhají degradaci proteolýzou CDK (Cyklin dependentní kinázy) - katalytické podjednotky komplexu - aktivovány ve spojení s cykliny - aktivita (nikoli koncentrace) během cyklu kolísá Inhibitory CDK Řízení buněčného cyklu Koncentrace cyklinů kolísají v průběhu bun cyklu G1/S Checkpoint G2/M Checkpoint kontrola DNA Antiproliferační signalizace (RB inhibuje cyklus v G1 vazbou na E2F) Typy mutací v proto-onkogenu a) bodová mutace, b) amplifikace genu, c) chromosomální translokace, d) lokální přestavby DNA, e) inzerční mutageneze http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_12.jpg Oprava DNA http://www.publichealthunited.org/wp-content/uploads/2013/05/BRCA-pathway.png http://www.publichealthunited.org/wp-content/uploads/2013/05/BRCA-pathway.png Oprava DNA http://www.microbiology.columbia.edu/symington/images/twomechanisms.gif - homologní rekombinace (HR) je přesnější než nehomologní spojování konců (NHEJ), vyžaduje však přítomnost templátové DNA (řetězec sesterské chromatidy se objeví až v S/G2 fázi; méně často slouží jako templát druhý chromozom v G1 - nesesterská chromatida) Tumor-supresor RB Retinoblastoma protein (pRB) inhibuje přílišné dělení buněk (proliferaci) zastavením buněčného cyklu Proteiny rodiny E2F aktivují cílové geny nutné pro G1/S přechod Unfortunately we are unable to provide accessible alternative text for this. If you require assistance to access this image, please contact help@nature.com or the author - zabraňuje přechodu do S-fáze buněčného cyklu tím, že váže a inhibuje transkripční faktory E2F rodiny (E2F podporuje proliferaci) - dokud je Rb vázán na E2F, buňka zůstává v časné G1 nebo G0 fázi - v proliferujících buňkách komplex CycD+CDK4,6 fosforyluje pRB, čímž uvolňuje E2F → vstup do S-fáze V nádorových buňkách pRB často nefunguje a E2F je stále volný → neregulovaná proliferace a) mutace v RB genu - neváže se na E2F b) virový protein E7 vyvazuje pRB c) overexprese cyklinu D nebo CDK 4,6 nebo ztráta inhibičního p16 → nadměrná fosforylace RB Dědičné typy rakoviny - mutace RB - mutace v jedné alele se nachází již v pohlavní buňce → ve všech somatických buňkách potomka - mutace v druhé alele může nastat během života - nefunkční RB protein byl poprvé popsán v souvislosti s nádorem oka (retinoblastoma), roli hraje v různých typech nádorů http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_17.jpg Pro vznik nádoru v oku je potřeba mutace v obou alelách - často u dětí (two-hit model) pouze v buňkách oka (či jiné tkáně) a ne ve spermiích a vajíčkách Two-hit model Pro vznik retinoblastomu je potřeba dvou genetických změn - Na základě srovnání dědičné a sporadické formy retinoblastomu definoval roku 1971 Alfred Knudson "two-hit" teorii - výzkumníci v oboru rakoviny nejprve této teorii nevěnovali pozornost, jelikož dědičná rakovina je velmi vzácná - tato teorie však stála za objevem tumor-supresorových genů ve všech typech rakoviny Naproti tomu u proto-onkogenů stačí mutace pouze v jedné alele (one-hit) - p53 indukuje transkripci p21, který se váže na CDK2 - inhibuje přechod do S fáze - vazba s Mdm2 inhibuje jeho aktivitu - HATs (např. p300/CBP, PCAF) mohou v odpovědi na stres acetylovat p53 → zvýšení aktivity - HDAC1, 2 a 3 mohou snížit aktivitu p53 deacetylací - 50 % nádorů má mutaci nebo deleci p53 - mutace p53 znamená většinou negativnější prognózu u nádorového onemocnění Tumor-supresor p53 The guardian of the genome HDAC - Histon deacetylázy potlačují expresi HDAC1, HDAC2, HDAC3... HAT - Histon acetyl transferázy aktivují expresi Gcn5, p300/CBP, PCAF, SRC-1, ACTR, ESA1, MOZ... Tumor-supresor p53 brzda vstupu do S-fáze zástava BC v G1 fázi umožnuje přestávku nutnou k opravám DNA 1)poškozené mutované buňky pokračují v buněčném cyklu 2) umožní poškozeným buňkám vyhnout se apoptóze 3) vznik genetické nestability umožňující akumulaci dalších mutací Mutace p53 P53 – váže se na DNA a indukuje transkripci p21 – p21 blokuje vazbou na Cdk –vstup a pruchod S-fází Pokud nefunguje nedochází k pozdržení cyklu pri nutnosti oprav DNA – zlomy DNA – abnormální ch. Li-Fraumeni syndrom - dědičné onemocnění - mutace nebo delece v 1 alele genu pro p53 způsobuje dědičnou predispozici k rakovině - v rodině zvýšený výskyt rakoviny různých tkání a v nízkém věku http://www.medicalrealm.net/uploads/1/2/7/3/12737542/434658_orig.jpg Koordinace tumor-supresorů RB a p53 - dvě hlavní dráhy zajišťující buněčnou odpověď na potenciální onkogenní stimuly - signály (např. poškození DNA, aktivace onkogenů): 1. dráha p53 Indukce ARF, které oddělí MDM2 od p53 - aktivní p53 reguluje řadu genů, mj.: - WAF1 → inhibice CDK → cell-cycle arrest - BAX → indukce apoptózy - p21 → inhibice CDK 2. dráha RB Indukce INK4A → inhibice CDK (4,6) → inhibice fosforylace RB → komplex RB+E2F zastavuje cyklus RB se též může vázat na MDM2-p53 a regulovat aktivitu p53 + p21 Tumor-supresory BRCA1 a BRCA2 BReast CAncer 1 a 2 geny - pomáhají opravovat poškození DNA, zejména DSBs (dvouřetězcové zlomy) http://www.frontiersin.org/files/Articles/74290/fonc-04-00042-HTML/image_m/fonc-04-00042-g001.jpg http://s3.media.squarespace.com/production/1407327/16787661/-_rSQymz8Bjk/Td1kr43D28I/AAAAAAAAAO4/wV jiO5zMfXA/s1600/Picture%252B6.png http://teachnuclear.ca/wp-content/uploads/2013/05/direct214.gif pravděpodobnost vzniku rakoviny prsu je u žen asi 12%, pokud mají nebezpečnou mutaci v BRCA, je to cca 60% Tumor-supresory BRCA1 a BRCA2 - nebezpečná mutace v BRCA zvyšuje vznik rakoviny prsu a vaječníku (ne všechny mutace jsou nebezpečné) - běžně existuje cca 12% šance na vznik rakoviny prsu u žen, při defektním BRCA genu (vybrané mutace) se šance zvyšuje na 60-90 % - Angelina Jolie podstoupila preventivně dvojitou masektomii, kvůli mutaci v BRCA1 (šance na vznik rakoviny prsu odhadována na 87 %). Po operaci redukce na 5 %. http://www.frontiersin.org/files/Articles/118529/fonc-04-00318-HTML/image_m/fonc-04-00318-g001.jpg Image result for angelina jolie Proto-onkogeny a tumor-supresory postupná přeměna zdravé buňky tlustého střeva v nádorovou 1. Ztráta nádorového supresoru APC → stabilizace β-kateninu → tvorba polypu a) změna transkripce (zvýšená transkripce genů podporujících proliferaci: cyclin D, c-myc...) b) zvýšení adheze buněk (β-katenin spojuje E-kadherin a α-katenin) 2. "Gain-of-function" mutace Ras → benigní adenom 3. "Loss-of-function" mutace p53 → karcinom Nádory tlustého střeva: p53 mutace v 70 % APC mutace v 70 % APC (Adenomatous polyposis coli) je negativní regulátor β-kateninu, je součástí Wnt signální dráhy Proto-onkogeny - receptory pro růstové faktory (GFR) 1. Konstitutivní aktivita - vykazují kinázovou aktivitu i bez přítomnosti ligandu 2. Overexprese - zmnožení počtu receptorů EGFR - karcinom prsu, žaludku, kolorekta Her2 - karcinom prsu c-Kit - role v hematopoéze - fyziologicky exprimován hl. na nezralých krevních progenitorech - rakovina kůže http://www.nature.com/nrclinonc/journal/v9/n2/images/nrclinonc.2011.164-f1.jpg nature.com - SCF - stem cell factor; steel factor - Trastuzumab = Herceptin - Epidermal growth factor receptor (EGFR; ErbB-1; HER1) Léčba protilátkami nebo tyrosin-kinázovými inhibitory. Diagnostika receptorů může predikovat léčebnou odpověď. členové rodiny EGF proteinů Přehled faktorů kontrolujících proliferaci https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/29/Signal_transduction_v1.png BCL2 proteinová rodina reguluje propustnost vnější mitochondriální membrány a tím řídí apoptózu a) pro-apoptotické: Bax, Bim, Bad... b) anti-apoptotické: Bcl-2, Bcl-xL... Hlavní pro-růstové dráhy - Ras - MEK - ERK - PI3K - AKT - JAK - STAT - CDK + cykliny Hlavní proti-růstové mechanismy - Fas ligand + receptor - Kaspázy - Cytochrom C - p53 a p21 - Retinoblastoma - APC e.g., EGFR, Her2 Karcinogeny Faktory, které způsobují nebo napomáhají karcinogenezi International Agency for Research on Cancer (IARC) založena WHO následující klasifikace kancerogenů: 5G Safety | Spark NZ 126 94 322 •1. Fyzikální karcinogeny • •Zvýšený výskyt karcinomů a leukemií u: • •- přeživších po výbuchu atomové elektrárny v Černobylu •- přeživších po útocích atomovou bombou na Hiroshimu a Nagasaki •- horníků uranových dolů • Vliv UV záření na vznik nádorů kůže - UV paprsky excitují pyrimidinové báze DNA, které pak reagují navzájem a vytváří pyrimidinové dimery - faktor podporující vznik a vývoj nádorů - defekty genů, jejichž produkty působí jako nádorové supresory, např. nefunkční p53 https://lynnrmitchell.files.wordpress.com/2014/09/homer1.jpg Karcinogeny 2. Chemické karcinogeny Anorganické karcinogeny: azbest, chrom,... Organické karcinogeny: - Polychlorované bifenyly (barvy/laky) - Dioxiny (produkty spalování organických látek) - Benzen (rozpouštědla, motorové splodiny) Léčiva: - Chemoterapeutika - Imunosupresiva - Antibiotika (např. Chloramphenicol je potencionální karcinogen) Strava: - heterocyklické aminy - vznikají v potravinách nevhodnou úpravou např. smažení - nitrosaminy - vznikají v těle z dusičnanů přidávaných např. do uzenin Cancers related to lifestyle and environmental factors in France in 2015 https://doi.org/10.1016/j.ejca.2018.09.009 •a) Retroviry (RNA viry): •Jednořetězcová RNA – využívá reverzní transkripce • •- obsahují ve svém genomu onkogen (akutně transformující viry) •- nebo aktivují protoonkogen, vedle kterého se integrovaly (pomalu transformující) • • http://www.laborjournal.de/blog/wp-content/uploads/2012/01/retr2.jpg 3. Biologické karcinogeny: onkogenní (nádorové) viry Onkoviry lidský lymfotropní virus typu I (HTLV-1) - T-leukemie (lymfom) dospělých (ATTL), doba latence asi 30 let - vysoká proliferační aktivita napadených buněk, větší pravděpodobnost mutací Lentiviry viry HIV-1 a HIV-2 nádory spojené s jejich infekcí - lymfomy a sarkomy Viry se úcastní nádorové transformace, protože nesou kopii onkogenu nebo narušují expresi výše zmínených genu • •b) DNA nádorové viry •- neobsahují onkogeny, ale kódují proteiny, které interagují s tumor-supresory hostitelské buňky •- tlačí hostitelskou buňku do S fáze → zrychlení buněčného cyklu • •Inaktivace p53 patří ke klíčovým událostem při transformaci buňky DNA viry. • • • 3. Biologické karcinogeny: onkogenní (nádorové) viry Virus hepatitidy B (HBV) - chronická infekce - integrace do chromozomu - hepatocelulární karcinom (HCC) – až 20-30 let po infekci Herpes viry - EB (Epstein Barrové virus) - v jádře buňky v epizomálním stavu (extrachromosomální) - Lymfomy a karcinomy Papilomaviry (HPV) - způsobuje rakovinu děložního čípku - v benigních nádorech – ve formě episomů, v maligních integrace do genomu - popsáno asi 100 odlišných typů papilomavirů - dělí se na „high-risk“ a „low-risk“ typy podle prognózy Viry se úcastní nádorové transformace, protože nesou kopii onkogenu nebo narušují expresi výše zmínených genu E7 vyvazuje Rb z vazby na E2F Lidský papilomavirus ovlivňuje RB a p53 - virus produkuje proteiny, které inhibují tumor-supresory: - E6 → p53 - E7 → RB http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-24/24_18.jpg Amesův test Základní test na stanovení mutagenního potenciálu chemických sloučenin - rakovina bývá spjata s mutacemi, proto látky způsobující mutace jsou pravděpodobně též karcinogenní - testování na myších je časově náročné (2-3 roky) a nákladné - roku 1970 vynalezl Bruce Ames jednoduchý test na určení mutagenicity Bruce Ames.jpg Bruce Ames https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6e/Ames_test.svg/769px-Ames_test.svg.png - bakterie Salmonella typhimurium - auxotrofní mutant - vyžadují histidin pro růst, ale neumí jej syntetizovat kvůli mutaci v genu pro jeho syntézu - přirozeně se vyskytnou mutace a objeví se kolonie s funkčním genem pro histidin - čím více karcinogenní látka - tím více mutací - více kolonií - extrakt z jater se přidává pro zachycení mutagenity metabolitů testované látky - např. benzo[a]pyren není sám o sobě mutagenní ale metabolity ano Pět pilířů léčby rakoviny 1. Chirurgie 2. Chemoterapie 3. Ozařování 4. Cílená terapie 5. Imunoterapie Dále: hormonální léčba, diferenciační látky (retinoidy), bioterapie, mAb (blok receptoru nebo nesou toxin), anti-angioneogeneze např. cetuximab (EGFR/ERBB1/HER1 protilátka) bude účinný při mutaci receptoru EGFR, ale ne v KRAS mutovaném kolorektálním karcinomu EGFR - ERBB1 - HER1 - RAS - RAF - MEK - ERK Léčba rakoviny Konvenční chemoterapeutika cílem jsou proliferující buňky, nespecifická, vždy stejné % proliferujících buněk Cíle: - poškodit DNA nádoru - zástava proliferace - apoptóza indukcí p53 nebo masivní damage (p53 nezávislé) nádor více náchylný na obecné pro-apoptotické stimuly (genotoxické látky, mitotické jedy, antimetabolity) Nevýhody: ohromné vedlejší účinky (likvidace zdravých tkání - může vést až ke vzniku sekundární rakoviny) Cílená terapie selektivní pro nádorové buňky (specifické pro určitý buněčný proces), nízká toxicita k zdravým buňkám Nevýhody: - není 100% specifická pro danou molekulu - cílová molekula většinou plní i fyziologickou funkci (částečná výjimka fúzní gen) - nutná identifikace molekulární podstaty - individualizovaná medicína (tailored medicine) V onkologii cytostatická chemoterapie = podávání léků s cytotoxickým účinkem (syntetické či z rostlin/plísní) cytostatikum: látka tlumící růst a rozmnožování buněk, zejména nádorových tkání Mechanismy působení konvenčních cytostatik 1. Alkylační látky - atakují negativní náboj DNA a způsobují zlomy v DNA - zabraňují replikaci - mohou indukovat vznik sekundárních leukemií - - Obsah obrázku osoba, mikroskop Popis se vygeneroval automaticky. - -Chlorambucil (lymfomy, CLL) -Cyklofosfamid - nejpoužívanější -Busulfan - předtransplantační myeloablace, CML -Cisplatina - DNA damage, interkalace, aktivní intracelulárně, nefrotoxicita - 2. Antimetabolity - zasahují do syntézy nukleových kyselin - cílí hlavně na proliferující buňky -Metotrexát - blok syntézy purinu inhibicí dihydrofolátreduktázy (osteosarkom) -Fludarabin - blok purinů - substituce adenosinu - fragmentace DNA (AML, CLL) -5-fluoruracil - integrace do RNA -Hydroxyurea - blok ribonukleotidreduktázy, inhibice pyrimidinu, CML - (dočasné separování DNA helikázou - pnutí), topoizomeráza rozpojí a spojí, tím uvolní pnutí, doxorub. inhibuje krok 2 - spojení - fragmentace DNA Mechanismy působení konvenčních cytostatik 3. Protinádorová antibiotika* -Doxorubicin - interkaluje mezi řetězce DNA - indukuje vznik volných radikálů - blokuje topoizomerázu II 4. Rostlinné alkaloidy blokují tvorbu vřeténka vazbou na mikrotubuly -Vinca alkaloidy (z Vinca rosea; barvínek růžový) - depolymerizace mikrotubulů - rozpad vřeténka, Kamptotecin - blok topoizomerázy I -Taxány - (jehličí tisu - Taxus), Paklitaxel - blok depolymerizace mikrotubulů (karcinom prsu, vaječníku) *protinádorová antibiotika v tomto kontextu neoznačují antibakteriální látky topoizomeráza: rozmotává DNA při replikaci http://lh4.ggpht.com/-DgINNHV0Lqo/UUwTU6WolOI/AAAAAAAAFIU/VgRn4R1cgP4/image_thumb%255B18%255D.png?i mgmax=800 alternativnà popis obrázku chybà Image result Cílená terapie - příklady Tyrozin kinázové inhibitory (TKIs) - obsazení ATP vazebného místa - vysoká strukturní variabilita umožňuje specifickou vazbu - nevedou k úplnému vyléčení :( - Gefitinib - karc. plic, ledvin, solidní tumory - Erlotinib - karc. vaječníku - Imatinib, Dasatinib, Nilotinib - léčba CML Farnezyltransferázové inhibitory (FTIs) inhibice funkce Ras (trvale zapnutý v nádorech) -Lonafarnib, Tipifarnib, BMS-214662 •Cílená terapie Chronické Myeloidní Leukemie (CML) •Fúzí protoonkogenu ABL a BCR vzniká abnormální gen, jehož translačním produktem je konstitutivně aktivní cytoplazmatická bcr-abl tyrozinová kináza, která narušuje řadu signálních drah a způsobuje leukemický fenotyp buňky. •Over-exprese tyrozinkinázy Bcr-Abl v CML způsobuje: •cytokin-independentní přežití a růst buňky, prokázána onkogenní adikce •chrání buňku před apoptózou v odpovědi na růstové faktory nebo poškození DNA TKI cílené na Bcr-Abl inhibice MEK FTI X Cílená terapie CML pavel_brazek Rakovinná kmenová buňka v klidovém stavu zodpovědná za relaps Indukce vstupu kmenové buňky v klidovém stavu do b. cyklu V kombinaci s konvenční chemoterapií Oxid arsenitý (As2O3, arsenic trioxide, 1865 Fowler solution) -reversibilně snižuje expresi PML proteinu (klidový stav skrze represi mTOR) → indukuje kmenové buňky v klidovém stavu ke vstupu do cell cycle, bez vyvolání apoptózy -léčba PML a CML kmenová buňka v klidovém stavu konvenční chemo, TKIs relaps kmenová buňka v klidovém stavu cycling konvenční chemo, TKIs regrese cílení na leukemické buňky v klidovém stavu může být užitečnější než na proliferující b. PML - Promyelocytic leukemia protein, PML = akutní promyelocytická leukemie, CML = chronická myeloidní leukémie Radionuklid přinese letální dávku záření pro buňku immunocytokiny stimulují imunitní systém v liposomu je drug, postupně se uvolňuje Imunoterapie Monoklonální protilátky - specifické protilátky (Ab) proti vybraným antigenům na povrchu buněk a) Naked: po navázání mohou blokovat daný receptor, nebo aktivovat buňky imunitního systému b) Konjugované: s toxinem, radioizotopem, cytokinem https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/66/Monoclonal_antibodies.svg/2000px-Monoclon al_antibodies.svg.png MAb - monoclonal antibody ADCC - antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity CDC - complement-dependent cytotoxicity EGFR, gen 7q22 - amplifikace, mutace, nadprodukce GF - negativní prognostický marker aktivován EGF a TGF-α, přes Grb-2, SOS, RAS - RAF - MEK - ERK - TF: Fos, Jun - cyklin D1 - progrese buněčného cyklu Imunoterapie Monoklonální protilátky -Herceptin - anti-HER-2 (rakovina prsu - 30% amplifikace genu pro receptor HER-2) •účinnou složkou je sloučenina trastuzumab -Rituximab - anti-CD20, maligní B-lymfomy, B-lymf. CLL, folikulární lymfom -Gemtuzimab - anti-CD33 (na větš. leuk. b.), AML, konjugace s ATB colcheamicinem -Cetuximab - anti-EGFR, konjugace s toxinem, internalizace do buňky, kolorektalní karc. http://media.pharmacologycorner.com/wp-content/uploads/2009/05/her2neu-thumb.gif Vybrané mutace v nádorových onemocněních: Ras - 25 % všech nádorů aktiv telomeráza - 90 % nádorů K-Ras - 80 % karcinom pankreatu p53 - nejčastěji inaktivovaný v nádorech - různé nádory, Li-Fraumeni p16 - melanom Rb - retinoblastom t(8;14) aktiv Myc - B-cell CLL, ALL, Burkittův lymfom N-Myc amplif. - 30 % neuroblastom β-katenin (WNT) - kolorektální karcinom (mutovaný katenin necitlivý k APC, transkripce genů cc) TGF-β, SMAD4 - rezistence k antiproliferačním signálům Fas receptor - nádor Bax - nádory trávícího traktu a leukemie Bcl-2 translokace - folikulární lymfom loss chr10, inakt PTEN - glioblastom zisk chr7, dupl MET - karcinom ledvin t(9;22) Bcr-Abl - CML, ALL (30 %), vzácně AML transl. RAR - akutní PML autokrinní TGF - sarkom autokrinní PDGF - glioblastom overexpr EGFR/ERBB - karcinom prsu, žaludku, kolorekta overexpr HER2 - karcinom prsu (predikce - herceptin Ab proti receptoru HER2) PML/RARA - váže histondeacetylázy, které znemožní transkripci ATRA cílových genů Markery: CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, CD90