Role metabolomiky v systémovébiologii Studium procesů probíhajících v živých organismech DNA mRNA PROTEIN METABOLIT transkripcetranslace biochemické procesy Genom / Genomika Transkriptom / Transkriptomika Proteom / Proteomika Metabolom / Metabolomika „OMICKÉ“ POLE Důležité pojmy METABOLISMUS – látková přeměna  soubor všech enzymových reakcí, při nichž dochází k přeměně látek a energií v buňkách a v živých organismech • anabolismus – reakce spojené s biosyntézou • katabolismus – reakce spojené s degradací • primární • sekundární METABOLOMIKA  vědní disciplína zaměřená na studium metabolomu • kompletní identifikace a kvantifikace všech metabolitů v daném organismu nebo v buňce za daného metabolického stavu. Důležité pojmy METABOLOM  kompletní soubor metabolitů v buňce či biologickém systému v daném čase (Fiehn, 2002) METABOLIT  nízkomolekulární organická sloučenina ( 1000 Da),  produkt látkové přeměny Chemická třída Typické příklady Aminokyseliny, aminy… L-glutamát, L-aspartát Karboxylové kyseliny Kys. Pyrohroznová Alkoholy Glycerol Aldehydy Acetaldehyd, formaldehyd Fosfátové estery, nukleotidy D-glukosa-1-fosfát, ATP, ADP Sacharidy D-glukosa, D-fruktosa Lipidy, steroidy a mastné kyseliny Cholesterol Vitamíny a koenzymy NAD+, NADH Anorganické ionty Fosfáty, nitráty Strategie pro výzkum metabolomiky  METABONOMIKA (metabonomic) • komplexní metabolické studie zejména v toxikologii • ohodnocení tkání a biolologických tekutin na základě změn endogenních metabolitů (výsledek nemocí nebo terapeutického léčení) • bez potřeby specifické identifikace  FINGERPRINTING (metabolic fingerprinting) • komplexní analýza bez nutnosti kvantifikace a identifikace •  screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje  PROFILOVÁNÍ METABOLITŮ (metabolite profiling) • analýza daného souboru metabolitů, např. souboru AMK, organických sloučenin • často semikvantitativní analýza  CÍLENÁ ANALÝZA METABOLITŮ (metabolite target analysis) • kvalitativní i kvantitativní analýza vybraných metabolitů související se specifickou metabolickou reakcí • používána zejména když jsou požadovány nízké limity detekce Strategie pro výzkum metabolomiky Proč se zabývat metabolomikou?  Počet metabolitů v buňce může být až řádově nižší než počet genů a proteinů.  Metabolom – nejnižší linie genové exprese - přímo odráží funkční úroveň buňky.  Změny metabolitů v buňce nejsou regulovány pouze genovou expresí, ale i vlivy životního prostředí.  Kvantifikace metabolitů nabízí přímý přístup ke zkoumání vnitřní kinetiky metabolismu (in vivo kinetics).  Metabolomické experimenty vyžadují 2x – 3x méně času ve srovnání s proteomickými a transkriptomickými experimenty. Metabolom (Escherichia coli K12) (4392 genů) (4464 proteinů) (796 metabolitů) Genom Proteom Vnějšívlivy Nevýhoda oproti jiným omickým přístupům  Obtížné technologie – obtížné měření, dostupnost dat!! RT-PCR, DNA Microarrays, Gene Chips 2D-PAGE MALDI-TOF, 2D-LC, LC-MS Rostechemickákomplexnost analyzovanýchsloučenin Metabolom Genom Proteom NMR, GC-MS, LC-MS, CE-MS Aplikace výzkumu metabolomu  Sledování fyziologického stavu buňky  adaptace na prostředí,  odhad toxicity xenobiotika, vývoj nových léčiv  přítomnost metabolických biomarkerů  stanovení diagnózy a odhad stupně nemocí  průběh terapie  zvýšení výtěžků fermentace, …  Charakterizace buňky – savčí, rostlinné, mikrobiální, GMO,…  Ohodnocení kvality úrody některých rostlin Příprava vzorku  Významně ovlivňuje přesnost, správnost a reprodukovatelnost výsledků  Závislost na typu buněčných struktur a extrahovaných metabolitů Zhášení buněčného metabolismu • rychlá změna teploty • rychlá změna pH Extrakce metabolitů z buňky Separace metabolitů z biomasy VZOREK • analýza • uskladnění VZOREK • analýza • uskladnění Zakoncentrování vzorku • vakuové odpařování •lyofilizace Obrázek: Hlavní kroky přípravy vzorku. Příprava vzorku Extrakce metabolitů z biologického vzorku • Biologické vzorky obsahují tři hlavní třídy metabolitů: • metabolity rozpustné ve vodě • metabolity nerozpustné ve vodě • těkavé metabolity všechny tři třídy metabolitů mohou být nalezeny intra- i extracelulárně 1) Extracelulární metabolity • zisk z extracelulárních médií  Zachycení na koloně  Odpaření rozpouštědla – rozpuštění ve vhodném rozpouštědle  Pokud vzorky těkavé – přímá analýza GC Příprava vzorku 2) Intracelulární metabolity • 2 cesty narušení buněčných stěn:  Nemechanické • Enzymatické – enzymy • Fyzikální – osmotický, teplotní šok • Chemické – chemická činidla:  Kyselá extrakce – HClO4, HCl, CCl3COOH,…  Bazická extrakce – NaOH, KOH  Organickými rozpouštědly – CH3OH, C2H5OH, C2H3N, CHCl3  Mechanické • Ultrasonikace • Superkritická fluidní extrakce (SFE) • French Press  Soli, proteiny, lipidy ve vzorku zhoršují kvantifikaci analytu  užití solid-phase extrakce (SPE)  využívá pevnou fázi a kapalnou k izolaci jednoho nebo jednoho typu analytu z roztoku  využívá stejné typy stacionárních fází jako se využívá v kapalinové chromatografii  limitací je selektivita SPE – ideální pro cílené analýzy jednoho typu, ale nevhodná pro široké profilování metabolitů metabolitů Příprava vzorku Analytické metody Buňka Buněčný extrakt Frakce metabolitů Derivatizace MS GC NMR CE LC ESI-MS Profilování metabolitů, metabolomika Biologické tekutiny NMR, FT-IR, Raman Fingerprinting metabonomics GC HPLC Derivatizace Čištěná frakce metabolitů MS MS RI UV Cílená analýza metabolitů Metody metabolomiky Nukleární magnetická rezonance (NMR) Spektrometrie Podstata  založena na sledování odezvy jader s nenulovým magnetickým momentem umístěných v silném magnetickém poli a jejich interakci s vysokofrekvenčním elektromagnetickým vlněním. Podstata  Je detekována absorpce radiofrekvenčního záření (RFR) jádry atomů v molekule – RFR jsou schopny absorbovat pouze látky s nenulovým spinovým kvantovým číslem l: - atomy s lichým hmotovým číslem: l = n½ ( 1 H , 13C , 15N 31P) Podstata E E spinyjaderné Blokové schéma + Fe Ff- + E Blokové schéma Bruker 400 MHz Bruker 400 MHz NMR Spektrum NMR Spektrum Hmotnostní spektrometrie Podstata  analytická metoda sloužící k převedení molekul na ionty  rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z)  záznam relativních intenzit jednotlivých iontů Blokové schéma + Fe Ff- + E Ionizační techniky Ionizační techniky  Tvrdé ionizační techniky • EI  Jemné ionizační techniky • ESI • MALDI Electron impact (EI) M + e- → M+. + 2 e- Mr Electrospray (ESI) Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) Hmotnostní analyzátory Magnetický analyzátor Kvadrupol Kvadrupol Iontová past (Ion Trap) Ion Trap Analyzátor doby letu (TOF) Detektory Elektronový násobič Fotonásobič MS spektrum MSn MSn Chromatografie  Cvet – separace chlorofylů na CaCO3 1901  termín „Chromatografie“ 1906 Chromatografie Chromatografie Kapalinová chromatografie LC  Mobilní fáze - kapalina  Stacionární fáze- pevná fáze, kapalina Schéma chromatografu Zařízení pro HPLC UV – VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou „Electrospray“ Reverzně fázová chromatografie  Stacionární fáze – nepolární C8, C18  Mobilní fáze – polární – vodné roztoky pH  potlačit disociaci  Eluce – snižováním polarity mobilní fáze ACN, MetOH, Chromatogram Vm Vr’ Vr Analýza kvalitativní  Srovnání retenčních časů píků u vzorku a standardů  „spiking“ – přidání standardu do vzoru  nárůst výšky píků  MS Analýza kvantitativní  Plocha (výška) píku  Metoda externího standardu  Metoda standardního přídavku LC analýza Plynová chromatografie  Mobilní fáze - plyn  Stacionární fáze- pevná fáze, kapalina Schéma plynového chromatografu Plynový chromatograf Nosné plyny Plyn Výhody Nevýhody N2 levný, bezpečná práce nízká tepelná vodivost H2 vysoká tepelná vodivost explosivní He inertní drahý Ar inertní drahý Příprava vzorků pro GC  Plyny, kapaliny - přímo  Pevné látky - po derivatizaci Kolony  Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID křemen, 10 - 100 metrů - délka Kapilární kolona Eluce Eluce Plamenově ionizační detektor FID  Destruktivní  Princip – ionty vznikající spalováním vzorku vyvolávají nárůst proudu Plamenově ionizační detektor FID Detektor elektronového záchytu ECD  Nedestruktivní  Princip – interakce - částic se vzorkem vyvolává pokles proudu Detektor elektronového záchytu ECD - - 63Ni GC MS přímé spojení GC analysa Elektromigrační metody Podstata „Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“ Podstata + Fe Ff- + E Elektromigrační metody  Elektroforéza  Izoelektrická fokusace Dvojrozměrná elektroforéza pI Mr Kapilární elektroforéza 1981 - Jorgenson Lukacsová 2003 - Projekt lidského genomu PAGE - sekvenace DNA 3730xl DNA Analyzer Applied Biosystems Proč CE a biochemie ? Výhody CE  Aplikační diverzita nabité i neutrální látky nízkomolekulární i vysokomolekulární látky chirální i achirální látky bakterie i viry Výhody CE  Aplikační diverzita  Jednoduchá instrumentace Výhody CE  Aplikační diverzita  Jednoduchá instrumentace CZE, MEKC, CIEF, CITP NACE, MEEKC, CGE, ChCE CEC Výhody CE  Aplikační diverzita  Jednoduchá instrumentace  Vysoké rozlišení a účinnost separací  Malá spotřeba vzorku  Rychlost analýzy  Malá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů Elektroosmotický tok Původ elektroosmotického toku CathodeAnode EOF Původ elektroosmotického toku Módy CE Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapiláře Princip MEKC Micela a – střed – rozpustná v obou b – silně hydrofilní – nerozpustná v micele c – silně hydrofóbní – nerozpustná ve vodné fázi Micelární elektrokinetická chromatografie Chiralita –chirální separace ? Thalidomid Thalidomid Chirální separace Kapilární gelová elektroforéza Polymerní matrice pro CGE Kapilární izoelektrická fokusace Instrumentace CE Schéma zařízení pro CZE Napájecí zdroj  stabilizovaný ± 30 kV 300 μA  konstantní napětí nebo proud  obojí polarita  ochrana obsluhy Kapilára  křemenná - 25 -100 μm i.d - 350 μm o.d.  délka až 100 cm délka  polyimidové vnější pokrytí Dávkování Hydrodynamické Elektrokinetické Detekce Spektrofotometrická detekce Fluorescenční detekce CZE-MS Schéma CZE-ESI-MS µCE Bioanalyser Agilent 2100 Charakterizace CE Výhody :  Široká řada aplikací  Minimální organické odpady  nízká cena  Minimální požadavky na množství vzorku (méně než pg nebo nl)  Vysoká účinnost separace  Rychlost analýzy  Automatizace Nevýhoda :  Nízká koncentrační citlivost (CE s UV detekcí)  Dávkování malých objemů analytů do kapiláry  Krátká absorpční dráha paprsku Charakterizace CE Řešení nízké koncentrační citlivosti:  Použití detektoru s vyšší citlivostí.  Bublinkové kapiláry, Z - kapiláry, …  On-line prekoncentrační techniky  field enhanced sample stacking  sweeping  dynamic pH junction  transient isotachophoresis Princip on-line prekoncentračních technik: prekoncentrace analytů v kapiláře do úzkých zón před vlastní separací  možno nadávkovat větší objem vzorku  zvýšení koncentrační citlivosti CE-analýz. Field enhanced stacking (zakoncentrování vzorku zesílením pole) Obrázek: Field enhanced stacking, EOF potlačen. VLEVO: zóna vzorku – zóna s nízkou elektrickou vodivostí – zóna s vysokým elektrickým polem. VPRAVO: zóna základního elektrolytu – zóna s vysokou elektrickou vodivostí – zóna s nízkým elektrickým polem. Obrázek: Field enhanced stacking, rychlost EOF je vyšší než rychlost elektroforetického pohybu. Experiment  Analytická metoda: KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA, on-line prekoncentrace – field enhanced stacking  Metabolity: adeninové nukleotidy: ATP, ADP, AMP adeninové koenzymy: NAD+, NADH, NADP+, NADPH  Živý systém: bakterie Paracoccus denitrificans Experiment  1) Optimalizace metody na standardech. Optimální podmínky separace: KŘEMENNÁ KAPILÁRA: vnitřní průměr 75 m, celková délka 64,5 cm. BGE: 100 mM uhličitan/hydrogenuhličitan sodný s přídavkem  - CD do výsledné 10 mM koncentrace, pH 9,6. VZOREK: směs standardů ve vodě, koncentrace každého standardu ve směsi je 10 M. SEPARAČNÍ NAPĚTÍ: 18 kV, (polarita pozitivní). TEPLOTA KAPILÁRY: 20  0,1 °C. DÁVKOVÁNÍ: hydrodynamické tlakové, dávkováno po dobu 20 s při 35 mbar. Obrázek: Separace standardů za optimálních podmínek. CE-analýza Experiment  2) Optimalizace přípravy bezbuněčného extraktu. Kultivace přes 2 inokula, sklízení, dávkování po 500 l, centrifugace. Extrakce 50 % ACN, centrifugace, zisk supernatantu. Odpaření rozpouštědla na vakuovém koncentátoru Filtrace získaného extraktu přes 5 kDa filtr. + H2O [1] W. Lu, E. Kimball, J. D. Rabinowitz, J. Am. Soc. Mass. Spectrom 17 (2006) 37; [2] E. Kimball, J. D. Rabinowitz, Anal. Biochem. 358 (2006) 273; [3] J. D. Rabinowitz, E. Kimball, Anal. Chem. 79 (2007) 6167. Experiment  3) Analýza bezbuněčného extraktu bakterie Paracoccus denitrificans. CE-analýza Optimální podmínky separace: KŘEMENNÁ KAPILÁRA: vnitřní průměr 75 m, celková délka 64,5 cm. BGE: 100 mM uhličitan/hydrogenuhličitan sodný s přídavkem  - CD do výsledné 10 mM koncentrace, pH 9,6. VZOREK: směs standardů ve vodě, koncentrace každého standardu ve směsi je 10 M. SEPARAČNÍ NAPĚTÍ: 18 kV, (polarita pozitivní). TEPLOTA KAPILÁRY: 20  0,1 °C. DÁVKOVÁNÍ: hydrodynamické tlakové, dávkováno po dobu 20 s při 35 mbar. Obrázek: Analýza bezbuněčného extraktu. Experiment  4) Sledování koncentračních změn metabolitů bakterie Paracoccus denitrificans. [Baker, S., C., Ferguson, S., J., Ludwig, B., Page, M., D., Richter, O-M., H., Spanning, R., J., J., van. Microbiology and Molecular biology reviews. 1998, 62, 1046-1078.] Experiment  4) Sledování koncentračních změn metabolitů bakterie Paracoccus denitrificans. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Čas (s) Plochapíků(mAU) NAD AMP NADP ADP ATP