Role metabolomiky v systémové biologii Studium procesů probíhajících v živých organismech DNA mRNA PROTEIN METABOLIT transkripcetranslace biochemické procesy Genom / Genomika Transkriptom / Transkriptomika Proteom / Proteomika Metabolom / Metabolomika „OMICKÉ“ POLE Systémová biologie Důležité pojmy METABOLISMUS – látková přeměna  soubor všech enzymových reakcí, při nichž dochází k přeměně látek a energií v buňkách a v živých organismech  Primární • anabolismus – reakce spojené s biosyntézou • katabolismus – reakce spojené s degradací  Sekundární • mohou zvyšovat schopnost růstu, reprodukce nebo rozšíření v určitém prostředí • mohou zvyšovat naději na přežití, poskytnout ochranu proti kompetitorům nebo predátorům. Důležité pojmy METABOLOMIKA  vědní disciplína zaměřená na studium metabolomu • kompletní identifikace a kvantifikace všech metabolitů v daném organismu nebo v buňce za daného metabolického stavu. →Rychlé zastavení metabolismu →příprava vzorku nesmí vyloučit žádné metabolity →vysoká účinnost a senzitivita analytických technik Důležité pojmy METABOLOM  kompletní soubor metabolitů v buňce či biologickém systému v daném čase (Fiehn, 2002) METABOLIT  nízkomolekulární an– či organická sloučenina (< 1000 Da),  produkt látkové přeměny Chemická třída Typické příklady Aminokyseliny, aminy… L-glutamát, L-aspartát Karboxylové kyseliny Kys. Pyrohroznová Alkoholy Glycerol Aldehydy Acetaldehyd, formaldehyd Fosfátové estery, nukleotidy D-glukosa-1-fosfát, ATP, ADP Sacharidy D-glukosa, D-fruktosa Lipidy, steroidy a mastné kyseliny Cholesterol Vitamíny a koenzymy NAD+, NADH Anorganické ionty Fosfáty, nitráty Strategie pro výzkum metabolomiky  FINGERPRINTING • komplexní analýza intracelulárních metabolitů bez nutnosti kvantifikace a identifikace • ⇒ screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje  FOOTPRINTING • komplexní analýza extracelulárních metabolitů bez nutnosti kvantifikace a identifikace • ⇒ screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje  PROFILOVÁNÍ METABOLITŮ (metabolite profiling) • analýza daného souboru metabolitů, např. souboru AMK, organických sloučenin • často semikvantitativní analýza  CÍLENÁ ANALÝZA METABOLITŮ (metabolite target analysis) • kvalitativní i kvantitativní analýza vybraných metabolitů související se specifickou metabolickou reakcí • používána zejména když jsou požadovány nízké limity detekce Strategie pro výzkum metabolomiky Strategie pro výzkum metabolomiky  METABONOMIKA (metabonomics) • komplexní metabolické studie zejména v toxikologii a farmakologii • ohodnocení tkání a biolologických tekutin na základě změn endogenních metabolitů (výsledek nemocí nebo terapeutického léčení) • bez potřeby specifické identifikace Proč se zabývat metabolomikou?  Počet metabolitů v buňce může být až řádově nižší než počet genů a proteinů.  Metabolom – nejnižší linie genové exprese - přímo odráží funkční úroveň buňky.  Změny metabolitů v buňce nejsou regulovány pouze genovou expresí, ale i vlivy životního prostředí.  Kvantifikace metabolitů nabízí přímý přístup ke zkoumání vnitřní kinetiky metabolismu (in vivo kinetics).  Metabolomické experimenty vyžadují 2x – 3x méně času ve srovnání s proteomickými a transkriptomickými experimenty. Metabolom (Escherichia coli K12) (4392 genů) (4464 proteinů) (796 metabolitů) Genom Proteom Vnějšívlivy Problemy s metabolity 1. Počet metabolitů 2. Strukturní, fyzikálně chemická diverzita 3. Koncentrační diverzita 4. Proměnnost a stabilita Nevýhoda oproti jiným omickým přístupům  Obtížné technologie – obtížné měření, dostupnost dat!! PCR a RT-PCR, DNA Microarrays, Gene Chips 2D-PAGE MALDI-TOF, 2D-LC, LC-MS Rostechemickákomplexnost analyzovanýchsloučenin Metabolom Genom Proteom NMR, MS GC-MS, LC-MS, CE-MS 21 AMK 4 BASE Aplikace výzkumu metabolomu  Sledování fyziologického stavu buňky  adaptace na prostředí,  odhad toxicity xenobiotika, vývoj nových léčiv  přítomnost metabolických biomarkerů  stanovení diagnózy a odhad stupně nemocí  průběh terapie  zvýšení výtěžků fermentace, …  Charakterizace buňky – savčí, rostlinné, mikrobiální, GMO,…  Ohodnocení kvality úrody některých rostlin Příprava vzorku  Významně ovlivňuje přesnost, správnost a reprodukovatelnost výsledků  Závislost na typu buněčných struktur a extrahovaných metabolitů Zhášení buněčného metabolismu • rychlá změna teploty • rychlá změna pH Extrakce metabolitů z buňky Separace metabolitů z biomasy VZOREK • analýza • uskladnění VZOREK • analýza • uskladnění Zakoncentrování vzorku • vakuové odpařování •lyofilizace Analytické metody Buňka Buněčný extrakt Frakce metabolitů Derivatizace MS GC NMR CE LC ESI-MS Profilování metabolitů, metabolomika Biologické tekutiny NMR, FT-IR, Raman Fingerprinting metabonomics GC HPLC Derivatizace Čištěná frakce metabolitů MS MS RI UV Cílená analýza metabolitů Metody metabolomiky Nukleární magnetická rezonance (NMR) Spektrometrie Podstata  založena na sledování odezvy jader s nenulovým magnetickým momentem umístěných v silném magnetickém poli a jejich interakci s vysokofrekvenčním elektromagnetickým vlněním. Podstata  Je detekována absorpce radiofrekvenčního záření (RFR) jádry atomů v molekule – RFR jsou schopny absorbovat pouze látky s nenulovým spinovým kvantovým číslem l: - atomy s lichým hmotovým číslem: l = n½ ( 1 H , 13C , 15N, 31P) Podstata E E∆ spinyjaderné Blokové schéma + Fe Ff- + E Blokové schéma Bruker 400 MHz Bruker 400 MHz NMR Spektrum Hmotnostní spektrometrie Literatura Hmotnostní spektrometrie MS - mimořádně citlivá metoda, - destruktivní metoda, - minimální spotřeba vzorku, - určení MW a dalších strukturních informací. Podstata  analytická metoda sloužící k převedení molekul na ionty  rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z)  záznam relativních intenzit jednotlivých iontů Blokové schéma + Fe Ff- + E Ionizační techniky Ionizační techniky  Tvrdé ionizační techniky • EI  Jemné ionizační techniky • ESI • MALDI Electron impact (EI) M + e- → M+. + 2 e- Electrospray (ESI) Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) Hmotnostní analyzátory Kvadrupol Kvadrupol Kvadrupol Iontová past (Ion Trap) Ion Trap Ion Trap Analyzátor doby letu (TOF) Analyzátor doby letu (TOF) Detektory Elektronový násobič MS spektrum MSn MSn Mikhail Semyonovich Tsvet Chromatographia 1906 Literatura Chromatografie Chromatografie Kapalinová chromatografie LC  Mobilní fáze - kapalina  Stacionární fáze- pevná fáze, kapalina Schéma chromatografu Zařízení pro HPLC UV – VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou Chromatogram Vm Vr’ Vr Analýza kvalitativní  Srovnání retenčních časů píků u vzorku a standardů  „spiking“ – přidání standardu do vzoru → nárůst výšky píků  MS Analýza kvantitativní ↓ Plocha (výška) píku  Metoda externího standardu  Metoda standardního přídavku LC analýza Plynová chromatografie  Mobilní fáze - plyn  Stacionární fáze - pevná fáze, kapalina Schéma plynového chromatografu Plynový chromatograf Nosné plyny Plyn Výhody Nevýhody N2 levný, bezpečná práce nízká tepelná vodivost H2 vysoká tepelná vodivost explosivní He inertní drahý Ar inertní drahý Příprava vzorků pro GC  Plyny, kapaliny - přímo  Pevné látky - po derivatizaci Kolony  Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID křemen, 10 - 100 metrů - délka Kapilární kolona Eluce Eluce Plamenově ionizační detektor FID  Destruktivní  Princip – ionty vznikající spalováním vzorku vyvolávají nárůst proudu Plamenově ionizační detektor FID GC MS přímé spojení GC analysa Elektromigrační metody Literatura Frederic Reuss (1807) Katoforéza Podstata „Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“ Elektromigrační metody  Elektroforéza  Izoelektrická fokusace  Izotachoforéza Dvojrozměrná elektroforéza pI Mr Kapilární elektroforéza 1981 - Jorgenson Lukacsová 2003 - Projekt lidského genomu Proč CE a biochemie ? Výhody CE  Aplikační diverzita nabité i neutrální látky nízkomolekulární i vysokomolekulární látky chirální i achirální látky bakterie i viry Výhody CE  Aplikační diverzita  Jednoduchá instrumentace Výhody CE  Aplikační diverzita  Jednoduchá instrumentace CZE, MEKC, CIEF, CITP NACE, MEEKC, CGE, ChCE CEC Výhody CE  Aplikační diverzita  Jednoduchá instrumentace  Vysoké rozlišení a účinnost separací  Malá spotřeba vzorku  Rychlost analýzy  Malá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapiláře Princip MEKC Micela a – střed – rozpustná v obou b – silně hydrofilní – nerozpustná v micele c – silně hydrofóbní – nerozpustná ve vodné fázi Micelární elektrokinetická chromatografie Instrumentace CE Schéma zařízení pro CZE Napájecí zdroj  stabilizovaný ± 30 kV 300 μA  konstantní napětí nebo proud  obojí polarita  ochrana obsluhy Kapilára  křemenná - 25 -100 μm i.d - 350 μm o.d.  délka až 100 cm délka  polyimidové vnější pokrytí Dávkování Hydrodynamické Elektrokinetické Detekce Spektrofotometrická detekce Fluorescenční detekce Quo vadis GlatzCE ? Využití CE v metabolomice – systémová biologie mikrobiální, rostlinná a živočišná metabolomika „Metabolome Targeting“ Quo vadis GlatzCE ? Využití CE v metabolomice - biomarkery Metabolomika v asistované reprodukci