PŘEHLED SEKVENAČNÍCH METOD
Letní škola bioinformatiky 2014, Brno
Ing.Matej Lexa, Phd (FI MU Brno)
CO JE TO SEKVENACE A CO SE BUDE SEKVENOVAT?
POŘADÍ NUKLEOTIDU V DNA
ONA
SEKVENOVÁNÍ DNA
od manuálních metod po plně automatizované
1. generace (od cca 1976):
Maxam-Gilbert (čtyři štěpící reakce - G, AG, C, TC) Sangerova metoda (terminace syntézy druhého vlákna)
HEL Applied Biosystemí
2. generace (next-gen; NGS; od cca 2000-2005):
Solexa/Illumina (polymerace fluorescenčně značených oligonukleotidů) 454/Roche (pyrosekvenace, PP enzymaticky vázán na emisi světla) SOLiD/LifeTechnologies (ligace fluorescenčně znač. oligonukleotidů) Polonator (ligace fluorescenčně znač. oligonukleotidů) Complete Genomics (nepoužívá PCR, ligace na shluky ssDNA)
Sekvenování jednotlivých molekul: Helicos (optika)
SMRT/Pacific Biosciences (nanopovrch s ukotvenou polymerázou) IonTorrent (polovodičové sekvenování, místo světla protony) Sekvenování na membránách:
Oxford Nanopore a pacific
Complete é illumine
1 genomics
<K> life
NABSys NobleGen
BIOSCIENCES
Helicos
NANOPORE NobleGen řÝNABsys
ion rorrent
KRITICKÁ FÁZE ANALÝZ 1. a 2. GENERACE
Příprava knihovny
Sekvenace
Analýza dat
PRINCIPY SEKVENACE DNA
sekvenčně-specifické štěpení DNA
polymerace:
ATCAGTGCGATGCA- (ANCHOR)
TAGTCACG
DNA pol
<-C*
hybridizace:
ATCAGTGCGATGCA - ANCHOR TAGTCACGCTACGT*
ligace:
ATCAGTGCGATGCA - ANCHOR TAGTCACG—-CTacgt*
DNA lig
nanopory a průchod membránou
DŮVODY SEKVENACE
- de novo sekvenace
- organismy
- populace (metagenomika)
- resekvenování
- detekce polymorfismů
- SNP
- rekombinace
- zjištění stavu metylace
- měření exprese
(jako náhrada technik založených na hybridizaci)
DRUHY SEKVENACE dle způsobu přípravy vzorků a použitých reaktantů
DNA-seq
ChIP-seq (imunoprecipitace chromatinu)
RNA-seq
sRNA-seq
Bis-seq, BisChIP-seq (metylační analýza)
CLIP-seq ("cross-linking immunopreciputation"; RNA-prot)
Ig-seq,... (viz *Seq @ http://liorpachter.wordpress.com/seq/
Klíčové kroky a parametry sekvenování DNA
- izolace DNA
- fragmentace DNA
- ligace adaptérů
- namnožení sekvencí
- typ podložky nebo média
- typ enzymů (pol, lig)
- typ detekce (světlo, proud)
Shotgun genome sequencing
Hierarchical shotgun sequencing
Genomic DNA
BAG library
Organized mapped large clone contigs
BAG to be sequenced
Shotgun clones
_C — f- _+ S r *   -f —
Shotgun sequence
, AC CGTAAATGGGC TGATCATGC TTMA
TGATCATGCTTAAACCCTGTGCATCCTACTG
Assembly
ACCGTA.AATGGGCTGATCATGC'rTAMCCCTGTC-CATCCTACTG
Figure 4A.4 Sequencing an oligonucleotide by the Maxam-Gilbert method
Q Preparation of homogeneous single-strand DNA
: T T A G C C3'
Q Addition of 32P as 5' phosphate
IjTTAGCC
Q Cleavage at specific nucleotides
i'ATTGAC
-A T T G A C
Maxam-Gilbert
G reaction	A reaction,	T reaction,	C reaction
	with some	with some	
	G cleavage	C cleavage	
	(underlined)	(underlined)	
"ATTGACTTAGCC
-ATTGACTTA
*ATT
Whole oligonucleotide
Fragment length (bases)
'ATTGACTTAGCC ■ATTGACTTA ■ATTGACTT ■ATTG -AJJ
'ATTGACTTAGCC 'ATTGACTTAGCC
ATTGACTTAGC 'ATTGACTTAGC
'ATTG ACT TAG "ATTGACTTAG
ATTG ACT VATTGA
'ATTGAC
'ATTGA
'AT 'A
Q Electrophoresis O Radioautography
Q Read sequence
DMS
Pi peri dine
From Mathews and van Holds: Biochemistry 2/e. © The Benjamln/Cummings Publishing Co., Inc.
Maxam-Gilbert
G C + +
Maxam-Gilbert
3'
Sangerova metoda (terminace dideoxynukleotidy)
Gel:
Normal nucleotides:
Dideoxy Chan Terminators:
OH z , O
Q H
0
(H z , O
H H
*
Spr br
H H
GCGRRTGCGTCCRCRRCGCTRCRGGTG
GCGRRTGCGTCCRCRRCGCTRCRGGT
GCGRRTGCGTCCRCRRCGCTRCRGG
GCGRRTGCGTCCRCRRCGCTRCRG
GCGRRTGCGTCCRCRRCGCTRCfl
GCGRRTGCGTCCRCRRCGCTRC
GCGRRTGCGTCCRCRRCGCTH
GCGRRTGCGTCCRCRRCGCT
GCGRRTGCGTCCRCRRCGC
GCGRRTGCGTCCRCRRCG
GCGRRTGCGTCCRCRRC
GCGRRTGCGTCCRCRfl
GCGRRTGCGTCCRCfl
GCGRRTGCGTCCRC
GCGRRTGCGTCCfl
GCGRRTGCGTCC
GCGRRTGCGTC
GCGRRTGCGT
GCGRRTGCG
GCGRRTGC
GCGRRTG
GCGRRT
Sangerova metoda
Sangerova metoda
454 (pyrosekvenování)
454 (pyrosekvenování)
Ugřrt +■ My lucif«in
454 (pyrosekvenování
GS FLX Data
3, Read datu canvertéd kula "fluwüränia
Roche 454 GS FLX
Genomic DIVA
POLONATOR
0) Sheering to small fragments
(5b) Ligation with oligo pools added in cycles and four-color imaging
SOLID (sekvenace ligací, "polony" = polymerase colony
SOLiD
SOLiD
SOLiD 3 Plus
IUumina
Illumina ("bridge amplification")
1.   PREPARE GENOMIC DNA 2.   ATTACH DNA TO SURFACE 3.   BRIDGE AMPLIFICATION
SAMPLE
Randomly fragment genomic DNA Bind single-stranded fragments Add unlabeled nucleotides and an-
and ligate adapters to both ends of randomly to the inside surface of the zyme to initiate solid-phase bridge
the fragments. flow cell channels. amplification.
Illumina ("bridge amplification")
4.   FRAGMENTS BECOME 5.   DENATURE THE DOUBLE- S.   COMPLETE AMPLIFICATION
DOUBLE-STRANDED STRANDED MOLECULES
The enzyme incorporates nucleotides Denature tion leaves single-stranded Several million de nee clusters of
to buiId double-stranded bridges on tamptatof. flnchored to the eubstrate. double-stranded DNA are generat-
the solid-phase substrate. in aacr. channel of the flow call.
63
Illumina
7.   DETERMINE FIRST BASE
8.   IMAGE FIRST BASE
9.   DETERMINE SECOND BASE
G
The first sequencing cycle begins by adding four labeled reversible terminators, primers, and DNA polymerase.
After laser excitation, the emitted fluorescence from each cluster is captured and the first base is identified.
The next cycle repeats the incorporation of four labeled reversible terminators, primers, and DNA polyineraie.
Illumina
10. IMAGE SECOND CHEMISTRY 11. SEQUENCING OVER MUL- 12. ALIGN DATA
CYCLE TIPLE CHEMISTRY CYCLES
After laser excitation, the image is captured as before., and the identity of The second base is recorded.
The sequencing cycles are repeated to determine the sequence of bases in a fragment, one base at a time.
The data are aligned and compared to ■ reference, and sequencing differences are identified.
Complete Genomics - zhluky DNA "nanoballs" (nepoužívá PCR, ale rolling circle replication)
Complete Genomics
300 nm pozic, 2.8 mid na jednom sekvenovacim sklicku
DNBs
T'x3" slide
Patterned substrates
Each spot contains a single DNB
Complete Genomics
Si Ikon substrate consisting of 12 slides
Magnification of a section; Each spot will accommodate only a single DNB
Complete Genomics
cPAL - "Probe-Anchor Ligation sequencing", 70 bazi / zhluk
Probes
mwmf
Matching \ probe binds to | DNA licmse binds    oenomk DNA J matching probe to anchor
Anchor
mm
Adaptor
Genomic DNA
Ion Torrent (polovodičové sekvenování) dnes součást LifeTechnologies
detekuje protony uvolněné při polymerizaci DNA
tSMS - "single molecule sequencing" Helicos (existuje jenom několik strojů)
SMRT - "single molecule real time" Pacific Biosciences
Sekvenovanf nanopory
The Envisioned Device: A Solid State Nanopore with Embedded Nanotube Sensor
Oxford Nanopore Technologies
Nanopor tvořen proteinem alpha-hemolysin s cyclodextrinovým adapterem (místo detekce nukleotidů).
Typický postup zpracování NGS dat
Kontrola kvality a čistení dat
Zastoupení nukleotidů
Kvalita nukleotidů na pozicích (log skóre "phred"; 10 = 90%) Kontaminace adaptéry a jinými cizími sekvencemi Stupeň duplikca sekvencí Zkrácení sekvencí na společnou délku
Např.:
http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/ http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/
Mapování sekvencí
• Index
_ Tabulky slov, hešovací tabulky _ Suffixové stromy a pole
_ Burrows-Wheelerova-Transformace (BWT) sufixového pole _ FM-Index
• Filtrování
_ S jednou nebo více shodami
• Verifikace
_ prodloužení
- Dynamické programování
BWA, Bowtie2, Soap2 mrFAST, SHRÍMP2, RazerS3, Masai GSNAP, Stampy, BWA mem (tolerují mezery)
•  RNA-Seq, Bis-Seq, speciální obsluha repetitivních sekvencí
TopHat, STAR, Bismark, lobSTR,...
Analýza DNA pomoci STM (scanning tunelling microscope)
(c)
l 4
Sl M
Z 5 V
H—t-
T=ftT
r> Ä
1 1					
(e)	T=7B K				
				■	
					
i MM					
				v TI	
M	'Ty	■t j			
					
1	1   4 -7	■f	1		j a
		_ .			
půlytĚÍ-půlyfO
Tunnel Junction I
Tmiiifl
Ai»poľf4$}-pgly(a
Data growth in DNA sequencing
Ding et al., 2010. Analysis of next-generation genomic data in cancer: accomplishments and challenges. Hum Mol Gen 19
http://www.thegeneticgenealogistxom/2008/09/24/ancestral-gps-pinpointing-the-geographic-origin-of-autosomal-dna-sequence
http://en.wikipedia.org/wiki/Genealogical_DNA_test
http://wwwiiercebiotechitxom/story/illumina-backs-venters-plan-create-worlds-largest-human-genome-sequencing-c/2014-03-05