IV107 Bioinformatika I Přednáška 3 Katedra informačních technologií Masarykova Univerzita Brno Jaro 2011 aculty-logc Před týdnem DNA nepřímo (přes proteiny) řídí většinu procesů v buňce. Její struktura vykazuje všechny potřebné rysy. Je nositelem genů. Exprese genů ► transkripce ► translace Struktura proteinů ► primární (sekvence aminokyselin) ► sekundární (a, (3, etc.) ► terciární (3-D) ► kvartérní (makromolekulami komplexy) http://www.molviz.org/ Hemoglobin Chime An introductory presentation suil.ťlo lor lectures or individual study, i Do u tah. Foituquó:'! DNA Structure Chime Antibody Chime S ■ . An introductory level, nonlinear self-paced M An introductory presentation suitable for tutorial. (Deutsch, Espaiiol, Portugues) tbNBT lectures or individual study. jMt E (Deutsch) 'Wln-IE6-CoinpalJble- W/' MHC Chime The Major Histocompatibility Complex presents peptides from foreign protein: to T ■ lymphocytes, civ; i-il io disoxo iiiiniuml;. Lipid Bilayers and Membrane Channel Chime Introduces cholesterol and phospholipids, then proceeds to lipid bilayer and the gramicidin membrane channel embedded within the bilayer. Includes molecular dynamics simulations of both gel and fluid membrane states. By Eric Mart: and Angel Herraei. (Espaiiol) Molecular Vibrations: IR Spectrum Chime by Motyka, Lahti S Lancashire. 'Win IE6 Compatible' Water Chime Theoretical simulation of 10 water molecules condensing into a hydragen-bonded droplet. Includes challenge questions for students, *Wln-IE6-Compatlble' Lac repressor Chime \ bending the DNAoperon as it goes from nonspecific to specific DNA binding, •Win-IE6-Ccm|Kitible' Bacterial Flagellar Hook Chime Bacterial flagella are whip-like organelles that bacteria use to swim about. The hook acts as a molecular universal joint. It's composed of over 100 protein subunits. *Win-IE6-Compaiible* faculty-logo Schema 1 faculty-logO Schema 2 aculty-logc Outline Makromolekuly v laboratoři Rekombinace DNA a klonovaní Syntéza, kopírovaní a PCR (amplifikace) Detekce hybridizací a sekvenovaní DNA Proteiny Analýza sekvencí aculty-logc Techniky manipulující DNA a RNA ► Rekombinace DNA a klonování + izolace z buněk + štěpení restrikčními endonukleázami + rekombinace (ligace) + transformace organizmů rekombinantní DNA ► Syntéza, kopírování a amplifikace DNA + syntéza oligonukleotidů + transkripce in vitro + syntéza cDNA amplifikace pomocí PCR ► Detekce, analýza a sekvenace + elektroforéza (dělení podle velikosti) »- hybridizace se značenými sondami »- určování sekvence aculty-logc □ g - » -51"=! -O^O Reštrikční endonukleázy enzým zdroj reštrikční mfsto fragment[kbp] Alul Arthrobacter luteus AGJ.CT TCtGA 0.3 BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GJ.GATC C C CTAGTG 7.0 EcoRI Escherischia coli R GJ.AATT C C TTAAtG 3.1 Haelll Haemophilus aegyptus GG|CC CCtGG 0.6 Notl Norcadia otitidis-caviarum GC|GGCC GC CG CCGGtCG <9700 Pstl Providencia stuartii C TGCA|G GtACGT C 7.0 Taql Thermus aquaticus TiCG A A GCtT 1.4 Hindlll Haemophilus influenzae Rd A|AGCT T T TCGA|A 3.1 aculty-logc Rekombinace a kIonovaní Rekombinace DNA a klonovänf jaculty-logd Inserting a DNR Sample into a Plasmid Identifikace DNA na agarózovém gelu V laboratoři jaculty-logd http://www.sme.sk/c/3753490/Genetika-nadei-pre-pacientov.html s " PCR (polymerázová řetězová reakce) PCR (polymerázová řetězová reakce) PCR (polymerazova řetézova reakce) □ aculty-logc PCR (polymerázová řetězová reakce) Sekvence DNA ► Pořadí nukleotidů ve směru 5' —> 3' uloženo pro budoucí generace jako dlouhý řetězec symbolů A, C, G a T ► Dobrá zpráva pro budoucnost bioinformatiků: zatím je osekvenováno jenom asi 1000 organizmů, data budou přibývat + Polymorfizmus: Rozdíl mezi jedinci Horno sapiens sapiens 1/1000 bazí + Personál Genomics Project (PGP) aculty-logc □ g - » -51"=! O^O Sekvence DNA ► Sekvenace se dělá ve dvou fázích + Za použití DNA polymerázy a směsi normálních a modifikovaných deoxyribonukleotidů se syntetizují vlákna DNA (imitace replikace), templátem je sekvenovaná molekula DNA Produkty polymerizace se v automatických strojích chromatograficky dělí podle velikosti a vypovídají o sekvenci ► Jedna reakce podá informaci o 500-1000 bazích aculty-logc □ gi - ■* -li* ^Q^O Dideoxynukleotid neumoznuje navazaní dlaSích nukleotidu Ditleoxythymictine triphosphate (dďTTP) aculty-logc □ g - » -íl-* -0<^O Polymeraza se zastavi pri pouZiti ddNTP Dm* sea ivaii th» t-wnpi jto sG*i<) and synthmiiw j nw s»:sixd slrmdlo mjf <: n s1 - TflrecGf.nmreiiTiiTiiirfcosPttiTiTn&CTflrer.fl J' - (ireirGcenrTistciiTiiniiniiCTrifciiBiiirisiiTfiriETfi ■niBrrfffiti: W Sfe<* t*w t nuclwtidoe aro actually sSdegi £ T, I hmwch strand willtwrnlrsJlc 5' - rni'GCGGiARCGuiftieiicfiHUCGnrHucimreMi- 5' - TfUJSCGOTBflCSrrlRTftTTMRCCGniflfiCT* 5' - TRrGfGGinnc ggin ii; r TircnccciTn r. S' - THCDCDOTdnCGCTItlGI TMBCCGT it S' - t GCGCGG I ARC GG i ti iG E1 CGAC CGI* 5' - TfiCGCGGIARCGGTBIGIT- 5' - rnrrinrr.j;inni:r,i:iiiri;r. 5' - TnL'GtGGIirnCGGIRT' S' - TGtGtGGIBfltGGf" 5' - TFICGCGGT- faculty-logo Výsledek automatického sekvenování VysIedek automatickeho sekvenovaní aculty-logc Sekvenace hybridizací je zalozzena na vazaní se DNA na desticku s nůznymi oligonukleotidy Přechod DNA porem v membráně nitridu silikonu generuje elektricky signál, ktery by mohl umoZnit sekvenování faculty-logO Historie sekvenace genomu 1975 bakteriofag MS2 1977 bakteriofag PhiX174 5,375 bp 1982 bakteriofag Lambda 1984 HIV-1 1990 virus HCMV 230 Kbp 1995 H. influenzae 1,83 Mbp 1996 E. coli 4,60 Mbp 1996 S. cerevisiae 12,00 Mbp 1998 C. elegans 96 Mbp 2000 D. melanogaster 120 Mbp 2000 A. thaliana 130 Mbp 2001 H. sapiens 3 000 Mbp 2001 M. musculus 3 000 Mbp faculty-logo □ gi - ■* -lit -oo^ty Microarray Microarray □ Si - ■* -II"* -oo^ty Techniky manipulující proteiny izolace z buněk ► elektroforéza (dělení podle velikosti) ► zjištování aktivity ► štěpení peptidázami ► určování sekvence ► generování protilátek pro daný protein ► ELISA a podobné testy ► produkce rekombinantních proteinů (např lacZ, GFP) ► krystalizace a určování struktury ► hmotnostní spektrometrie SDS-PAGE (eiektroforeza v poiyakryiamidovem geiu) Pole na bázi proteinů jaculty-logd □ gi - ■* -li-* -oo^ty Biosenzory v proteinových čipech aculty-logc ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Slovní pojmů molekulární biologie central dogma gene RNA genome ORF transcription DNA gene structure mRNA nucleotide promoter gene expression 375' intron micro array hybridization exon probe replication prokaryote EST DNA polymerase ATG translation vector GC content codon plasmid eukaryote protein sequence alignment TATA PCR enhancer mass spectrometry DNA sequence silencer signal transduction proteome antibody western blot restriction enzyme endonuclease phylogenetics aculty-logc □ gi - ■* -lit 'O^O Příště Analýza šěkvěncí faculty-logo □ gi - ■* -li* -oo^ty Outline Dodatek faculty-logo □ gi - ■* -II"* -oo^ty For Further Reading x faculty-logO □ gi - ■* -lit -oo^ty