Molekulární biologie pro informatiky - 3 Replikace genomu, reparace a rekombinace DNA Replikace DNA Schopnost buňky přežít a množit se závisí na přesném zdvojení genetického materiálu. Při každém dělení musí buňka zkopírovat svůj genom s mimořádnou přesností a dostatečnou rychlostí. http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Replikace DNA je umožněna párováním bází. Komplementarita řetězců v dsDNA umožňuje, aby po separaci řetězců sloužil každý z nich jako templát pro syntézu nového vlákna. Řetězec S Původní dsDNA Řetězec S´ Templátový řetězec S Nový řetězec S´ Nový řetězec S Templátový řetězec S´ Replikace Replikace Replikace Replikace DNA 1.iniciace - zahájení replikace (ori), vazba replikačních proteinů, tvorba replikační vidlice 2.elongace - syntéza řetězce DNA 3.terminace - zakončení replikace daného replikonu místo ori jednořetězcová oblast templátové DNA Počátek replikace (místo ori) •specifická sekvence DNA bohatá na AT páry •vazba iniciačních proteinů otvírá strukturu dsDNA •vazba dalších proteinů zodpovědných za replikaci •přítomen na každém replikonu •u bakterií - 1x na chromozomu •u člověka - 10.000x na jaderné DNA - 220x na chromozom http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Replikace DNA Replikační vidlice •struktura DNA ve tvaru „Y“ během replikace •dvousměrná replikace - dvě vidlice pohybující se v opačných směrech od místa ori •rychlost pohybu - bakterie ̴ 1000 nukleotidů / s - člověk ̴ 100 nukleotidů / s DNA polymeráza •tvorba nové DNA dle jednoho z původních řetězců •připojení nukleotidů k 3´konci rostoucího řetězce DNA •tvorba fosfodiesterové vazby mezi dNTP a DNA http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf ori replikační vidlice templátová DNA nová DNA místa ori relikační vidlice směr pohybu vidlic DNA-polymerázy •DNA-dependentní-DNA-polymerázy, 5´→ 3´ •vyžadují přítomnost primeru (DNA či RNA) 1. DNA-polymeráza I (Kornbergův enzym) •DNA-primer; odstranění RNA-primerů, syntéza DNA mezi Okazakiho fragmenty, opravy DNA • 2. DNA-polymeráza II •záložní polymeráza, opravy DNA Replikace bakteriální chromozomové DNA The 3|[prime]||[ndash]|5|[prime]| exonucleases 3. DNA-polymeráza III •2x katalytické jádro (α, θ, ε) - 8 nt/s •spojena v dimer (τ) - 20 nt/s •β-svorka - stabilizace úseků dsDNA •γ-komplex (γ2δδ´ψχ) - nakládání β-svorky na DNA v místech RNA-primerů •500 nukleotidů/s •procesivita pro celu molekulu DNA • 3´-5´ exonukleázová aktivita •RNA-primer; replikace DNA, opravy DNA http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf http://www.nature.com/nrm/journal/v3/n5/fig_tab/nrm804_F4.html DNA-helikáza •odvíjení komplementárních řetězců v dsDNA •DnaB-protein a n´-protein DNA-gyráza •topoizomeráza II •mění kladné nadšroubovicové závity na záporné Replikace bakteriální chromozomové DNA Templátová DNA Řetězec DNA RNA-primer Primáza DNA-primáza •DNA-dependentní-RNA-polymeráza, syntéza RNA-primerů DNA-ligáza •ligace polynukleotidových řetězců •spojení Okazakiho fragmentů http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf DNA-helikáza Nadšroubovice DNA DNA-gyráza Semikontinuální syntéza dsDNA při replikaci Vedoucí DNA řetězec •kontinuální syntéza na řetězci 3´→5´ •jeden RNA-primer v místě ori Opožďující se DNA řetězec •diskontinuální syntéza přes Okazakiho fragmenty na řetězci 3´→5´ •RNA-primer pro každý Okazakiho fragment, odbourány od 5´-konce •prodloužení Okazakiho fragmentů na 3´-konci, spojení do souvislého řetězce DNA http://www.bio.miami.edu/tom/courses/bil255/bil255goods/09_dna.html http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Směr pohybu replikační vidlice Místo spoje fragmentů Opožďující se řetězec Okazakiho fragment RNA-primer Vedoucí DNA řetězec Nově vytvořená DNA Templát pro vedoucí DNA řetězec Templát pro vedoucí DNA řetězec Templát pro opožďující se DNA řetězec Templát pro opožďující se DNA řetězec Iniciace replikace www.studyblue.com http://reasonandscience.heavenforum.org/t1849-dna-replication-of-prokaryotes Počátek replikace oriC - 13 bp tandemová repetice bohatá na AT páry - 9 bp repetice: vazba DnaA DnaA - rozeznání oriC, převod do otevřené formy DnaB - vazba na otevřený úsek DNA - odvíjení dsDNA, vznik replikačních vidlic SSB-proteiny - vazba na jednořetězcové úseky 13 bp - GATCTNTTNTTTT 9 bp - TTATNCANA 13 bp repetice 9 bp repetice Vazba a akumulace DnaA Ohyb DNA Separace DNA řetězců DnaA Vazba DnaB DnaB Odvíjení dsDNA Tvorba replikačních vidlic Elongace replikace www.studyblue.com http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf •vedoucí řetězec - RNA-primer na počátku replikace •opožďující se řetězce - RNA-primer na začátku každého Okazakiho fragmentu •primozom = komplex DnaB a DnaG (DNA-primáza) Koordinace syntézy obou DNA řetězců ve směru replikační vidlice •ohyb DNA, struktura DNA-polymerázy III •katalytická jádra umístěna každé na jednom matricovém řetězci •γ-komplex umístěn asymetricky, opakovaně nakládá β-svorky na opožďující se řetězec •pohyb katalytického jádra mezi jednotlivými β-svorkami vedoucí řetězec opožďující se řetězec nově vytvořená DNA SSB-protein nový Okazakiho fragment RNA-primer RNA-primer katalytické jádro katalytické jádro β-svorka DnaB DnaG DnaB katalytické jádro katalytické jádro β-svorka β-svorka β-svorka γ-komplex DnaG Elongace replikace http://i68.servimg.com/u/f68/17/30/76/23/prokar10.png Výsledek obrázku pro DNA ligase replication Tvorba souvislého řetězce z Okazakiho fragmentů DNA-polymeráza I - postupuje za DNA-polymerázou III - odbourává z 5´-konců RNA-primery - na 3´-konec následujícího Okazakiho fragmentu napojuje dNTP DNA-ligáza - spojuje doplněné fragmenty Vazba DnaA do místa oriC Odvinutí dsDNA Vazba DnaB, která pokračuje v odvíjení dsDNA DNA-gyráza uvolňuje napětí tvorbou záporných nadšroubovcových závitů SSB-proteiny udržují řetězce DNA oddělené a přístupné replikace Vytvoření replikační vidlice Vazba DnaG a syntéza RNA-primeru na vedoucím řetězci DNA-polymeráza III syntetizuje vedoucí řetězec Tvorba RNA-primeru na opožďujícím se řetězci DNA-polymeráza III syntetizuje opožďující se řetězec Tvorba dalších RNA-primerů na opožďujícím se řetězci DNA-polymeráza III syntetizuje Okazakiho fragmenty DNA-polymeráza I odstraňuje RNA-primery a zaplňuje jejich místo DNA DNA-ligáza spojuje přilehlé Okazakiho fragmenty do souvislého řetězce Terminace replikace academic.pgcc.edu faculty.samford.edu www.brighthubeducation.com schaechter.asmblog.org http://academic.pgcc.edu/%7Ekroberts/Lecture/Chapter%207/07-06_BidirectionalRep_L.jpg http://faculty.samford.edu/%7Edjohnso2/44962w/405/06/CELL4e-Fig-06-02-0.jpg •terminátor replikace, ter •vazba specifických proteinů, které inhibují DnaB a zastavují tvorbu replikační vidlice •topoizomeráza typu II odděluje vzniklé chromozomy http://img.bhs4.com/c8/d/c8d02b1866e0a8632e85f27896fae400bf76906a_large.jpg http://schaechter.asmblog.org/.a/6a00d8341c5e1453ef016766b39f1e970b-500wi Replikační vidlice Obousměrná replikace oriC ter Replikační vidlice Replikační vidlice Dceřiný řetězec Matricový řetězec Replikace plazmidů otáčivou kružnicí •v místě ori štěpí Rep-protein (+) řetězec •vzniklý 3´-konec prodlužován, vytlačení (+) řetězce •zlom (+) řetězec mezi původní a novou DNA, ligace •vzniká (i) kružnicová dsDNA (ii) kružnicová ssDNA (doplnění přes Ok. fr.) Replikace plazmidové DNA http://thegeneticsofvirusesandbacteria.weebly.com/uploads/2/3/0/0/2300348/9945723.bmp www.studyblue.com http://thegeneticsofvirusesandbacteria.weebly.com/diagrams.html Replikace konjugativních plazmidů během konjugace •replikaci otáčivou kružnicí, vytlačovaný (+) řetězec přestupuje do recipientní buňky •(-) řetězec zůstává v donorové buňce, kontinuální syntéza •(+) řetězec se v recipientní buňce dosyntetizuje přes Okazakiho fragmenty Zlom Replikace Replikace Zlom Ligace Podobné rysy jako u replikace bakteriálního chromozomu: •semikonzervativní a semikontinuální •replikační vidlice, replikační proteiny •iniciace, elongace a terminace • Odlišnosti od replikace prokaryot: •replikace omezena do S-fáze buněčného cyklu •přítomnost nukleozomů •mnohonásobná místa počátku replikace •problém s doreplikováním konců lineární molekuly DNA Replikace chromozomové DNA u eukaryot Druh Velikost genomu (bp) Rychlost syntézy DNA (kbp/min) Počet počátků replikace E. coli 4,6 x 106 30 1 S. cerevisiae 1,4 x 107 3 330 D. melanogaster 1,8 x 108 2,6 3.500 Mus musculus 2,5 x 109 2,2 25.000 Homo sapiens 3,2 x 109 3 >10.000 ? sphweb.bumc.bu.edu http://www.authorstream.com/Presentation/Mansoornabi513-1223311-dna-replication-in-eukaryotes/ Syntéza DNA Sesterské chromatidy DNA-polymerázy u eukaryot nalezeno nejméně 13 druhů α, δ, ε replikace jaderné DNA β opravy DNA γ replikace mitochondriální DNA τ, κ, η, … funkce neznámá DNA-polymeráza α •tetramer (RNA-primáza), tvorba RNA-primerů a části Okazakiho fragmentů •mírná procesivita, 5´-3´ exonukleázová aktivita DNA-polymeráza β •monomer, syntéza krátkých řetězců při reparaci DNA •nízká procesivita, 5´-3´ exonukleázová aktivita DNA-polymeráza γ •dimer, syntéza mitochondriální DNA •vysoká procesivita, 5´-3´ a 3´-5´ exonukleázová aktivita DNA-polymeráza δ •interakce s proteiny RCF a PCNA, dokončení syntézy Okazakiho fragmentů •vysoká procesivita v asociaci s PCNA-proteinem, 5´-3´ a 3´-5´ exonukleázová aktivita DNA-polymeráza ε •úzce souvisí s δ, hlavní polymeráza pro syntézu vedoucího řetězce Replikace chromozomové DNA u eukaryot Replikační počátky po 1 - 300 kbp •na savčích chromozomech bez specifických sekvencí, bohaté na AT páry, 500 - 50.000 bp Iniciace replikace https://en.wikipedia.org/wiki/Eukaryotic_DNA_replication#/media/File:Pre-replicative_complex.JPG Pre-iniciační komplex •sestaven v G1 fázi buněčného cyklu •replikační počátek rozeznán proteinem ORC •vazba CDC6, CDT1, MCM2-7 Při vstupu do S-fáze jsou složky pre-iniciačního komplexu fosforylovány, uvolnění už nepotřebných složek, aktivace MCM2-7 Iniciační komplex •Mcm2-7 spolu s dalšími proteiny (CDC45, GINS) plní funkci DNA-helikázy •vazba DNA-polymeráz do replikační vidlice Výsledkem iniciace je založení replikační vidlice s navázanými proteiny, které se budou účastnit elongační fáze replikace. G1 G1 / S S Vedoucí řetězec •jediný primer vytvořený DNA-polymerázou α •RCF-protein nakládá PCNA na konec RNA-primeru •PCNA-protein vytěsňuje DNA-polymerázu α a zvyšuje procesivitu DNA-polymerázy ε, která se na něj váže a syntetizuje DNA Elongace replikace www.leibniz-fli.de Opožďující se řetězec •RPA pokrývá jednořetězcové úseky DNA •DNA-polymeráza α tvoří RNA-primer (10 nt) a část Okazakiho fragmentu (10-20 nt) •PCNA vytlačuje DNA-polymerázu α •RNázaH odstraňuje RNA-primery z 5´-konce •DNA-polymerázou δ dokončuje Okazakiho f. •DNA-ligáza spojuje Okazakiho f. Složky bakteriálního a eukaryotického replizomu Funkce Bakterie Eukaryota Rozpoznání ori DnaA ORC Vazba helikázy k DNA DnaC CDT1, CDC6 Helikáza DnaB MCM komplex Relaxace DNA DNA-gyráza Topoizomeráza II Ochrana ss řetězců SSB RPA Primáza DnaG Polα Syntéza vedoucího řetězce Pol3 Polε Syntéza opožďujícího se řetězce Pol3 Polα, Polδ Posuvná svorka β-svorka PCNA Nakládání svorky γ-komplex RCF Odstranění RNA-primeru Pol1 RnázaH Dokončení Okazakiho fragmentů Pol1 Polδ Spojení Okazakiho fragmentů DNA-ligáza DNA-ligáza Problém zakončení replikace lineárních dsDNA •po odstranění RNA-primeru na 3´-konci matricového řetězce pro opožďující se řetězec vzniká prázdné místo, které DNA-polymeráza nedokáže zaplnit •bez strategie, jak tento úsek doreplikovat by docházelo ke zkracování chromozomů a ztrátě genetické informace Terminace replikace http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/dna.html med.stanford.edu http://med.stanford.edu/content/dam/sm-news/images/2015/01/telomeres.jpg Telomery •druhově specifické repetitivní sekvence •udržovány telomerázou, bez ní dochází ke zkracování telomer ( ̴50-150 bp / dělení) •senescence či smrt buněk po zkrácení telomer pod kritickou hranici •ochrana chromozomů před degradací •rozeznány jako skutečné konce chromo-zomů, odlišeny od dvouřetězcových zlomů uprostřed chromozomů Telomeráza •ribonukleoproteinový komplex složený z (i) RNA (templát) (ii) RNA-dependentní-DNA-polymeráza •vazba k přečnívajícímu 3´-konci DNA přes RNA •tento konec je využit jako primer a podle RNA matrice prodloužen o telomerické sekvence •syntéza tandemových repetic zajištěna trans-lokací telomerázy podél vznikajícího řetězce •na prodlouženém 3´-konci vytvoří replikační enzymy další Okazakiho fragment •původní délka chromozomu je zachována •přítomna v zárodečných/kmenových buňkách, nepřítomna v somatických buňkách •reaktivace v nádorových buňkách Terminace replikace http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/dna.htm http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/telom02.jpg Ochrana přečnívajících 3´-konců chromozomů •telomerické sekvence se ohýbají a vytvářejí strukturu telomerické smyčky (T-smyčka) •ssDNA na konci řetězce se zanořuje do dsDNA úseku a tvoří trojvláknovou strukturu (D-smyčka) •celou strukturu stabilizuje komplex proteinů = shelterin - ochrana před endonukleázami, potlačení oprav DNA, regulace telomerázy Terminace replikace www.researchgate.ne www.ch.ic.ac.uk https://www.researchgate.net/profile/Wiek_Van_Gilst/publication/26814517/figure/fig2/Schematic-repr esentation-of-the-telomere-shelterin-complex-and-its-associated-proteins.png http://www.ch.ic.ac.uk/local/projects/burgoine/t-loop.gif Replikativní senescence •způsobena zkrácením telomer a rozpadem T-smyčky •buňky zastaví růst, vstoupí do senescence nebo spustí apoptózu •obrana před nestabilitami v genomu a vývojem nádorů (telomery by byly rozeznány jako poškození DNA, odhalené konce by mohly vést k fúzi chromozomů) Nukleozomy během replikace Během G1 a S fáze buněčného cyklu syntetizovány histony nutné pro zdvojení nukleozomů během replikace DNA. •rozpad nukleozomů během replikace •rychlé opětovné sestavení •nové oktamery jsou náhodnou směsí původních a nových histonů A B Izolace oktamerů Izolace oktamerů Centrifugace Centrifugace „Lehké“ médium Replikace Jeden pruh, oktamery s „težkými“ AK Široký pruh, oktamery se směsí starých a nových histonů („těžké“, „lehké“ AK) http://www.jbc.org/content/280/13/12065.full http://www.nature.com/nsmb/journal/v22/n8/full/nsmb.3067.html?WT.ec_id=NSMB-201508&spMailingID=4925 4359 H3-H4 tetramer H3-H4 dimer De novo začlenění Rozpad Recyklace Směr replikační vidlice Přesnost replikace DNA Chybovost DNA-polymerázy: 1 chyba na 107 bází Přesnost replikace zajištěna párováním bází a vlastnostmi DNA-polymerázy (i) přednostní připojení nt se správným párováním (ii) odstranění chybného nt procesem zvaným proofreading Proofreading •kontrola správného párování začleněných nukleotidů během replikace •špatně začleněný nukleotid odstraněn 3´-5´ exonukleázovou aktivitou •polymerační a korekční aktivita DNA-polymerázy zajištěna různými katalytickými doménami enzymu DNA-polymeráza Templátový řetězec Připojení chybného nukleotidu Odstranění chybného nukleotidu Správně párovaný 3´-konec umožňuje připojení dalšího nukleotidu http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf http://reasonandsc Molekulární podstata mutageneze •zachování genomu buněk vyžaduje - přesnost replikace DNA - schopnost opravit poškozenou DNA •mutace jsou dědičné změny genotypu, jejichž molekulární podstatou jsou nukleotidové substituce, delece a inzerce Substituce •výměna nukleotidu •synonymní substituce: vznik kodónu se stejným smyslem AAG (Lys) ---> AAA (Lys) •nesmyslná mutace: vznik terminačního kodonu AAG (Lys) ---> TAG (STOP) •neutrální substituce: změnou aminokyseliny se nemění konformace peptidového řetězce AAG (Lys) ---> AGG (Arg) •mutace měnící smysl kodonu AAG (Trp) ---> ACG (Thr) www.bbc.co.uk Substituce Inzerce Delece Standardní alela: převládá v populaci, funkční Mutantní alela: četnost v populaci nepřesahuje 1 %, nemusí být funkční Spontánní mutace: vznikají bez účinku mutagenu Indukované mutace: vyvolané mutagenem Mutagen •fyzikální nebo chemické agens vyvolávající mutace, působí genotoxicky, poškozují genotyp •promutagen přeměněn na mutagen metabolickou aktivací Molekulární podstata mutageneze Delece, inzerce •ztráta / vložení nukleotidu(ů) •posunové mutace: změna čtecího rámce Figure 17.24d Wild type DNA template strand 3′ T A C T T C A A A C C G A T T 5′ 5′ A T G A A G... Figure 17.24e Wild type DNA template strand 3′ T A C T T C A A A C C G A T T 5′ 5′ A T G A A G... Figure 17.24f Wild type DNA template strand 3′ T A C T T C A A A C C G A T T 5′ 5′ A T G A A G... DNA RNA protein jednonukleotidová inzerce jednonukleotidová delece trinukleotidová delece http://www.slideshare.net/kristenw3/mutations-13330478 Chybné páry bází mohou vzniknout během replikace díky chemickým vlastnostem bází a těmto dějům: 1.Tautomerní změny bází •stabilní tautomery podléhají Watson-Crickovu párování •přechodné tautomery mohou tvořit páry AC, GT •frekvence výskytu 10-4 - 10-5 / na nukleotid a replikační cyklus Pokud není chybné párování bází opraveno, dochází při dalších replikacích k fixaci mutace. Spontánní mutace První replikace Nestabilní pár Mutantní molekula Standardní molekula Fixovaná mutace Druhá replikace Standardní molekula Standardní molekula Ketamin-Enamin-Tautomerie Adenin.svg Cytosine.jpg Thymine taut.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/eb/Lactam-Lactim-Tautomerie_Hypoxanthin.svg/ 2000px-Lactam-Lactim-Tautomerie_Hypoxanthin.svg.png Tymin KETO forma ENOL forma Guanin KETO forma ENOL forma Cytozin AMINO forma IMINO forma Adenin AMINO forma IMINO forma https://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Nucleic_Acid/Nitrogenous_Bases 2. Kolísavost párování bází •vznik párů CT, GA, TG 3. Depurinace a depyrimidinace •přerušení glykosidické vazby mezi bází a cukrem, ztráta báze, vznik AP místa •po replikaci může vzniknout substituce (přednostně A) či delece •několik tisíc událostí / den v genomu savců Spontánní mutace biotechkhan.wordpress.com http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf www.mun.ca Mutantní molekula Standardní molekula Delece Depurinace A 4. Deaminace Spontánní mutace 5. Inkorporace uracilu do DNA •místo tyminu, odstraňován uracil-DNA-glykosylázou 6. Oxidativní poškození DNA •vyvolává především hydroxylový radikál (OH●) •8-oxodeoxyguanozin (8-OxodG) se přednostně páruje s A •tyminglykol zastavuje replikaci Cytozin Adenin Guanin Uracil Hypoxantin Xantin + Adenin + Cytozin blok replikace DNA GC ---> AT AT ---> GC www.mdpi.com Indukované mutace - chemomutageny Analogy bází •purinové a pyrimidinové deriváty •např. 5-brómuracil: analog tyminu, AT ---> GC 5-Bromouracil bp.svg http://wiki.chemprime.chemeddl.org/images/2/29/Nitrous_Acid_Reacting_Directly_with_DNA,_Converting_ Cytosine_to_Uracil_.jpg Kyselina dusitá (HNO2) •oxidativní deaminace bází, AT <---> GC •vznik v žaludku z NaNO3 Hydrogensiřičitan (HSO3-) •deaminace C, GC ---> AT http://pubs.rsc.org/services/images/RSCpubs.ePlatform.Service.FreeContent.ImageService.svc/ImageSer vice/Articleimage/2014/AN/c3an02154h/c3an02154h-f1_hi-res.gif http://slideplayer.com/slide/2816043/ https://en.wikipedia.org/wiki/5-Bromouracil wiki.chemprime.chemeddl.org pubs.rsc.org Indukované mutace - chemomutageny Alkylační látky •alkylace nukleofilních center bází DNA, atomy dusíku a kyslíku •jednofunkční - jedna reaktivní skupina, alkylace bází, změna párování - př. ethylmetansulfonát (EMS) http://images.slideplayer.com/2/685191/slides/slide_31.jpg http://www.pharmacopeia.cn/v29240/images/v29240/g-190.gif http://www.atdbio.com/img/articles/cisplatin-mechanism-large.png •dvojfunkční - dvě reaktivní skupiny, křížové vazby mezi dvěma nukleofilními centry - zástava replikace DNA, př. yperit (hořčičný plyn) yperit cisplatina https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0a/Cross-linked_DNA_by_nitrogen_mustard.png http://www.benbest.com/health/mustard.gif http://www.atdbio.com/img/articles/cisplatin-mechanism-large.png http://www.rnceus.com/chem/images/cross_link.gif http://www.atdbio.com/img/articles/cisplatin-mechanism-large.png Indukované mutace - chemomutageny Psoraleny •interkalace mezi sousední nukleotidy, posunové mutace •fotoreaktivace UVA světlem vede k tvorbě monoaduktů a křížových vazeb na DNA, zástava replikace Psoralen Interkalace Monoadukt Křížová vazba Xantotoxin DNA DNA Monoadukt Křížová vazba UVA (1. foton) UVA (2. foton) http://www.google.com/patents/US6187572 http://www.nature.com/bmt/journal/v33/n1/fig_tab/1704284f2.html https://www.researchgate.net/figure/49739612 Polyaromatické uhlovodíky •interkalace do dsDNA, metabolickou aktivací vznikají epoxidy, které tvoří monoadukty s DNA •př. benzo(a)pyren Metabolická aktivace Benzo(a)pyren (BaP) Benzo(a)pyrene diolepoxide (BPDE) + DNA Promutageny jsou samy o sobě neškodné. Vyžadují metabolickou aktivaci, aby se staly mutageny. Benzo(a)pyren •produkt nedokonalého spalování •uhelný dehet, výfukové plyny, cigaretový kouř, grilované maso •vznik epoxidů tvořících adukty s DNA 2-acetylaminofluoren (AAF) •původně vyvinut jako insekticid •vznik N-hydroxy-2-aminofluorenu tvořícího adukty s DNA •nádory jater, močového měchýře, ledvin Aflatoxiny •mykotoxiny produkované plísněmi rodu Aspergillus •kontaminované potraviny (obilniny, olejniny, koření, ořechy) •aflatoxinu M1 jeden z nejsilnějších jaterních mutagenů Dusičnany, dusitany •hnojiva, potravinové konzervanty; potraviny rostlinného i živočišného původu •vznik nitrosaminů, které modifikují báze DNA a mění jejich párování Indukované mutace - promutageny http://pubs.rsc.org/is/content/articlehtml/2015/tx/c4tx00126e http://images.slideplayer.cz/11/3030304/slides/slide_5.jpg http://images.slideplayer.cz/11/3030304/slides/slide_5.jpg Ionizující záření •záření s dostatkem energie pro ionizaci atomů a molekul ozářené látky •gama záření, paprsky X, část UV záření •vyvolává vznik modifikovaných bází, křížových vazeb a zlomů DNA Indukované mutace - fyzikální mutageny (ii) přímý účinek (35 % poškození) - DNA absorbuje energii a ionizuje se, štěpení vazeb a zlomům DNA - př. ozáření dávkou 1 Gy vyvolá v buňce 15 - 60 ds zlomů, > 1000 ss zlomů Ionizující záření Neionizující záření (i) nepřímý účinek (65 % poškození) - ionizace vody a vznik vysoce reaktivních radikálů - modifikace bází: hydroxylace, deaminace, demethylace http://slideplayer.cz/slide/1968755/ http://labguide.cz/fluorochromy/ 2012.igem.org teachnuclear.ca ss zlom ds zlom Indukované mutace - fyzikální mutageny Ultrafialové záření •nižší energie a specifičtější účinek než ionizující záření, absorpční maximum bází při 254 nm (i) zvýšení frekvence spontánních mutací (ii) tvorba pyrimidinových dimerů - dimerizace dvou sousedních pyrimidinových molekul (nejčastěji tyminové dimery) - kovalentní spojení přes cyklobutanový kruh či (6-4) pyrimidinové fotoprodukty - narušena struktura DNA a replikace UV Sousedící tyminy Cyklobutanový pyrimidinový dimer (6-4) pyrimidinový fotoprodukt earthobservatory.nasa.gov kb.osu.edu Opravy poškozené DNA V buňkách existují mechanismy, pomocí kterých buňka rozezná a úplně nebo do určité míry odstraní poškození DNA. Tyto opravné mechanismy jsou katalyzovány různými sadami enzymů. Schopnost opravit poškozenou DNA je zásadní pro udržení integrity genomu buněk a pro normální fungování mnohobuněčného organismu. Typy oprav DNA •úplná oprava - oprava na původní stav bez syntézy DNA •excizní oprava - vyštěpení poškozeného místa, syntéza nepoškozené DNA •tolerantní oprava - obnova funkce DNA bez opravy poškození Ionizující záření Kyslíkové radikály Alkylační činidla Spontánní mutace Uracil v DNA AP místo 8-OxodG ss zlom UV záření Polyaromatické uhlovodíky Tyminový dimer (6-4) fotoprodukt Adukty s bázemi Ionizující záření cis-platina Křížové vazby ds zlomy Replikační chyby Substituce Inzerce Delece Zástava buněčného cyklu Inhibice transkripce, replikace, segregace chromozómů Apoptóza, smrt buňky Mutace, chromozomové aberace Vrozené choroby, nádorová onemocnění, stárnutí Senescence http://www.nature.com/scitable/content/dna-damage-repair-mechanisms-and-consequences-14459141 Fotoreaktivace •odstranění pyrimidinových dimerů v DNA vyvolaných UV zářením •katalyzována fotolyázou (aktivace VIS o vlnové délce 340 - 400 nm) •fotolyáza štěpí cyklobutanový kruh v pyrimidinovém dimeru •fylogeneticky konzervativní mechanismus, u savců excizní oprava Úplné opravy DNA Přímá oprava alkylovaných bází O6-metylguanin-DNA-metyltransferáza •u lidí MGMT, u bakterií Ada, „sebevražedný enzym“ •demetylace O6-metylguaninu na guanin, přenos metyl skupiny na vlastní Cys •deficity MGMT nalezeny u nádorů děložního hrdla, kolorekta, žaludku, jater, glioblastomu Zheyun Liu et al. PNAS 2011;108:14831-14836 aktivní inaktivní MGMT https://quizlet.com/11580914/chapter-25-slides-flash-cards/ Excizní opravy DNA Třístupňový proces: 1. rozpoznání a vyštěpení poškozené DNA (nukleázy) 2. zaplnění mezery správnými nukleotidy (DNA polymerázy) 3. spojení zlomu v cukr-fosfátové páteři (DNA ligázy) deaminace C AP místo 1nt mezera opravená DNA Uracil DNA glykosyláza AP endonukleáza DNA polymeráza DNA ligáza https://www.studyblue.com/notes/note/n/chapter-5-dna-replication-repair-and-recombination/deck/6250 485 Bázová excizní oprava (BER) •oprava poškozených bází, odstranění U •DNA glykosyláza - rozeznání a odstranění nevhodné báze, tvorba AP míst •AP endonukleáza - vyštěpení AP místa, tvorba 3´-OH •DNA polymeráza - připojení správného nukleotidu - Polβ u eukaryot, Pol1 u prokaryot •DNA ligáza - spojení řetězce •zvýšené riziko kolorektálních nádorů u mutací Polβ, DNA glykosylázy Excizní opravy DNA Nukleotidová excizní oprava (NER) •oprava rozsáhlejšího poškození DNA, které mění a deformuje dvoušroubovici DNA •adukty bází, UV fotoprodukty Bakterie •rozeznání poškozeného místa UvrAB •vyštěpení poškozeného místa UvrBC •uvolnění vyštěpeného úseku UvrD •dosyntetizování chybějící DNA Pol1 •spojení řetězce LigA Člověk •rozeznání poškozeného místa XPA, XPC, XPE; CSA, CSB •odvinutí DNA XPB, XPD •vyštěpení poškozeného místa XPF, XPG •dosyntetizování chybějící DNA Polδ/ε • spojení řetězce DNA ligáza I Tymidinový dimer UvrA UvrB Rozpoznání UvrB UvrC Vyštěpení Odstranění UvrD DNA polymeráza I Syntéza DNA LigA Ligace https://en.wikipedia.org/wiki/Nucleotide_excision_repair#/media/File:A_schematic_representation_of_ models_for_the_nucleotide_excision_repair_pathway Excizní opravy DNA •deficity v NER mechanismech geneticky podmiňují některé syndromy Xerodema pigmentosum - autosomálně recesivní choroba, nejčastěji deficit XPA, XPC - extrémní citlivost k slunečnímu záření - > 1000 x zvýšeno riziko vzniku kožních nádorů Cockaynův syndrom - autosomálně recesivní choroba, deficit CSA, CSB - fotosenzitivita, trpaslictví, retinitis pigmentosa Rozpoznání poškození NER spjatá s transkripcí Obecná NER Odvinutí DNA Vyštěpení Syntéza DNA Ligace Xeroderma pigmentosum Cockaynův syndrom http://www.schumacher-lab.cecad.uni-koeln.de/ Excizní opravy DNA E. coli •Dam metyláza metyluje A v sekvenci GATC •těsně po replikaci hemimetylovaný stav •rozpoznání chybného nukleotidu (MutS) •navázání opravných enzymů (MutL , MutH) •MutH štěpí řetězec s nemetylovanou GATC •exonukleáza s helikázou a SSB proteiny odstra-ňuje naštěpený řetezec až k chybnému nt •syntéza DNA podle původního řetězce (Pol3) •spojení řetězce (DNA ligáza) •opravný systém používán i u eukaryot a člověka, mutace v opravných genech zvyšují riziko rakoviny http://www.slideshare.net/najmhemato/dna-repair MutS, MutL MutH MutH MutH Exonukleáza Helikáza II SSB Helikáza II Exonukleáza Exonukleáza DNA pol III DNA ligáza Opravy dvojřetězcových zlomů Large image of Figure 4. Štěpení cukr-fosfátové kostry a dvouřetězcové zlomy indukovány ionizujícím záření, chybami v replikační vidlici, působením některých chemikálií. Nebezpečí fragmentace chromozomů, přestaveb genomu, ztráty genetické informace. Nehomologní spojování konců (NHEJ) •v G1 fázi buněčného cyklu, před replikací DNA •zarovnání zlomených řetězců a následné znovu spojení •náchylné k chybám, možná ztráta nukleotidů - Spojení konců přes mikrohomologii (MMEJ) •v brzké S fázi buněčného cyklu •úprava konců, která odhalí krátkou oblast homologie •párování homologní oblasti, spojení řetězců Homologní rekombinace (HR) •v S/G2 fázi buněčného cyklu, po replikaci DNA •bezchybná oprava bez ztráty genetické informace http://www.cell.com/trends/biochemical-sciences/fulltext/S0968-0004%2815%2900158-9 Homologní rekombinace Dva modely oprav ds zlomů DNA •Hollidayův model (DSBR, double-strand break repair) •nasedání závislé na syntéze (SDSA, synthesis-dependent strand annealing) Prostupování řetězců Tvorba D smyčky Syntéza DNA Přpojení volného konce Syntéza DNA Spojení řetězců Posun a zrušení Hollidayova spoje Nebo Tvorba převislých konců ds zlom Syntéza DNA Spojení řetězců Obnova původního řetězce www.genetika-biologie.cz By Emw2012 - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=5668312 Člověk •rozpoznání zlomů a úprava vzniklých konců - BRCA2, Rad52, Rad54, Rad51 •nukleoproteinové vlákno - Rad51 •helikázy (RecQ), nukleázy, topoizomerázy •deficity v procesech HR spjaty s tvorbou nádorů, početními chromozom. abnormalitami http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6f/MajorEventsInMeiosis_variant_int.svg/500px -MajorEventsInMeiosis_variant_int.svg.png Opravy poškozené DNA Při selhání replikačních a opravných mechanismů dochází ke vzniku mutací. Záměna pouhého jednoho nukleotidu může vážně poškodit zdatnost a zdraví organismu. - např. srpkovitá anémie Změny DNA v zárodečných buňkách přenášeny na potomstvo. Změny DNA v somatických buňkách mohou vést ke vzniku nádorových onemocnění. Pravděpodobnost akumulace dostatečného množství mutací pro vznik nádoru roste s věkem. Chyby v opravných mechanismech zvyšují frekvenci spontánních mutací a citlivost buněk k mutagenů. Nalezeno přes 30 mutací v genech pro opravy DNA, které zvyšují riziko vzniku nádoru. Využití chemických i fyzikálních mutagenů při léčbě nádorových onemocnění (chemoterapie, radioterapie). HbA HbS Malárie Srpkovitá anémie http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf http://www.understandingrace.org/humvar/sickle_01.html Věk (rok) Shrnutí •Před tím než se buňka rozdělí, musí replikovat veškerou genetickou informaci uloženou v DNA. •Vlákna v dvouřetezcové DNA jsou navzájem komplementární, každé z nich proto může sloužit jako templát pro syntézu dalších vláken. Během replikace DNA vznikají dvě úplně stejné molekuly, což umožňuje kopírovat genetickou informaci a předávat ji do dceřiných buněk a z rodičů na potomstvo. •Během replikace DNA se vlákna dvoušroubovice oddělují za vzniku replikační vidlice ve tvaru „Y“. DNA polymeráza na každém z vláken vytvoří nový komplementární řetězec DNA. •DNA polymeráza syntetizuje DNA pouze v jednom směru, takže pouze vedoucí řetězec může být v replikační vidlici tvořen nepřerušovaně. Na opožďujícím se řetězci probíhá syntéza DNA přerušovaně, ve formě krátkých fragmentů, které jsou následně spojeny do souvislého řetězce. •Syntéza DNA začíná od krátkých RNA primerů, které jsou následně odstraněny a nahrazeny DNA. •Replikace DNA vyžaduje spolupráci mnoha proteinů, které tvoří multienzymový komplex pohybující se podél replikované DNA. •U eukaryot jsou konce chromozomů replikovány pomocí telomerázy. •DNA polymeráza se vyznačuje vysokou přesností replikace podporovanou proofreadingovou aktivitou. Případné chybné báze jsou opravovány pomocí oprav chybného párování bází. •Poškození DNA je opravováno řadou enzymů, které poškozené místo rozeznají, odstraní a nahradí novou DNA, která se tvoří podle nepoškozeného templátu. •Dvouřetězcové zlomy DNA jsou opravovány v závislosti na fázi buněčného cyklu pomocí nehomologního spojování konců či homologní rekombinace. Vysvětlete vlastními slovy, proč se replikace DNA označuje jako „semikonzervativní“? Proč jsou telomery a telomeráza potřebné pouze pro replikaci eukaryotických chromozomů a prokaryotických ne? Která z následujících tvrzení jsou pravdivá? Vysvětlete svoji odpověď. a)Bakteriální replikační vidlice je asymetrická, protože obsahuje dvě DNA polymerázy, které se liší ve své struktuře. b)Okazakiho fragmenty jsou odstraňovány nukleázou, která degraduje RNA c)Frekvence replikačních chyb je snižována jak proofreadingovaou aktivitou DNA polymerázy tak opravou chybného párování bází. d)Při chybění oprav DNA jsou geny nestabilní. e)Žádná z chybných bází vzniklých deaminací se v DNA přirozeně nevyskytuje. f)Nádory mohou vznikat v důsledku akumulace mutací v somatických buňkách. Zvídavé otázky Zvídavé otázky •V jakém pořadí by denaturovaly následující molekuly DNA při postupném zahřívání jejich roztoku? • • • • •Rychlost syntézy DNA u E.coli je 100.000 nt / min. Replikace celého chromozomu trvá 45 minut. Kolik párů bází obsahuje chromozom E.coli? Jaká je přibližná délka tohoto chromozomu? •Haploidní genom D. melanogaster obsahuje 1,35 x 108 bp. Syntéza na jedné replikační vidlici probíhá rychlostí 30 bp/s. Obě kopie genomu se zreplikují behěm 5 minut. Kolik replikačních počátků je pro takto rychlou syntézu DNA potřeba? •Jaký bude konečný produkt nebo stav replikace, pokud bude mutací inaktivován následující enzym, a i přes tuto mutaci se bude buňka snažit zreplikovat DNA? a) DNA-polymeráza b) DNA-ligáza c) DNA-helikáza d) primáza A) 5´-CCGGGCCAGCCGGTGTGGGTTGCCGAGG - 3´ 3´-GGCCCGGTCGGCCACACCCAACGGCTCC - 5´ B) 5´-AGTGCTTGATCGAT - 3´ 3´-TCACGAACTAGCTA - 5´ C) 5´-ATTATAAAATATTTAGATACTATATTTACAA- 3´ 3´-TAATATTTTATAAATCTATGATATAAATGTT- 5´ http://cdn.phys.org/newman/gfx/news/hires/2012/mismatchrepa.jpg