Molekulární biologie 4. Transkripce Osnova 1. Transkripce (prokaryotického) bakteriálního genomu 2. Transkripce eukaryotického genomu 3. Posttranskripční úpravy RNA a mechanizmy sestřihu Transkripce (přepis) genetické informace z DNA do RNA Hlavní zdroje: S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie 1-4 Masarykova Universita Brno ISBN 80-902562 B. Staveley, Principles of Cell Biology Memorial University of Newfoundland http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/CBhome.html M. Muller, Biology of Cells and Organisms University of Illinios, Chicago http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/summer2010/lecturesm10.htm Wikipedia http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_09.jpg http://image.slidesharecdn.com/replicationtranscriptiontranslation2012-140317172230-phpapp01/95/rep lication-transcription-translation2012-24-638.jpg?cb=1395077017 Transkripce Informace z DNA se nepřekládá do proteinu přímo, ale přes prostředníka - mRNA (messenger; mediátorová) Část první: Bakteriální transkripce Transkripce (přepis) genetické informace z DNA (chromozomové a plazmidové) do RNA pomocí enzymu RNA-polymerázy RNA-polymeráza (transkriptáza) - váže se na promotor - katalyzuje syntézu dlouhých primárních transkriptů - u bakterií stejná RNA-polymeráza pro všechny typy RNA Primární transkripty: Většinou obsahují přepisy více genů (polygenní/polycistronní). Na DNA: promotor - geny - terminátor http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_01.jpg 3 hlavní skupiny RNA 1. mRNA (mediátorová; messenger) matrice pro syntézu polypeptidů. U bakterií nepodléhá posttranskripčnímu sestřihu 2. rRNA (ribozomová) posttranskripčně upravována z pre-rRNA 3. tRNA (transferová) posttranskripčně upravována z pre-tRNA Váže se na ni aminokyselina, obsahuje antikodon B. Staveley, Principles of Cell Biology Memorial University of Newfoundland http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/CBhome.html https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0f/Peptide_syn.png Fáze transkripce 1. Iniciace: Navázání RNA-polymerázy na promotor a zahájení syntézy 2. Elongace: Připojování nukleozid-5'-monofosfátu k 3'-konci RNA řetězce podle matricového řetězce 3. Terminace: Zastavení elongace na terminátoru a uvolnění z matricového řetězce http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_07.jpg http://i.imgur.com/H7wRD.png amolecularmatter.tumblr.com sigma faktor Operon: - Transkripční jednotka, která je spolu s promotorem řízena také operátorem - Mezi promotorem a startovacím nukleotidem se nachází regulační oblast - OPERÁTOR. - Na operátor se může vázat regulační protein - REPRESOR. Ten zastavuje transkripci Operon: transkripční jednotka řízená promotorem a operátorem Oprerátor: regulační oblast na DNA, na níž se může vázat represor Transkripční jednotka: oblast na DNA, která se přepisuje do mRNA https://diaryofanalevelstudent.files.wordpress.com/2013/02/lactose-absent.jpg Promotor: Sekvence na DNA před transkripční jednotkou, nasedá na něj RNA-polymeráza - Podobné u všech transkripčních jednotek, ale ne totožné. Liší se mírou afinity k RNA-polymeráze. - Silný/slabý promotor - vysoká/nízká frekvence iniciace transkripce - Silnější promotor se více blíží konvenční sekvenci v místech: a) kolem nukleotidu -35: 5' TTGACAT 3' b) Pribnowův box* (-10): 5' TATAAT 3' T operátor http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_08.jpg *Podobný TATA boxu u eukaryot Bakteriální RNA-polymeráza - Rozeznává promotory všech transkripčních jednotek - Složena z podjednotek (holoenzym): - 2 α: udržují stabilitu molekuly - 1 β: umožňuje vazbu ribonukleotidů na polymerázu - 1 β': umožňuje spojení polymerázy s matricovým DNA řetězcem - 1 ω (omega) stabilizuje molekulu - 1 σ (sigma faktor): podmiňuje vazbu RNAP na promotor. Nemá katalytickou funkci, bez ní polymeráza funguje, ale začíná na libovolném místě Holoenzym: enzym se všemi kofaktory (podjednotkami) nutnými k jeho funkci; úplný enzym Apoenzym: enzym, který vyžaduje kofaktory pro svoji funkci, ale nemá je; momentálně nefunkční http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/07/f07010ecolirnap.jpg 1. Iniciace Navázání RNA-polymerázy (sigma faktoru) na promotorové sekvence -35 (rozpoznávací) a Pribnowův box (otevírá binární komplex) a) tvorba "Uzavřeného transkripčního binárního komplexu" (holoenzym RNA-polymerázy + promotorová oblast dsDNA) - řetězce dsDNA ještě nejsou rozvinuty b) RNA-polymeráza v komplexu mění konformaci, prodlužuje se a pokrývá gen v rozsahu -50 až +20 bp c) RNA-polymeráza se váže na oba řetězce DNA, ale pevněji na pozitivní-kódující (přepisuje se podle negativního-templátového) d) V Pribnowově boxu se uvolňují vazby mezi pozitivním a negativním řetězcem DNA → otevřený binární komplex e) Při iniciaci transkripce zůstává RNA-polymeráza na místě, ale od startovacího nukleotidu (+1) začíná katalyzovat tvorbu nového řetězce RNA (fosfodiesterová vazba mezi dvěma ribonukleotidy) → první dinukleotid f) Otevřený transkripční ternární (ze tří částí) komplex = vazba tří molekul (1. DNA, 2. RNA-polymeráza, 3. RNA) Latinsky: "binarius" = složený ze 2 částí; "ternarius" = složený ze 3 částí 2. Elongace Prodlužování RNA - Katalyzována RNA-polymerázou bez Sigma-faktoru (uvolňuje se po vytvoření počátečního fragmentu RNA a je nahrazen NusA-proteinem) - RNA-polymeráza se posunuje po negativním řetězci DNA (40 nukleotidů/sek; 37°C) směrem od 3' → 5'-konci DNA - cca 18bp dlouhá rozvinutá oblast DNA; hybrid RNA-DNA dlouhý cca 2-5bp - RNA v hybridní dvojšroubovici se pevněji váže k RNA-polymeráze než k DNA - Syntéza RNA řetězce směrem od 5' → 3'-konci - S NusA proteinem dorazí RNA-polymeráza až k terminátoru http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_09.jpg Průběh transkripce bakteriálního genomu 3. Terminace Zastavení pohybu RNA-polymerázy - uvolnění hotové RNA - uvolnění RNA-polymerázy A) závislá na Rho-faktoru B) nezávislá na Rho-faktoru Rho-faktor: protein katalyzující uvolnění dokončeného RNA-řetězce z templátového (negativního) DNA-řetězce Image result for nusa protein 3A) Terminace závislá na Rho-faktoru Rho-faktor: protein katalyzující uvolnění dokončeného RNA-řetězce z matricového (negativního) DNA-řetězce - Rho protein aktivní ve formě hexameru - váže se během transkripce na 5'-konec mRNA a pohybuje se za RNA-polymerázou - v terminátoru se RNA-polymeráza zastaví, rho-faktor ji dostihne - Rho-faktor katalyzuje uvolnění mRNA z DNA-řetězce a uvolnění RNA-polymerázy (za spotřeby ATP) Rho Image result for nusa protein 3B) Terminace nezávislá na Rho-faktoru - Tvorba vlásenky na RNA, na konci se sekvencí UUUUUU - nestabilní hybrid DNA-RNA → rozpad - Uvolnění NusA-proteinu Komplementární sekvence Jedinečná sekvence Sekvence UUUUUU představuje signál pro uvolnění polymerázy matricový (negativní) DNA-řetězec 7-methylguanosin -Pavel Šimara Strukturní geny – mRNA Překládají se do polypeptidu - Transkripcí transkripční jednotky obsahující strukturní geny vzniká mRNA - mezi promotorem (popř. za operátorem) a prvním strukturním genem leží vedoucí sekvence s Shineovou-Dalgarno sekvencí, která zajišťuje vazbu na ribozom a nepřekládá se. Shineova-Dalgarno sekvence v mRNA: 5' AGGA 3' - vazba na ribozom (k 16 S-rRNA podjednotky 30S): 3' UCCU 5' - pokud primární transkript neobsahuje Shineovu-Dalgrinovu sekvenci, nemůže se vázat k ribozomu a nepůsobí jako funkční RNA http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/08/f8-08-0.jpg Funkční RNA: RNA, které nejsou určeny k translaci (tRNA, rRNA, miRNA, siRNA) U operonů i operátor -Pavel Šimara mRNA se strukturními geny - Na 5'-konci obsahuje přepis vedoucí sekvence s Shineovou-Dalgarnovou sekvencí, nepřekládá se - Na 3‘-konci za stop-kodonem obsahuje nepřekládanou sekvenci - Jeden strukturní gen se překládá do jedné molekuly polypeptidového řetězce - U prokaryot jsou geny polycistronní (více genů na jednom transkriptu mRNA) - každý gen na transkriptu obsahuje svůj start a stop kodon a svou Shine-Dalgarno sekvenci pro vazbu ribozomu - na DNA mají jeden společný promotor a jednu terminační sekvenci na 3‘-konci. Promotor není součástí transkripční jednotky. Shine-Dalgarno sequence http://www.cas.miamioh.edu/~wilsonkg/old/gene2005/systems/regulation/bp16p8.jpg DNA mRNA 5' Shine-Dalgarno sequence 3' Bakteriální mRNA - posttranskripčně se neupravuje a slouží přímo pro tvorbu polypeptidu - rozpad během několika minut účinkem ribonukleázy (RNázy) ve směru 5' → 3' - translace molekuly mRNA na ribozomu probíhá současně s její transkripcí. Polypeptidový řetězec se začne syntetizovat ještě před ukončením transkripce - rychlosti: 40 nukleotidů za sekundu; 13 aminokyselin za sekundu; až 15 iniciací transkripce za minutu u jedné transkripční jednotky - Polyribozom: více ribozomů na jedné mRNA urychluje transkripci - Spojení transkripce s translací umožňuje efektivní syntézu proteinů (např: 15 molekul mRNA, každá pokryta 30 ribozomy) http://gcat.davidson.edu/mediawiki-1.19.1/images/0/0e/Prokaryote.jpg Bakteriální rRNA - geny pro rRNA na chromozomu v 5-9 kopiích - každá transkripční jednotka má 2 promotory (P1, P2) a 2 terminátory (T1, T2) - mezi některými geny jsou vmezeřeny geny pro tRNA - nejprve přepis do pre-rRNA: sedimentační koeficient 30S - 30S jsou štěpeny RNázou III na sekvence 5S, 16S a 23S Jednotka S (Svedberg) - sedimentační koeficient (veličina udává čas, za který proběhne sedimentace dané makromolekuly při její ultracentrifugaci) 30S Bakteriální tRNA - u E coli 2 multigenní transkripční jednotky s geny pro tRNA - jen jeden promotor, poslední gen je strukturní (např. pro elongační faktor EF-Tu) - strukturní gen umožňuje vazbu na ribozom, protože obsahuje Shineovu-Dalgarnovu sekvenci CRISPR (Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats) - adaptivní (získaná) imunita bakterií - obrana cizímu genetickému materiálu (např. virální DNA) - segment prokaryotické DNA se "spacer DNA" obsahujícími části DNA virů z předešlých infekcí - při nové infekci je třeba vytvořit novou "spacer DNA" - Transkripce do crRNA (CRISPR RNA), komplementární s virovou DNA, spolu s CAS (crispr-associated) proteiny - crRNA s CAS proteiny tvoří "interference komplexy" - párování s odpovídající sekvencí virové DNA a její inaktivace https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/5f/Crispr.png/1280px-Crispr.png spacer DNA interference complex Image result for crispr cas9 CRISPR-Cas9 Velké uplatnění v editaci lidského genomu: vhodná guide RNA + Cas9 protein štěpí DNA ve zvoleném místě (inaktivace nebo vložení jiné sekvence) 2. Transkripce eukaryotického genomu http://image.slidesharecdn.com/replicationtranscriptiontranslation2012-140317172230-phpapp01/95/rep lication-transcription-translation2012-24-638.jpg?cb=1395077017 Rozlišujeme transkripci jadernou, mitochondriální a chloroplastovou. Transkripce jaderné složky - jaderné geny jsou na chromozomech - tvoří primární transkripty Typy RNA 1. Kódující RNA - informace z DNA je přenesena mRNA do ribozomu, kde je přeložena do sekvence aminokyselin tvořících proteiny - asi jen 3% všech transkriptů 2. Nekódující RNA - cca 97% transkriptů - zejm. introny vystřižené z mRNA, rRNA, tRNA a regulační RNA Rozptýlené repetice (44%) Alu sekvence (10%) Tandemové repetice (15%) Jedinečná nekódující DNA (15%) Introny strukturních a funkčních genů (24%) Exony strukturních a funkčních genů (1,5%) Alu sekvence - transpozonální DNA (schopná měnit pozici), funkce větš. neznámá, hraje roli při buň. dělení DNA Polycistronní vs. monocistronní mRNA Na rozdíl od prokaryot mají eukaryota pouze monocistronní mRNA Eukaryotická mRNA - obsahuje kódující sekvenci pouze pro jeden polypeptid (monocistronní) - jeden iniciační a jeden terminační kodon Prokaryotická mRNA - obsahuje kódující sekvenci pro několik genů, většinou jedné metabolické dráhy - mRNA transkript obsahuje hodně iniciačních a terminačních kodonů http://1.bp.blogspot.com/-i8i350hweHQ/UaSaYLtvJyI/AAAAAAAAGfk/0ohS5vXPb0c/s1600/MONOCISTRONIC++.jpg [MONOCISTRONIC%2520%2520VS%2520POLYCISTRONIC%255B16%255D.jpg] http://www.majordifferences.com/ Typy RNA 1. Kódující RNA - pre-mRNA: prekurzorová mRNA (též hnRNA - heterogenní jaderná RNA) - primární transkript obsahující přepisy strukturních genů - je upravován do mRNA 2. Nekódující RNA - pre-rRNA: prekurzorová ribozomová RNA - posttranskripční úpravou se štěpí na a) 5,8S-rRNA, 18S-rRNA a 28S-rRNA u savců b) 5,8S-rRNA, 16S-rRNA a 25S-rRNA u rostlin - pre-tRNA: prekurzorová transférová RNA - štěpí se na různé druhy tRNA - 5S-rRNA: tvoří se transkripcí genů pro 5S-rRNA - Malé RNA: Nízkomolekulární stabilní RNA (80-300 nukleotidů) - řídí sestřih a posttranskripční úpravy pre-RNA (katalyzovány RNA-polymerázami II a III) a) malé jaderné RNA (snRNA) b) malé jadérkové RNA (snoRNA) c) malé cytoplazmatické RNA (scRNA) d) regulační RNA (miRNA a siRNA) snRNA se účastní sestřihu pre-mRNA ve spliceazomu Transkripční faktory (TF) - regulační proteiny - vážou se na regulační oblasti promotoru nebo zesilovače (enhancer) transkripce - nutné pro zahájení transkripce - působí ve skupině, nasednou na promotor a na ně se váže RNA-polymeráza Typy TF: 1. Obecné TF: ve většině eukaryot, geny potřebné pro základní funkce všech buněk 2. Speciální TF: vyskytují se v určitých tkáních v určitý čas Transkripční aktivita = rychlost syntézy RNA: počet primárních transkriptů za minutu 1. Bazální transkripční faktory: - nízká aktivita, minimální požadavky buňky - umožňují zahájení transkripce 2. Konstitutivní transkripční faktory: - zvýšená aktivita - konstitutivní TF se přidávají k bazálním TF 3. Indukovatelné transkripční faktory: - úprava transkripční aktivity v reakci na vnější podmínky - význam při diferenciaci Eukaryotické DNA-dependentní RNA-polymerázy Každá má svůj specifický promotor (bakterie jeden typ RNA-polymerázy a jeden typ promotoru) 1. RNA-polymeráza I - katalyzuje syntézu pre-rRNA - pouze v jadérku* 2. RNA-polymeráza II - syntéza mRNA (strukturní geny) a malých RNA - v jádře 3. RNA-polymeráza III - syntéza pre-tRNA, 5S-rRNA a malých RNA - v jádře https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/21/Simple_transcription_elongation1.svg/721p x-Simple_transcription_elongation1.svg.png *v jadérku se skládají ribozomy z proteinů a rRNA Promotor pro RNA-polymerázu II obsahuje krátké sekvence 1. TATA-box (též Hognessův box): T A T A A A A -34 až -26 od startovacího nukleotidu - vazba TF TFIID - specificky rozeznáván RNA-polymerázou II 2. CAAT-box: G G C C A A T C T - nukleotidy -75 až -80 - vazba TF CTF/NF1, zvyšuje sílu promotoru (enhancer) 3. GC-box: G G G C G G - nukleotid -90 - vazba TF SP1, zvyšuje sílu promotoru (enhancer) - je fosforylován proteinkinázou vázanou na DNA - stimulace tvorby přediniciačního komplexu - umožňuje vazbu TFIID na TATA-box 4. Oktamer: A T T T G C A T - váže se na konstitutivní TF OCT-1 5. Startovací nukleotid: Iniciátor (Inr-element) - obvykle A uvnitř úseku s pyrimidinovými bazemi (C nebo T) Tyto se vyskytují ve většině promotorů RNA-polymerázy II Iniciace transkripce polymerázou II - Transkripční faktor TFIIF umožňuje umístnění RNA-polymerázy na promotor (3.) - Uzavřený transkripční komplex je ještě inaktivní (3.) - Transkripční komplex je aktivován až TFIIH tak, že fosforyluje RNA-polymerázu (4, 5) - Všechny TF kromě TFIID a TFIIA se uvolní a aktivní RNA-polymeráza elonguje pre-mRNA (hnRNA) (5.) Význam transkripčních faktorů: "Umožňují rozeznat místa, kam se má navázat RNA-polymeráza II a aktivují ji." Pokud promotor nemá TATA-box, začíná transkripce na Inr-elementu http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_12.jpg Terminace transkripce polymerázou II Polyadenylační signál: T T A T T T na negativním řetězci DNA - do pre-mRNA přepsán jako A A U A A A - označuje terminaci transkripce - sekvence je rozeznána endonukleázou - štěpí 10-30 nukleotidů za signálem - poly(A)-polymeráza katalyzuje polyadenylaci 3'-konce - helikáza rozdělí zbytek hybridní DNA-RNA a zbytková RNA je rozštěpena exonukleázou Exonukleáza: štěpí nukleotidy od krajů Endonukleáza: štěpí nukleotidy od prostředku Helikáza: oddaluje řetězce DNA nebo RNA http://image.slidesharecdn.com/chapter17-120120073228-phpapp02/95/chapter-17-gene-to-protein-38-728 .jpg?cb=1327044825 RNA polymeráza nasedá na TATA box UTR - untranslated region Eukaryotické mRNA jsou monocistronní - obsahují kodující sekvenci pouze pro jeden polypeptid Translace: - začíná na mRNA na "sekvenci Kozakové" CAAAAUG (což na DNA odpovídá sekvenci TAC) - končí na mRNA na stop kodonech UAG (Amber), UGA (Opal), UAA(Ochre) - na DNA odpovídá (ATC, ACT, ATT) www.fatespace.com Regulační RNA - krátké molekuly RNA se sekvencí komplementární k určitým částem mRNA nebo DNA - působí mechanismem RNA interference (RNAi) - typicky inhibují genovou expresi vazbou na mRNA - 2006 Nobelova cena za fyziologii a medicínu pro A. Fire a C. Mello za výzkum RNAi - epigenetická posttranskripční regulace exprese a též obrana buněk proti parazitickým nukleotidovým sekvencím (např. RNA virům) - hrají roli též ve vývoji - s tzv. Argonaute proteiny tvoří komplex zvaný RISC (RNA-induced silencing complex) - využívána ve výzkumu pro supresi exprese specifických genů 1. miRNA (microRNA; 22 nukleotidů) - endogenní původ, transkripcí genomové DNA 2. siRNA (small inhibitory RNA; 20-25 nukleotidů) - exogenní původ (např. virový) siRNA a miRNA jsou si velmi podobné Epigenetická regulace genové exprese 1. miRNA (microRNA; 21-22 nukleotidů) - vlásenka pri-miRNA je štěpena RNAázou "Drosha" na pre-miRNA (70 nukleotidů) - export pre-miRNA do cytoplasmy - štěpení Dicerem na miRNA 21-22 nukleotidů - spolu s proteiny tvoří tzv. miRISC (miRNA-induced silencing complex) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_34.jpg 1. miRNA (microRNA; 21-22 nukleotidů) - Funkce: RNA silencing a posttranskripční regulace genové exprese - párování s komplementárními sekvencemi mRNA (nemusí být 100% komplementární) - mechanismy silencingu: a) štěpení řetězce mRNA na dva kusy (endonukleázami) b) destabilizace mRNA zkracením poly(A) konce (dřívější degradace exonukleázami) c) snížení účinnosti translace do proteinu na ribozomu (fyzicky blokuje) - vyskytuje se nejprve ve formě shRNA (short hairpin RNA) - štěpena enzymem zvaným "Dicer" - lidský genom kóduje přes 1000 miRNAs - evolučně konzervované 2. siRNA (small inhibitory RNA; 20-25 nukleotidů) - Funkce: posttranskripční RNA silencing - dvojřetězec (štěpena také enzymem Dicerem) - exogenní původ - spolu s proteiny tvoří tzv. siRISC (siRNA-induced silencing complex) - jeden řetězec degradován - vazba siRISC na cílovou mRNA - při 100% párování s cílovou sekvencí se mRNA štěpí http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_33.jpg 3. Posttranskripční úpravy RNA a mechanizmy sestřihu Posttranskripční úpravy Primární transkripty jsou dlouhé molekuly a musí být zkráceny, aby mohly být transportovány z jádra do cytoplasmy a) modifikace, které neovlivňují primární strukturu - tvorba komplexů jaderné pre-mRNA s proteiny - úprava 5'-konce pre-mRNA tzv. čepičkou - polyadenylace 3'-konce pre-mRNA b) úprava primární struktury (sestřih; editace; vystřižení intronů) Intron (intragenic region): nekódující sekvence RNA uvnitř genu, která je vystřižena Exon (expressed regions): kódující sekvence RNA, přeložená do proteinů http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_20.jpg Modifikace, které neovlivňují primární strukturu Tvorba komplexů jaderné pre-mRNA s proteiny - proteiny, které se vážou na pre-mRNA se označují RNP-proteiny - komplex RNA s RNP-proteiny nazýváme spliceozom Funkce: RNA-proteiny uvádějí RNA do stavu přístupného k posttranskripčním úpravám Úprava 5'-konce čepičkou - čepička: m7G - 7-metylguanozin se váže na mRNA ve směru 5' - 5' Funkce: čepička váže proteiny nezbytné pro iniciaci translace 7-Methylguanosine.svg 7-Methylguanosine hnRNA (heterogenous nuclear RNA) je synonymum pro pre-mRNA RNP - ribonucleoprotein Modifikace, které neovlivňují primární strukturu Polyadenylace 3'-konce - K polyadenylačním signálu AAUAAA na 3'-konci pre-RNA se připojí sekvence 50 - 250 nukleotidů (A) - katalyzována poly(A)-polymerázou Funkce: ochrana proti účinku exonukleáz (dýl trvá než se dostanou přes AAAA ke kódující sekvenci) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_18.jpg Video: m7G a polyadenylace Sestřih pre-mRNA (hnRNA) → mRNA - Úprava primární struktury RNA Intron (intragenic region): nekódující sekvence RNA uvnitř genu, která je vystřižena Exon (expressed regions): kódující sekvence RNA, přeložená do proteinů Sestřih pre-mRNA → mRNA Objev intronů: - při hybridizaci DNA s mRNA pod elektronovým mikroskopem - určité části na DNA přebývaly (introny) - tvorba smyček DNA (na obr. A až F) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_19.jpg http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_19.jpg Intron (intragenic region): nekódující sekvence RNA uvnitř genu, která je vystřižena Exon (expressed regions): kódující sekvence RNA, přeložená do proteinů Konstitutivní vs. alternativní sestřih a) Konstitutivní: po sestřihu vždy stejná molekula mRNA → stejný protein b) Alternativní: vzniká více druhů molekul mRNA → různé izoformy proteinů - regulace exprese - regulace poměrů izoforem Intron (intragenic region): nekódující sekvence RNA uvnitř genu, která je vystřižena Exon (expressed regions): kódující sekvence RNA, přeložená do proteinů - konstitutivní exon: při všech posttranskripčních úpravách působí jako exon - potenciální exon: při některých posttranskripčních úpravách působí jako exon, jindy jako intron Izoformy proteinů: funkčně příbuzné proteiny, liší se v primární struktuře Může se intron též překládat do proteinu? Výjimečně ano. Intron retention většinou u rostlin, méně u živočichů. a) Introny nebo jejich části mohou být výjimečně přepisovány do proteinů - antigen na lidském melanomu (Lupetti 1998) nebo isoforma proteinu CEACAM6 (Kurio 2008). b) Sestřihlá mRNA se zachovanými introny vycestuje z jádra, při translaci ale dojde kvůli intronu k předčasnému ukončení a transkript je degradován - regulační mechanismus - zabrání se translaci. c) Introny mohou zůstat v UTR (untranslated region) kde regulují translaci, ale samy se nepřekládají (Remy 2014) -Pavel Šimara Alternativní sestřih http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_23.jpg potenciální exon http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_23.jpg potenciální exony 13 variant alternativního sestřihu u genu SYNGAP1 22 exonů (písmeny označeny exonové jednotky) ˄ intron . spojení dvou exonových jednotek Mechanismus sestřihu mRNA - Úprava primární struktury mRNA - pouze za účasti spliceozomu - Proces řídí snRNP částice (komplex snRNA- a proteinů) - tvoří spliceozom - primární struktura intronu určuje místo sestřihu: GU-AG - Intron: 5'-konec GU; 3'-konec AG; uprostřed místo větvení A - Vlastní sestřih probíhá pomocí chemické reakce: Transesterifikace https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a5/Phosphodiester_Bond_Diagram.svg/413px-Pho sphodiester_Bond_Diagram.svg.png Transesterifikace v sestřihu pre-mRNA → mRNA - přeměna fosfátového esteru v jiný bez hydrolýzy za nepřítomnosti ATP nebo GTP - energie fosfodiesterové vazby zůstává zachována https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/d2/Phosphate_Group.svg/1025px-Phosphate_Grou p.svg.png Estery: organické sloučeniny, ve kterých je -OH skupina nahrazena organickým zbytkem vzniklým z alkoholu po odštěpení vodíku. Esterifikace: chemická reakce, při které ester vzniká Nukleové kyseliny jsou polymery: vlákno nukleotidů navzájem spojených fosfodiesterovou vazbou. Dusíkatá báze (A, T/U, C, G) + cukr – pentoza (ribóza/deoxyribóza) + fosfát (mono- v řetězci, tri- volně) Nucleosid (cytidin) Cytidin monofosfát (CMP) Cytidin trifosfát (CTP) β-N- glykosidová vazba Fosfodiesterová vazba - - První transesterifikace: - spojení exonu1 a intronu přes OH-skupiny - odpad z vazby (H2O) je použit na zakončení 3'-konce exonu 1 (OH) a zakončení 5'-konce intronu (H) Druhá transesterifikace: - spojení obou exonů do výsledné mRNA - intron se odpojí ve formě lasovité RNA Sekvence pro transesterifikaci jsou rozeznávány snRNP-částicemi a tvoří komplexy katalyzující sestřih - Spliceozom Transesterifikace v sestřihu pre-RNA → mRNA OH H Spliceozom - velká elipsoidní částice, sedimentační koeficient 60S - uvnitř jádra - funkce: odstraňuje introny z pre-mRNA (katalyzuje sestřih mRNA) - tvořen komplexem 5 snRNA (U1, U2, U4, U5, U6) a různými proteiny - složitostí podobný ribozomům, pozorovatelný elektronovým mikroskopem http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_22.jpg Lariat - laso Spliceozom http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_21.jpg Video: mRNA sestřih (splicing) mRNA je výsledkem spojení exonů na stejné molekule primárního transkriptu (výjimečně dvou různých molekul - bimolekulární sestřih) Posttranskripční úpravy pre-rRNA - transkripce RNA polymerázou I - pre-rRNA obsahuje přepisy genů pro 5,8S, 18S a 28S rRNA - geny jsou lokalizovány v DNA jadérka, kde probíhá též jejich transkripce do pre-rRNA - introny jsou vyštěpeny, ale exony se nespojují - štěpení pomocí endonukleáz - 3 jednotky rRNA jsou využity ke stavbě ribozomů spolu s ribozomovými proteiny http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_14.jpg Posttranskripční úpravy pre-tRNA jednotlivé tRNA uskutečňují přenos jednotlivých aminokyselin http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_15.jpg 1. Odstranění vedoucí sekvence na 5'-konci 2. nahrazení dvou nukleotidů na 3'-konci sekvencí CCA (tam se připojí AMK) 3. chemická modifikace vybraných bazí → tvorba "neobvyklých bazí"* 4. vystřižení intronů *neobvyklé báze zpřesňují syntézu proteinů (4-thiouridin, dihydrouridin, 1-methylguanozin...) Posttranskripční úpravy genoforu mitochondrií - nepodléhají úpravě 5'-konce čepičkou - začínají vedoucím kodonem AUG - nejdůležitější úpravou je polyadenylace Editace RNA - probíhá v mitochondriích trypanzom, vyšších rostlin a v genu pro apolipoprotein savců - cílena inzerce, delece nebo substituce nukleotidu mRNA s cílem pozměnit výsledný protein - Kryptogen: strukturní gen s možností editace mRNA - proces regulován tzv. gRNA (guide RNA) Zajímavosti o RNA - většina molekul mRNA rychle degraduje - bakteriální mRNA má poločas rozpadu v řádu minut - eukaryotická mRNA má poločas rozpadu v řádu hodin až dní - tRNA a rRNA jsou stabilnější než mRNA - transkripce umožňuje amplifikaci genetické informace díky množství kopií mRNA