Molekulární biologie 6. Regulace genové exprese Osnova Řízení exprese bakteriálního genomu Řízení exprese eukaryotického genomu Hlavní zdroje: S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie 1-4 Masarykova Universita Brno ISBN 80-902562 B. Staveley, Principles of Cell Biology Memorial University of Newfoundland M. Muller, Biology of Cells and Organisms University of Illinios, Chicago Řízení exprese bakteriálního genomu podle toho jak moc se blíží konvenční sekvenci Část první: Řízení exprese bakteriálního genomu - u bakterií nejčastěji regulace na úrovni transkripce - NE všechny promotory jsou si rovny - některé mají slabší afinitu k RNA-polymeráze než jiné - proto potřebují pomoc regulátorů (pozitivní nebo negativní) - vypínání a zapínání transkripce v reakci na okolní podmínky - nikdy není potřeba vyrábět všechny proteiny najednou - buňky nikdy neplýtvají zbytečně energií Regulátory: 1. Regulační protein - vážou se na regulační oblast DNA (promotor/operátor) - 2 vazebná místa a) pro rozlišení DNA promotoru/operátoru regulovaného genu b) pro příslušnou signální molekulu - po vazbě signální molekuly mění konformaci a tím afinitu k promotoru 2. Signální molekula (alosterický efektor) - většinou malá a neschopná se přímo vázat na regulační oblast DNA (promotor/operátor) - často substrát (např. laktóza) nebo produkt (např. aminokyselina) příslušného enzymu - daný enzym se buď zapne (β-galaktozidáza) nebo vypne (AA-syntetáza) - vazba na regulační protein (zprostředkovatel) Signální molekula (alosterický efektor) a Regulační protein Regulátory signální molekuly Systém regulace genů je zkoumán od roku 1961, kdy Jacques Monod objevil lac operon (Nobelova cena 1968) Indukce syntézy proteinů β-galaktozidáza (u E. coli) - jeden z enzymů pro štěpení laktózy u E. coli (spolu s permeázou a transacetylázou) - v prostředí kde je jediný zdroj uhlíku glukóza se enzym netvoří - po přenosu do prostředí s jediným zdrojem uhlíku laktózou začne E. coli syntetizovat β-galaktozidázu za 1 min - Koreprese: glukóza aktivně potlačuje syntézu β-galaktozidázy - samotná přítomnost laktózy nestačí, aby se začal tvořit enzym - tzn. za přítomnosti glukózy i laktózy zůstává laktóza nedotčena Represe syntézy proteinů - syntéza enzymu potlačena metabolitem dané biochemické dráhy - syntéza se zastavuje pokud se v buňce nahromadí metabolit do kritického množství (např. aminokyseliny) - při poklesu pod kritickou mez se obnovuje Jacques Monod www.nobelprize.org Regulace operonu - Operon - transkripční jednotka, která obsahuje regulační místa "Promotor" a "Operátor" před strukturními geny - Operátor - úsek na operonu, kam se váže represor → zastavení transkripce - Slabé nekovalentní vazby Represor (negativní regulační protein) - Fyzicky brání RNA-polymeráze ve vazbě nebo pohybu na DNA - Na represor se váže signální molekula a) induktor - zabraňuje vazbě na operátor - probíhá transkripce b) korepresor (není nezbytný) - podporuje vazbu na operátor - neprobíhá transkripce http://www.dnacoil.com/wp-content/uploads/2013/06/promook.png OPERON lacI je jiný gen, vlastní transkript lacZ, lacY a lacA jsou na jednom transkriptu, mají společný promotor, ale každý má vlastní Shine-Dalgarno sekvenci a start a stop kodon Laktózový operon E. coli (lac operon) http://www.cas.miamioh.edu/~wilsonkg/old/gene2005/systems/regulation/bp16p8.jpg lacI - gen pro regulační protein (nachází se před strukturními geny pro enzymy štěpící laktózu) lacZ - gen pro β-galaktozidázu lacY - gen pro permeázu lacA - gen pro transacetylázu Geny pro funkčně blízké proteiny se nachází na DNA v rámci jedné transkripční jednotky (operonu) Laktózový operon E. coli (lac operon) - glukóza je pro E. coli "sugar of choice" a dává jí přednost před laktózou - samotná přítomnost laktózy nestačí, aby se začal naplno tvořit enzym - musí být zároveň nepřítomná glukóza - RNA polymeráza má sama o sobě slabou afinitu k promotoru lac operonu - potřebuje pomoc pozitivního regulačního proteinu - CAP (catabolite activator protein) - CAP se váže na promotor lac operonu pouze po aktivaci pomocí cAMP (signální molekula/alosterický ef.) - glukóza ovšem inhibuje tvorbu cAMP inhibicí enzymu adenylátcyklázy http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/17_11b_cAMP-L.jpg Laktózový operon E. coli (lac operon) http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/cap02b.jpg shrnující video: https://www.youtube.com/watch?v=-4Jr84qyKPo Tryptofanový operon (trp operon) - obsahuje 5 strukturních genů (trpE, trpD, trpC, trpB, and trpA), promotor (Ptrp), operátor (O), a vedoucí sekvenci (L) - Pokud Tryptofan chybí - represor (kodován trpR) je inaktivní - transkripce probíhá Vedoucí sekvence DNA – úsek DNA v bakteriálních transkripčních jednotkách uložená mezi promotorem a prvním strukturním genem. Je v ní uložena Shine-Dalgarnova sekvence. Může obsahovat atenuátor. http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_06.jpg Tryptofanový operon (trp operon) -Pokud je Tryptofan přítomen, váže se na represor, a represor vazbou na DNA zastaví transkripci -Exprese genů kodujících enzymy biochemické dráhy pro syntézu Tryptofanu je navíc ještě řízena tzv. atenuací - http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_06.jpg Atenuace - Atenuátor - oblast ve vedoucí sekvenci DNA (překládá se) - pouze u prokaryot - spojení mezi transkripcí a translací u prokaryot umožňuje fungování kontrolního mechanismu atenuace - nascentní řetězec RNA je kousek dál simultánně překládán do proteinu - transkript trp operonu (mRNA) obsahuje 162 nukleotidů před prvním strukturním genem trpE - tato vedoucí sekvence obsahuje "sensor" (neboli vedoucí peptid) o velikosti 14 AA a) pokud je přítomen tryptofan - vytvoří se pouze vedoucí peptid b) pokud není přítomen tryptofan - celý operon je přeložen a vytvoří se enzymy pro syntézu tryptofanu Vedoucí sekvence DNA – úsek DNA v bakteriálních transkripčních jednotkách uložená mezi promotorem a prvním strukturním genem. Je v ní uložena Shine-Dalgarnova sekvence. Může obsahovat atenuátor. http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_07.jpg první strukturní gen pokud je tryptofan přítomen, transkripce se ukončí před trpE nové RNA-polymerázy nasedají na AUG na mRNA ostatních genů na transkriptu, který byl vyroben celý Mechanismus atenuace - vedoucí sekvence mRNA obsahuje 4 regiony, které jsou vzájemně kompatibilní a schopny tvořit vlásenky: 1+2, 2+3, 3+4 - regiony 3+4 jsou schopny tvořit terminační vlásenku - RNA-polymeráza se uvolňuje z DNA 1. Nedostatek tryptofanu - ribozom se zastaví na místě kodovaném pro tryptofan (region 1) čeká na přítomnost tRNA - ribozom fyzicky zablokuje pouze region 1. Region 2 je volný a vytvoří vlásenku s regionem 3 - nevzniká tedy terminační vlásenka 3+4 → translace pokračuje a enzymy pro syntézu nedostatkového tryptofanu jsou vyrobeny 2. Dostatek tryptofanu - ribozom se zastaví až ve stop kodonu - blokuje region 2 - vzniká terminační vlásenka 3+4 a RNA-polymeráza se uvolňuje - výsledkem je pouze krátký vedoucí peptid (14 AA) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_07.jpg 1. Ribozom uvízne na 1. úseku, 2 je volná pro 3 2. Ribozom v době syntézy 3 a 4 blokuje 2, pak jediná možnost je 3+4 http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_08.jpg stalled - zablokovaný, scarce - nedostatek, plentiful - hojný bacillus subtilis tam se váže přímo signální molekula http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_09.jpg Riboswitch - další příklady - regulační úsek na mRNA, který kontroluje produkci daného proteinu (může vázat signální molekuly) FMN - Flavinmononukleotid je redoxně aktivní kofaktor (prostetická skupina) flavoproteinů, hrají roli např. v dýchacím řetězci. Podobný princip jako tryptofan - pokud je ho hodně, zpětná vazba - nevyrábí se další stalled - zablokovaný, scarce - nedostatek, plentiful - hojný Řízení exprese eukaryotického genomu Část druhá: Řízení exprese eukaryotického genomu Mnohem komplexnější než u prokaryot - příkladem je regulace exprese lidského genomu - všechny buňky mají stejnou DNA (s výjimkou gamet) - v běžné buňce musí být téměř všechny geny vypnuty - většinou má každý gen několik regulátorů - lidská buňka obsahuje kolem 21 000 genů (původní odhad 100 000) M. Muller, Biology of Cells and Organisms University of Illinios, Chicago http://www.edinformatics.com/math_science/human_genome.htm Část druhá: Řízení exprese eukaryotického genomu Exprese genů (tzn. "výroba proteinů") 1. Housekeeping geny - exprimovány ve všech buňkách stále - rutinní metabolické funkce, buňka se udržuje naživu 2. Geny exprimované při diferenciaci buňky - zapnutí určité signální dráhy nezbytné pro diferenciaci - zapnutí pouze po určitou dobu 3. Geny nutné pro funkci specializované buňky - stálá exprese pouze u určitého typu buněk - např. syntéza protilátek v plazmatických buňkách (terminálně diferencovaný B-lymfocyt) 4. Geny zapnuté/vypnuté v reakci na okolní podmínky - např. po signalizaci hormonem M. Muller, Biology of Cells and Organisms University of Illinios, Chicago Kdybychom měli 21.000 genů, tak by většina byla černá - neexprimuje se vůbec ani v jedné. Některá žlutá - exprimuje se stejně - housekeepig V rozdílných tkáních jsou transkribovány odlišné geny (vzniká jiná mRNA) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_19.jpg B. Staveley, Principles of Cell Biology Memorial University of Newfoundland Na rozdíl od prokaryot je DNA propletena proteiny a ty umožňují (de)konzaci Regulace genové exprese eukaryot 1. Chromatinová remodelace - oblast chromozomu musí být otevřená aby měly enzymy a TF* přístup ke genu - epigenetické modifikace: - metylace DNA - metylace a acetylace histonů 2. Transkripční kontrola - vazba TF na regulační oblasti DNA - vypínání/zapínání tvorby mRNA 3. Post-transkripční úpravy - zpracování pre-mRNA do mRNA - sestřih - RNA interference (RNAi) 4. Kontrola translace - translační iniciační faktory regulují intenzitu translace 5. Post-translační procesy - modifikace proteinu do formy aktivního proteinu http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/18_01_gene_expression-L.jpg * TF (Transkripční faktor): protein schopný spouštět či jinak regulovat transkripci DNA http://ehp.niehs.nih.gov/wp-content/uploads/2014/08/ehp.122-A251.jpg Chromatinová remodelace - oblast chromozomu musí být otevřená (dekondenzovaná) aby měly enzymy a TF přístup ke genu - chromozom je tvořen komplexem histonových proteinů a DNA, nazývaným CHROMATIN - transkripce může proběhnout, pouze pokud se "zabalený" heterochromatin dekondenzuje do "rozbaleného" euchromatinu - chromatinové remodelace patří mezi nejtypičtější epigenetické modifikace http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/histone-DNA.jpg M. Muller, Biology of Cells and Organisms University of Illinios, Chicago Chromatinová remodelace - Chromatin-remodeling complexes - skupina proteinů, které mění strukturu chromatinu - KONDENZACI a DEKONDENZACI chromatinu zajišťují enzymy: 1. Histon acetyl transferázy (HAT) - rozbalují (dekondenzují) chromatin do euchromatinu 2. Histon deacetylázy (HDAC) - zabalují (kondenzují) chromatin do heterochromatinu 3. Dnmt (DNA methyltransferázy) -Metylace DNA (cytozinu) -zabalují (kondenzují) chromatin http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/HAT.jpg M. Muller, Biology of Cells and Organisms University of Illinios, Chicago Chromatinová remodelace - EPIGENETIKA "Studuje změny v genové expresi (buněčného fenotypu), které nejsou způsobeny změnou nukleotidové sekvence DNA, ale mohou být dědičné" DNA sekvence (A, C, T, G) je jako manuál a epigenetické modifikace jako zvýrazňovače, které podtrhují různými barvami různě důležité části v jednotlivých buňkách. Na rozdíl od DNA sekvence se epigenetické značky mění během vývoje, v reakci na vnější podmínky a mohou se též dědit. http://www.pbs.org/newshour/wp-content/uploads/2015/12/epigenetics.jpg http://www.nature.com/neuro/journal/v13/n4/images/nn0410-405-F1.jpg Chromatinová remodelace - EPIGENETIKA - hlavně kovalentní modifikace a) DNA a b) histonů - tyto bývají synonymem pro "epigenetiku" - mezi epigenetické regulátory řadíme též siRNA a miRNA (souhrnně RNA interference - RNAi) a) modifikace DNA - metylace cytosinu - inhibuje transkripci - umlčení exprese - Dnmt (DNA methyltransferáza) - v CpG ostrůvcích* b) modifikace histonových proteinů - metylace nebo acetylace - hlavně acetylace lysinu - aktivuje transkripci - HAT a HDAC www.nature.com *CpG ostrůvky: nukleotidy C a G vedle sebe na stejné DNA řetězci (cytosin - fosfát - guanin) Histonový kód Hypotéza, že informace kódovaná v DNA je částečně řízena chemickými modifikacemi histonů - spolu s DNA metylacemi tvoří epigenetický kód - zatímco DNA kód mají všechny somatické buňky stejný, histonový a epigenetický kód je specifický pro každou buňku či tkáň - modifikovány bývají N-konce, které vyčnívají z nukleozomu - nejčastěji bývá modifikován lyzin (K) http://www.nature.com/nrc/journal/v1/n3/images/nrc1201-194a-f1.gif Nukleozom: skládá se z osmi histonových proteinů (2 od každého ze 4 druhů: H2A, H2B, H3 a H4) a z navinutého řetězce DNA dlouhého 147 nukleotidů Histony: proteiny, okolo kterých je omotána DNA. 5 druhů (H1, H2A, H2B, H3 and H4) https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/45/Nucleosome_organization.png Nomenklatura histonových modifikací 1. Jméno histonu (např. H3) 2. Jednopísmenná zkratka aminokyseliny (např. K pro lysin) a pozice AA v proteinu (počítáno od N'-konce) 3. Typ modifikace (Me: methyl, P: phosphate, Ac: acetyl, Ub: ubiquitin) 4. Počet modifikací (pouze methyl může mít více - až tři - kopie na AA zbytek) Příklad: H3K4me1 značí monomethylaci čtvrté AA od N'-konce (lysinu - K) na proteinu H3 Methyl lysine.svg Schematic representation of histone modifications. Based on Rodriguez-Paredes and Esteller, Nature, 2011 Příklady známých histonových modifikací Acetylace histonu vede k rozvolnění chromatinu a aktivaci exprese. Na rozdíl od metylace DNA neplatí, že metylace histonu vždy znamená umlčení (represi) exprese genu. Video: Histonové modifikace V kostce: HDAC - Histon deacetylázy potlačují expresi HDAC1, HDAC2, HDAC2... HAT - Histon acetyl transferázy aktivují expresi Gcn5, CBP/p300, PCAF, SRC-1, ACTR, ESA1, MOZ... Histon methyltransferázy aktivují/potlačují exp. Suv39H, CARM1, PRMT1... DNMT - DNA methyltransferázy potlačují expresi DNMT1, DNMT3... Pioneer Transcription Factor (TF) TF, který se dokáže vázat na kondenzovaný (uzavřený) heterochromatin - objeven r. 2002* - účastní se zejména zahájení diferenciace a aktivace buněčně-specifických genů - příkladem je pioneer transkripční faktor ASCL1, který zahajuje (trans)diferenciaci do neuronu** (navíc MYT1L zajišťuje vypnutí non-neuronálních genů; např. fibroblastových při transdiferenciaci) * Cirillo et al., 2002, "Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4". Molecular Cell. 9 (2): 279–89. ** Wapinski 2013; Chanda 2014 https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/1c/Pioneer_Factor_rearrange_the_nucleosome.j pg/800px-Pioneer_Factor_rearrange_the_nucleosome.jpg https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S2213671114001878-fx1.jpg iN = indukovaný neuron ES = embryonální kmen. buňka EPIGENETIKA epigenetické změny mohou být ovlivněny okolními podmínkami (věkem, nemocí, výživou...) Vzrůstající epigenetické rozdíly v průběhu života u monozygotických dvojčat* - dvojčata jsou po narození epigeneticky identická, avšak po několika letech lze detekovat rozdíly v genomické distribuci 5-methylcytosinu DNA a acetylaci histonů - rozdíly se zvětšují pokud mají dvojčata rozdílný životní styl nebo nežijí spolu* EPIGENETIKA A VÝŽIVA Epigenetické změny způsobené prenatálním vystavením hladomoru** - okolní podmínky mohou u lidí způsobit epigenetické změny, které přetrvají po celý život - testovaní DNA metylace u genu IGF2 mezi sourozenci stejného pohlaví - lidé prenatálně vystavení hladu během hladomoru v Holandsku 1944-1945 - snížená metylace DNA v genu pro insulin-like growth factor II (IGF-2) - zvýšená náchylnost k obezitě a srdečním onemocněním či schizofrenii * Fraga et al., PNAS 2005 ** Heijmans et al., PNAS 2008 EPIGENETIKA A VÝŽIVA Rozdíl mezi včelí královnou a dělnicí - včelí královna a dělnice mají shodný genom - rozdíly v metylaci DNA u více než 550 genů Královská výživa - "Royal jelly" je látka, produkovaná včelími dělnicemi pro výživu larev, které jsou předurčeny se vyvinout ve včelí královny - tyto larvy jsou geneticky identické s ostatními, vyrůstají v tzv. "Queen cup" - tato dieta mj. utlumuje expresi DNA methyltransferase Dnmt3 - experimentální umlčení genu Dnmt3 pomocí RNA interference (RNAi) u larvy vedlo k vývoji v královnu u 72% larev* * Kucharski et al., Science 2008 http://www.vcelarstvi-ob.cz/obr/vcela/vcely-druhy.jpg http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/images/queen_cup.jpg http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/ methionin je jedna ze dvou aminokyselin obsahující síru (cystein) Je esencialni, člověk ho neumí vyrobit, ale umí recyklovat http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/images/pathway.jpg EPIGENETIKA A VÝŽIVA Výživa hraje velkou roli v metylačním statusu i u člověka Zdrojem methyl-skupiny (-CH3) pro metylaci DNA u člověka je esenciální aminokyselina methionin* B-komplex (soubor vitamínů B): Působí jako koenzymy a donory -CH3 v metabolismu methioninu - Kyselina listová (folic acid; folate; vitamín B9) - Vitamíny B12 a B6 - Cholin (též označován jako B4) S-Adenosyl methionine (SAM) - meziprodukt pří získávání -CH3 z methioninu - též výživový doplněk University of Utah, Health Science; http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/ * Waterland, J. Nutr 2006 S-Adenosyl-L-methionin.svg Chemical structure of methionine Adenosin = adenin + riboza EPIGENETIKA A VÝŽIVA - KDE SE BERE METHYL SKUPINA? Získání methyl-skupiny z aminokyseliny methioninu - probíhá ve všech buňkách těla, zejména v játrech - příjemci methyl-skupiny jsou nukleové kyseliny, proteiny, lipidy… - methionin zbavený -CH3 se v těle recykluje přes homocystein přidáním -CH3 za účasti tetrahydrofolátu (THF), B12 a cholinu (a jeho metabolitu betainu) https://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb2/part1/aacarbon.htm https://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb2/part1/images/sam.gif As an essential amino acid, methionine is not synthesized de novo in humans and other animals, which must ingest methionine or methionine-containing proteins. Methionine can be regenerated from homocysteine EPIGENETIKA A VÝŽIVA - KDE SE BERE METHYL SKUPINA? https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c8/Choline_metabolism-en.svg/2000px-Choline_ metabolism-en.svg.png Vitamin B6 jeho aktivní forma PLP je koenzym cystathion beta syntázy (CBS) Vitamin B12 koenzym metathion-syntázy THF tetrahydrofolát derivát kys. listové donor -CH3 skupiny Choline (B4) donor -CH3 skupiny pro recyklaci methioninu EPIGENETIKA A VÝŽIVA University of Utah, Health Science; http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/ B4 B9 EPIGENETIKA A VÝŽIVA Výživa bohatá na zdroj methylové skupiny (cholin a folát) ovlivňuje metylaci DNA hlavně v prenatálním vývoji. - některé regiony genomu pak zůstávají odmethylovány (zapnuty) po celý život - methyl-deficientní dieta v dospělosti vede také ke snížení methylace DNA, ale je reverzibilní http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/images/agouti.jpg Gen Agouti - vyskytuje se u všech savců - normálně je u myši zamethylován: - hnědá srst, normální váha - pokud je u myši odmethylován: - žlutá srst, obézní - sklony k diabetu a rakovině - při krmení žluté myši v březosti stravou bohatou na zdroj methyl-skupin se narodili hnědí potomci, zdraví po celý život (žluté matce už tato dieta nepomohla) Identický genom University of Utah, Health Science; http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/ EPIGENETIKA A VÝŽIVA Bisphenol A (BPA) - sloučenina k výrobě plastů (plastové láhve, plechovky) - snižuje metylaci DNA (prokázáno na Agouti genu u myší*) - BPA podávané matkám, potomstvo bylo žluté a obézní - pokud však zároveň s BPA krmili methyl-rich dietou - potomstvo hnědé a neobézní University of Utah, Health Science; http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/ * Dolinoy et al., PNAS 2007 http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/images/mice.jpg EPIGENETIKA Genomický imprinting (vtiskování) - exprese alely závisí na pohlaví rodiče, od něhož byla zděděna - např. pro určitý gen je exprimována pouze otcovská alela (nemethylovány u spermií) - mateřská alela v oocytech je metylována - děj musí být reverzibilní, aby při tvorbě spermií byly obě alely nemethylovány - morfologická, anatomická i etologická odlišnost samice muly a samice mezka - identický genom Maultier grau.jpg Old hinny in Oklahoma.jpg Mula kříženec samce osla se samicí koně Mezek kříženec samice osla se samcem koně http://faculty.virginia.edu/mammgenetics/calico3.jpg EPIGENETIKA - X-inactivation Proces, při kterém je inaktivována jedna z kopií X-chromozomu u samic savců. - k umlčení transkripce dochází zabalením do heterochromatinu, nepřístupného transkripci - důvod: zabránit, aby samice měly dvojnásobnou expresi genů na X-chromosomu než samci - u placentálních savců (člověk) je volba X-chromosomu pro inaktivaci náhodná (ve fázi raného embrya) - vačnatci mají vždy umlčen otcovský X-chromozom - Vizuální manifestace inaktivovaného X-chromozomu: na X-chromozomu se nachází gen pro zbarvení srsti kočky (strakaté jsou vždy samice a říká se jim "calico") http://thumbs.dreamstime.com/x/sex-chromosome-signs-xy-man-xx-woman-33645772.jpg http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch15/15_08XInactivation-L.jpg EPIGENETIKA - X-inactivation -jedná se o epigenetickou změnu, která vede ke změně fenotypu -X-inaktivace je reverzibilní u zárodečných buněk -ženy často přenašečky chorob vázaných na X-chromozom (u heterozygotek je ten nemocný X-chromozom inaktivován*), ale ve vajíčku se reaktivuje -muž má X vždy aktivní (100% zdravý nebo 100% nemocný) *Nebo je vypnutý u části buněk, takže má choroba mírnější formu undefined EPIGENETIKA - X-inactivation - každá ženská somatická buňka obsahuje aktivní (Xa) a inaktivní (Xi) chromozom - Xi neexprimuje většinu genů Xist (X-inactivation specific transcript) - hlavní gen zodpovědný za inaktivaci X-chromozomu je exprimován Xi chromozomem - přepisuje se do nekódující RNA - váže se na oblasti bohaté na aktivní geny - euchromatin - a inaktivuje je https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c3/XistRNADNAFISH.jpg Xi má na rozdíl od Xa: - vyšší hladiny metylace DNA - nízké hladiny histonové acetylace - nízkou 4-methylaci lyzinu na histonu H3 (H3K4) Xa aktivní chromozom Xi inaktivní chromozom EPIGENETIKA A RAKOVINA Metylace DNA - u nádorových buněk je pozorována celková hypometylace genomu - avšak 5-10 % normálně nemetylovaných CpG ostrůvků na promotorech je v rakovinných buňkách abnormálně metylováno - hypermetylace na promotorech ovlivňuje jak expresi proteinů tak nekódující regulační RNA - důležité je prostorové rozložení DNA metylací: - metylace DNA na promotoru inhibuje transkripci - metylace DNA uvnitř genů transkripci tolik nevadí Modifikace histonů - aktivační a represivní modifikace se mohou vyskytovat na stejném histonu - BIVALENTNÍ DOMÉNY - HISTONE CROSSTALK: kombinace aktivačních a represivních modifikací vede k různé míře aktivace nebo inhibice exprese Hypermetylace: Metylační inaktivace tumor-supresorů (p53) Hypometylace: Aktivace onkogenů EPIGENETIKA A RAKOVINA Léčba cílená na epigenetiku Roku 1983 byly poprvé popsány změny v metylaci DNA související s rakovinou tlustého střeva* - pozorovány specifické vzorce v metylaci určitých genů - srovnání s nezasaženou okolní tkání - u 4 z 5 pacientů byla pozorována hypometylace v rakovinných buňkách - progresivní hypometylace u metastazujících pacientů - DNA hypo- a hypermetylace a změny v acetylaci histonů byly pozorovány u rakoviny prostaty** - ovlivnění velkého množství genů Epigenetická regulace hraje důležitou roli i v dalších typech rakoviny: děložního čípku, leukémie... * Feinberg and Vogelstein, Nature 1983 ** Li et al., J Natl Cancer Inst 2005 AstraZeneca – Advances in Epigenetics in Oncology EPIGENETIKA A RAKOVINA - Léčiva se zaměřují na reverzi epigenetických změn vedoucích ke vzniku rakoviny -nespecifické a s vedlejšími účinky -musí být cílena na daný typ rakoviny (např. nefunkční tumorsupresor, nebo hyperaktivní onkogen) http://www.cell.com/cms/attachment/606891/4829461/gr2.jpg 1. Inhibitory DNA metyltransferáz (Dnmt) - hypometylační efekt - nastartování transkripce tumorsupresorů - azacitidine, decitabine 2. Inhibitory histon acetyltransferáz (HAT) - inhibice transkripce onkogenů - vorinostat, romidepsin 3. Inihibitory histon deacetyláz (HDAC) - kyselina valproová, trichostatin - podpora exprese genů spojených s apoptózou - zpomalení progrese rakoviny - též indukce diferenciace u nezralých buněk (např. při leukemiích) The Cell Vývoj léčiv pro epigenetickou terapii 1.Kandidátní malé molekuly jsou nejprve testovány na rakovinných buňkách in vitro (inhibice proliferace, indukce apoptózy, cell-cycle arrest). 2.Zjištění potenciálních signálních drah, které jsou zodpovědné za daný pozorovaný efekt (např. expresní microarrays). 3.Účinné látky jsou testovány na zvířecích modelech s rakovinou (zjištění in vivo terapeutického účinku - survival, a dále toxicitu, vedlejší účinky a farmakokinetické vlastnosti dané látky). 4.Kandidátní molekuly jsou zahrnuty do klinických studií. *Dawson and Kouzarides, Cell 2012 Transkripční kontrola podobně jako u prokaryot se RNA-polymeráza (větš. II) váže na oblast promotoru 1. remodelace chromatinu odhalí promotor http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/18_08_transcription_contr-L.jpg Transkripční kontrola podobně jako u prokaryot se RNA-polymeráza (větš. II) váže na oblast promotoru 2. bazální TFs (modrá) se vážou na promotor 3. regulační TFs (růžová) se vážou na enhancery (červená oblast), silencery nebo na promotor-proximální elementy (fialová oblast). DNA může tvořit vlásenku. 4. bazální a regulační TFs dohromady tvoří INICIAČNÍ KOMPLEX 5. RNA-polymeráza II se váže na promotor a je aktivována - BAZÁLNÍ TRANSKRIPČNÍ KOMPLEX http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/18_08_transcription_contr-L.jpg Transkripční Faktory 1. Bazální a obecné transkripční Faktory (TFs) - ve všech eukaryotických buňkách - nezbytné pro transkripci, ale neposkytují žádnou regulaci -bazální: TFIIA, TFIID, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF -obecné: Oct1, CT1, SPF - nejdůležitější je TFIID a jeho podjednotka TBP (TATA binding protein) - interagují s promotorem - TFIID je první protein, který se váže na DNA při zahájení transkripce (tvorbě iniciačního komplexu) 2. Regulační Transkripční Faktory (TFs) - též zvané aktivátory iniciace transkripce - jsou hlavními regulačními mechanismy genové exprese u eukaryot - proteiny, které se vážou na: a) enhancery (zesilovače transkripce) b) silencery c) promoter-proximální elementy - jsou specifické pro určité geny (nebo rodiny genů) http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/18_08_transcription_contr-L.jpg Funkční klasifikace transkripčních faktorů 1. Konstitutivně aktivní -přítomné stále ve všech buňkách -bazalní a obecné TFII A-H, Sp1, NF1… - 2. Regulační a) vývojové (buněčně specifické) – exprese přísně kontrolována, ale jakmile dojde k aktivaci, nepotřebují další aktivaci – GATA, HNF, PIT-1, MyoD, Myf5, Hox, Winged Helix b) signál-dependentní – vyžadují externí signalizaci pro aktivaci 1.extracelularním ligandem (endokrinní nebo parakrinní) – vazba na DNA v jádře 2.intracelularním ligandem (autokrinní) – např. p53 – vazba na DNA v jádře 3.závislé na membránovém receptoru – nutná signalizační kaskáda vedoucí k aktivaci transkripčního faktoru (fosforylace) Kontrolní elementy Promoter-proximální elementy - vždy umístěny v blízkosti promotoru - na rozdíl od promotoru unikátní pro každý gen - tyto oblasti na DNA umožňují vazbu specifických regulačních TFs - díky PPE je eukaryotická buňka schopná rozlišovat mezi jednotlivými geny a regulovat expresi Enhancery a silencery - zvyšují nebo snižují míru transkripce - také genově specifické - mohou sousedit s promotorem nebo se nacházet uvnitř transkripční jednotky - často bývají umístěny daleko od promotoru (10-100 bazí), pak se tvoří DNA vlásenka - po směru transkripce (downstream) - proti směru transkripce (upstream) - nefungují pokud se vzdálí miliony bazí od promotoru či na jiný chromozom http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/18_07_enhancer_location-L.jpg Transkripční kontrola Zapínání a vypínání určitých genů v určitých buňkách pravděpodobně regulováno unikátními kombinacemi: 1. vazebných míst na DNA (promotor, promoter-proximální elementy, silencery a enhancery) a 2. transkripčních faktorů Analogie s bankovní schránkou - klíč bankéře - stejný pro všechny schránky, ale sám o sobě nefunkční - BAZÁLNÍ FAKTOR - můj klíč - specifický pro určitou schránku, ale sám o sobě ji neotevře - REGULAČNÍ FAKTOR http://vignette1.wikia.nocookie.net/familyguy/images/2/24/FGuy_BrianAndStewie_0345F.jpg/revision/la test?cb=20100412220525 Transkripce genu pro albumin* Všechny buňky obsahují RNA-polymerázu a bazální (obecné) TFs. Jaterní buňky obsahují regulační TFs rozpoznávající všechny kontrolní elementy pro albuminový gen (enhancery/silencery/promotor-proximální elementy). Regulační TFs mozkových buněk nerozpoznávají všechny kontrolní elementy albuminového genu. http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_23.jpg * Albumin: protein krevní plazmy, tvoří 60 % všech plazmatických bílkovin. Důležitý při transportu látek krví (mastné kyseliny, minerály, léky). Syntetizován v játrech. Extracelulární signál (hormon) spouští expresi genů specifických pro svalovou buňku http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/geneticsignaling.jpg http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_24.jpg Jak se proteiny vážou k DNA? - nejčastěji vazba α-helixu s větším žlábkem DNA - nekovalentní vazby: vodíkové můstky a iontové vazby - sequence-specific recognition Motivy vazby: a) Helix-turn-helix - 2 α-helixy spojené krátkou otáčkou b) Zinkové prsty - 1 α-helix a 2 antiparalelní β-listy, vše spojené atomem zinku - více jednotek (zinkových prstů) c) Leucinový zip - 2 α-helixy se okolo sebe ovinují díky pravidelně uspořádaným leucinům d) Helix-loop-helix - kratší a delší α-helix v dimeru Translační iniciační faktory regulují intenzitu translace. U eukaryot je více regulačních faktorů Atenuace, riboswitch Sigma faktor rozeznává pozici promotoru (viz. 4-Transkripce) http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/18_table_1_regulation-L.jpg