IV107 Bioinformatika I
Přednáška 3
Katedra informačních technologií Masarykova Univerzita Brno
Podzim 2019
Před týdnem
DNA nepřímo (přes proteiny) řídí většinu procesů v buňce. Její struktura vykazuje všechny potřebné rysy. Je nositelem genů.
bxprese genu
► transkripce
► translace Struktura proteinů
► primární (sekvence aminokyselin)
► sekundární (a, f3, etc.)
► terciární (3-D)
► kvartérní (makromolekulami komplexy) ^%
h ttp ://www. m o I v i z. o rg/
Hemoglobin Chime
An introductory presentation suitable for lectures or individual study. (Deutsch, Poituques)
DNA Structure Chime
An introductory level, nonlinear self-paced tutorial. (Deutsch, Espaňol, Fortucjuěs)
řWmlEŮ Compatible*
Antibody Chime
An introductory presentation suitable for lectures or individual study, (Deutsch)
MHC Chime
The Major Histocompatibility Complex presents peptides from foreign proteins to T lymphocytes, crucial to disease immunity.
Lipid Bilayers and Membrane Channel Chime
Introduces cholesterol and phospholipids, then proceeds to lipid bilayer and the gramicidin membrane channel embedded within the bilayer. Includes molecular dynamics simulations of both gel and fluid membrane states. By Eric Martz and Angel Herraez. (Espafiol)
Molecular Vibrations: IR Spectrum Chime     Water Chime
by Motyka, Lahti S Lancashire.
*WinlE6 Compatible'
Lac repressor Chime
bending the DNAoperon as it goes from nonspecific to specific DNA binding.
' Win-IE6-C om pal ible'
Theoretical simulation of 10 water molecules condensing into a hydrogen-bonded droplet. Includes challenge questions tor students,
'Win-IES-Coinpatihle*
Bacterial Flagellar Hook Chime
Bacterial flagella aie whip-like organelles that bacteria use to swim about. The hook acts as a molecular universal joint. It's composed of over 100 protein subunits.
*Win-IE6-Compatible'
s
I
Schéma 2
amino acŕdí have preferred conformations
evolution
lo^ energy state
primary
protcfn structure
tour Jevels of structure
amine «j. idi
chain of amino acids
secondary
tertiary folds/domains
quaternary   multiple folds
□ i5P
Outline
Makromolekuly v laboratoři
DNA
Rekombinace DNA a klonování Syntéza, kopírování a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenování DNA Detekce hybridizací a sekvenování DNA Proteiny
Analýza sekvencí
□ i5P
Techniky manipulující DNA a RNA
► Rekombinace DNA a klonování
► izolace z buněk
► štěpení restrikčními endonukleázami
► rekombinace (ligace)
► transformace organizmů rekombinantní DNA
► Syntéza, kopírování a amplifikace DNA
► syntéza oligonukleotidů
► transkripce in vitro
► syntéza cDNA
► amplifikace pomocí PCR
► Editace DNA
► Cas9-CRISPR
► TALEN
► ZF nukleázy
► Detekce, analýza a sekvenace
► elektroforéza (dělení podle velikosti)
► hybridizace se značenými sondami
► určování sekvence
Reštrikční endonukleázy
enzym	zdroj	reštrikční místo	fragment[kbp]
Alul	Arthrobacter luteus	AG^CT TCtGA	0.3
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens H	G^GATC C C CTAGtG	7.0
EcoRI	Escherischia coli R	G^AATT C C TTAAtG	3.1
Haelll	Haemophilus aegyptus	GGJ.CC CCtGG	0.6
Notl	Norcadia otitidis-caviarum	GCJ.GGCC GC CG CCGGtCG	<9700
Pstl	Providencia stuartii	C TGCA^G GtACGT C	7.0
Taql	Thermus aquaticus	T^CG A A GCtT	1.4
Hindlll	Haemophilus influenzae Rd	A^AGCT T T TCGA^A	3.1
Rekombinace a klonování
Sad S mä Xbä Pst\ HindW
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTC GACCTGCAGGCATGCAAGCTT
Rekombinace DNA a klonovani
Inserting a DNA Sample into a Plasmid
Identifikace DNA na agarózovém gelu
V laboratoři
http://www.ct.gov/dps/cwp/view.asp?a=2155&q=314998
http://www.sme.Sk/c/3753490/Genetika-nadei-pre-pacientov.html
PCR (po I y m e rázová řetězová reakce)
PCR : Polymerase Chain Reaction
30 - 40 cycles of 3 steps :
Slep i : denaturatíojQ
1 minut 94 ŮC
s>
ill
;I   Step 2 : anneaJin;
45 seconds 54 CC forward and reverse
primers
in
5'rrnrn#nwr^^ 3 extension
s I I:*   x   I   ^ ' ,  3-^JiauiJüMLLLUJJiLlJjililJllll s*
I I "
- I -
y I
li Ix
2 minutes 72 °C only dNTP's
PCR (polymerázová řetězová reakce)
Third
cycle
PCR (polymerázová řetězová reakce)
		Ven fiťii Lion of PCR product on ágarose or scparidc gci	
			
	-1857		
			
	1058 — 929		
]kb = —			
5ťHj-			
			
		] 1 ItiJJer         PCR Jragrncnts	
PCR (polymerázová řetězová reakce)
Cas9-CRISPR
Target Genomic Locus *
Protospacer Adjacent Motif tPAM)
Target sequence to cleave 5
Your guide RNA sequence
Promoter
'.ratrRNA buift into vectors
dL E,
TM
Hi
Cas9
SmartNuclease All-in-one Vector
EFla:ci«#CASW10ft-:.C'«i rattf ASW1A-1 CW.üt*KAS94DA-1. MSCV: tut SCASS&DArJ GKiCJiti¥QlS98aAr1
Gone
.jn«
NL5
□ i5P
=
Cas9-CRISPR
TALEN
(a)
LTPDGWAIASHDGGKQALETVGRLLPVLCQDHG
_____________-~ NLS AD
II l l l l l l l l l I   Ii l Ii-
DNA Binding Domain ^
n
IhD N! NG HD NN HD HD Nl HD NG Nl HD HD NN NÖ I    j   I    J    I   I    I   I   I    I    I   I    I II
5   C  A T
H D
C   G  C   C A C T Target DNA
C    Nl->A    NG T
A C   C   G T
NN^ G
(b)
NLS
C
NLS
I
im
n
DNA Binding Domai
IIMMIIIIinTTT
MIM J
5 1 - ac gta gc t gca rc g c cac t ac c g r at ga^#ö^c t gt gc ag tt gt g er ttgtctaccgta
31 - t gcat c gac gtagc gg tg at g gcatacta^ajdga ca c gtcaa ca c ca a a c ag a tggc at
*........J...... -»
□ i5P
ZF nukleäzy
C -	A	C	C	C	A	C	A t	\	G	T
G		G	G	G	T	G	t		C	A
										
GIG
GT
CA
A
Gl A
T
GIC
GIGIT
GC
A
C
Double-strand DNA break
c	A	C	C	C	A	C	A	A	G	T	C	A	
G	T	G	G	G	T	G	T	T	C	A	G	T	AIAICIC
TlTlGlG	G	G	T	A	G	A	A	G	C	G	G	T	C
	C	C	A	T	C	T	T	C	G	C	C	A	G
Error prone NHEJ
□ i5P
Sekvence DNA
► Pořadí nukleotidů ve směru 5' -> 3' uloženo pro budoucí generace jako dlouhý řetězec symbolů A, C, G a T
► Dobrá zpráva pro budoucnost bioinformatiků: zatím je osekvenováno jenom asi 1000 organizmů, data budou přibývat
► Polymorfizmus: Rozdíl mezi jedinci Horno sapiens sapiens 1/1000 bazí
► Personál Genomics Project (PGP)
□ i5P
Sekvence DNA
► Sekvenace se dělá ve dvou fázích
► Za použití DNA polymerázy a směsi normálních a modifikovaných deoxyribonukleotidů se syntetizují vlákna DNA (imitace replikace), templátem je sekvenovaná molekula DNA
► Produkty polymerizace se v automatických strojích chromatograficky dělí podle velikosti a vypovídají o sekvenci
► Jedna reakce podá informaci o 500-1000 bazích
Dideoxynukleotid neumožňuje navázání dlaších nukleotidů
M H
Dideoxylhymidine triphosphate (ddTTP)
s
I
□ i5P
Polymeráza se zastaví při použití ddNTP
aj - flrecfiCĚňireccnfncflňrrCTfifiCfiflflTffiflTfňCTfiTřf^      - 5"
5r	—	r hľijľgc i ňflceiii d 1111 uc Ht ľc 11 r h oč r h i;cún r >
5r	—	Tfl^eceííTnflcerrTflTírTT cg ňc cc n rn &c t*
5'	-	T ňCGCGCIftACGGTRTGT T CCHC CE¥1T*
5'		t n ľgcgc i nnť cc [ n i c i t cc ic cc t i#
Sh	-	TflCGCG^IAflCGtilHlClTTCGJlCtGlt
5'	-	T f)C6CGGTflňCGGTffTGTT«
= '	-	t h rnrcrri nnr ĽfrUTTCTi
5-	-	t n ľgcgc i nncGci ftTi
v	-	TFR'GĽOlilRňCSGT*
Tŕ)C6CGGI»
□ i5P
=
Výsledek automatického sekvenování
Výsledek automatického sekvenování
40 50 eo VO SO 90
ľrt'C ÄľG ATS ATTTľľ GCATG TG C TG AAAGTTG GC G G TG C C G G AGTGC GC TCAC CGC
Sekvenace hybridizací je založena na vázání se DNA na destičku s různými oligonukleotidy
□ r5P
Přechod DNA pórem v membráně nitridu silikonu generuje elektrický signál, který by mohl umožnit sekvenování
Historie sekvenace genomů
1975	bakteriofag MS2	
1977	bakteriofag PhiX174	5,375 bp
1982	bakteriofag Lambda	
1984	HIV-1	
1990	virus HCMV	230 Kbp
1995	H. influenzae	1,83 Mbp
1996	E. coli	4,60 Mbp
1996	S. cerevisiae	12,00 Mbp
1998	C. elegans	96 Mbp
2000	D. melanogaster	120 Mbp
2000	A. thaliana	130 Mbp
2001	H. sapiens	3 Gbp
2001	M. musculus	3 Gbp
2018	T. aestivum	14 Gbp
Microarray
Cancer Cells Normal Cells
"Rt-d Fluůrflseont" Targets "Green Fluor*seen;" Tanjets
Combine Targets j
Hybridize to
Microarray
□ s"
Techniky manipulující proteiny
► izolace z buněk
► elektroforéza (dělení podle velikosti)
► zjišíování aktivity
► štěpení peptidázami
► určování sekvence
► generování protilátek pro daný protein
► ELISA a podobné testy
► produkce rekombinantních proteinů (např lacZ, GFP)
► krystalizace a určování struktury
► hmotnostní spektrometrie
.PAGE (eleKtroíoréza
polyaKrylai™
idovém
ge\u)
fragments
frame
electrode
Sod\um
dodecyl aukcie zápomý naboj
naturuie prtfeW
a
dava
a
Pole na bázi proteinů
X_X.
Antibody chip
_A.
Ailtig&n chip
Protein i.hip
Sera + antibodies -► -
Anybodies
I
Antigefi-anlibody
Antigen-antibody
Prolet n-protehn
Proleirv-liposooi*
Prolet n-dnig
Enzyme-substrate
.A_A.
Ligiind chip
Ci»rtnjhydf«ite chip
I
Antibody-carbohydrat»
□
Biosenzory v proteinových čipech
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA testing of western flower thrips for INSV (red color is a postive result)
J
H
HRP^ Linked Antibody
TMB Substrate
Detection Antibody
Targe* Protein
Capture Antibody
iä1
□ i5P
Slovní pojmů molekulární biologie
central dogma	gene	RNA
genome	ORF	transcription
DNA	gene structure	mRNA
nucleotide	promoter	gene expression
375'	intron	microarray
hybridization	exon	probe
replication	pro karyote	EST
DNA polymerase	ATG	translation
vector	GC content	codon
plasmid	eukaryote	protein
sequence	alignment	TATA
PCR	enhancer	mass spectrometry
DNA sequence	silencer	signal transduction
proteome	antibody	western blot
restriction enzyme	endonuclease	phylogenetics
Příště
Analýza sekvencí
Outline
Příloha
□ i5P
For Further Reading
x
□ i5P