Proteiny a jejich struktura 2/12 Přednáška č. 2 Biochemie pro informatiky Aminokyseliny • Základní stavební jednotky proteinů • Přenos nervového signálu, biosyntéza molekul • 21+2 základních aminokyselin • bakterie f-Met • prokaryota Pyl • 8 esenciálních AMK • nelze je syntetizovat v lidském organizmu de novo • Val, Leu, Ile, Lys, Met, Phe, Trp, Thr • Podmíněné esenciální AMK: Arg, His (rychlost spotřeby převyšuje rychlost syntézy) Selenocystein (SeC, U) Pyrolysin (Pyl, O) N-formylmethionin (f-Met, U) Chemická struktura AMK • Aminoskupina: • N-konec kyseliny • N s volným e- párem (tvorba H-můstku) • Rozpustná ve vodě • Bazické vlastnosti (vazba p+ NH3 +) • Karboxyskupina: • C-konec kyseliny • C=O ketoskupina, C-OH hydroxyskupina • Donor p+, e- je stabilizován delokalizací náboje Aminoskupina Karboxyskupina Postranní funkční řetězec na alfa uhlíku Vodík α Rozdělení aminokyselin dle fyzikálněchemických vlastností: • Alifatické: Ala, Gly, Ile, Leu, Val • Aromatické: Phe, Trp, Tyr, Pro • Kyselé: Asp, Glu • Zásadité: Arg, His, Lys • S hydroxylovou skupinou: Ser, Thr • Amidické: Asn, Gln • Obsahující síru: Cys, Met • Se selenem: SeC Postranní funkční skupina určuje vlastnosti AMK v proteinu! Rozdělení aminokyselin dle zapojení do metabolismu: • Glukoplastické: možnost syntetizovat glukózu, zapojení do metabolismu sacharidů (Ala, Gly, Ser, Asp …) • Ketoplastické: vnik keto-látek, zapojení do metabolismu lipidů (Leu, Lys, …) • Některé AMK mohou vystupovat jako obojí (Tyr, Trp, Phe, …) Stereoizomerie AMK • L a D enantiomery • Centrum chirality – Cα • Dvě zrcadlově symetrické konformace • Opticky aktivní látky • Stáčení roviny polarizovaného světla • AMK v proteinech v L-formě • D-forma (rezistence vůči proteázám) • při posttranslačních úpravách za pomocí enzymů v ER (přechodná forma) • Peptidoglykanové stěny bakterií • Antibiotika Glycin má rovinu symetrie a není tudíž opticky aktivní (jako jediná biogenní AMK). AMK jako amfolyt • Amfolyt: • látka nesoucí kyselou i zásaditou funkční skupinu (H2N-AMK-COOH) • Při určitém pH (izoelektrický bod) – obě funkční skupiny disociovány -> elektricky neutrální molekula (zwitteriont,amfiont) • AMK: • -NH2 – slabá zásada při pH pod 2,2 • -COOH – slabá kyselinou při pH nad 9.4 • Typ postranního řetězce – ovlivnění pI (bez náboje, bez pohybu v elektrickém poli – identifikace AMK) • Mezi těmito hodnotami může docházet k výskytu obou forem Každá AMK má jiný izoelektrický bod! kationt zwitteriont aniont pI (izoelektrický bod) pI = 𝑝𝐾1 +𝑝𝐾2 2 Přehled AMK: • Glycin: • Nejmenší AMK, bez chirálního C • Hydrofilní i hydrofobní • Alanin: • D-forma – bakteriální stěna, mořští živočichové (korýši, mlži,…) osmolyt • Meziprodukt metabolických drah • Valin: • Esenciální AMK • Hydrofobní interakce v proteinech • Leucin: • Esenciální AMK • Nepolární, hydrofobní, tvorba leucinového zipu • Stimuluje nárůst proteinů ve svalech • Isoleucin: • Esenciální AMK • Nepolární, hydrofobní • Avokádo, papaja, olivy, jedlé kaštany, kokosy • Fenylalanin: • Esenciální AMK • Hydrofobní, aromatický kruh jako chromofor (absorpce UV záření) • Tvorba neurotransmiterů • Tyrosin: • Esenciální AMK • Přenos signálu mezi proteiny v buňce (de/fosforylace -> změna konformace -> de/aktivace funkce) • Deriváty Tyr: katecholaminy, hormony štítné žlázy, melanin,… • Tryptofan: • Esenciální AMK s indolem • Deriváty Trp: serotonin, melatonin, nikotinamid • Threonin: • Esenciální AMK se 2 chirálními uhlíky • Serin: • Polární, hydrofilní • Signalizace mezi buňkama • V aktivních centrech proteáz • Cystein: • Nukleofilní SH skupina • Vznik disulfidických můstků oxidací • Antioxidant, v enzymech na sebe váže kovy • Methionin: • Esenciální AMK, nepolární, hydrofobní • Start kodon při syntéze proteinu -> Met 1.AMK v proteinech • Prolin: • Specifická AMK – sekundární amin • Polární, hydrofilní • Tvorba rigidní struktury a změna směru proteinového řetězce (β-otáčka proteinu) • hydroxylací vzniká hydroxyprolin - v kolagenu • Histidin: • Esenciální AMK • Součást aktivních center enzymů – vazba kovů • Prostředník přenosu náboje (hydzolázy, transferázy) • Lysin: • Esenciální, bazická AMK • Posttranslační modifikace - methylace, acetylace, fosforylace,… • Asparagová kyselina: • Slabá kyselina • V katalytických místech proteáz - vazba kovů (Zn) • Asparagin: • Polární, hydrofilní AMK • Vytváří H-můstek mezi postranní skupinou a kostrou proteinu, • Výskyt v aktivních místech proteinů. • Glutamová kyselina (glutamát): • Slabá kyselina • Přenos NH2 skupiny v proteinech - vznik glutaminu • Glutamin: • Polární, hydrofilní AMK • Regenerace svalových vláken, podpora tvorby glukózy • Arginin: • Polární, bazická AMK • Účast při tvorbě H-můstků • Vaznost negativně nabitých molekul • Selenocystein: • Základní stavební prvek selenoproteinů • Silnější redukční aktivita než u cysteinu Vznik proteinu • Peptidická vazba R-CO-NH-R: • Vazba mezi karboxyskupinou jedné AMK a aminoskupinou druhé AMK • Odloučení molekuly vody – dehydratace • Endergonická reakce – nutnost dodání energie z ATP • AMK -> peptid -> protein (bílkovina) • Oligopeptid - do 10 AMK • Polypeptid – polymerní struktura do 100 AMK • Protein – dlouhý řetězec AMK, vysoká molekulová hmotnost Struktura proteinu • Řada za sebou peptidickou vazbou spojených AMK – kostra • Vyčnívající zbytky postranních řetězců – charakter proteinu • Koncové části: • N-konec – zakončen aminoskupinou • C-konec – zakončen karboxylovou skupinou • Díky rozdílné struktuře – mnoho specifických funkcí • Strukturní a podpůrná funkce • Enzymatická katalýza, hormony, energetická regulace, transport látek, pohyb, přenos informací, imunita Úrovně strukturního složení: 1. Primární struktura 2. Sekundární struktura 3. Terciární struktura 4. Kvartérní struktura Primární struktura • Řazení jednotlivých AMK v polypeptidovém řetězci (od N k C-konci) • Poloha bisulfidických můstku S-S Inzulín Bisulfidická vazba R-S-S-R • Vazba mezi specifickými cysteiny • Slabší vazba než C-C nebo C-H • Lehce štípatelná nukleofilními činidly (látky, které do reakce poskytují elektronový pár a dochází k redukci na R-SH) • Stabilizace jednotlivých segmentů polypeptidu -> tvorba hydrofobní kapsy uvnitř zabaleného proteinu Posttranslační modifikace Úpravy proteinů, které nastávají po jejich syntéze v ribozomech. • Acetylace – výměna H (v NH2) za acetyl (CH3CO), odstranění pozitivního náboje AMK • Myristylace – připojení myristoylu (C14) ke koncovému Gly, zvyšuje hydrofobicitu proteinu • Fosforylace – pomocí enzymů kináz je připojován fosfát (PO4 3-) k Ser, Thr, Tyr - přidává proteinu negativní náboj, slouží k aktivaci proteinu • Glykosylace - vazba cukru s vysokým obsahem -OH skupin, zvyšuje polaritu a rozpustnost proteinu • Hydroxylace – vazba hydroxyprolinu k Lys, Pro způsobuje trojšroubovitou konformaci kolagenu • Methylace - rozpoznávací znak pro vazbu dalších proteinů, zesílení iontových interakcí • Ubikvitinace – malý peptid ubikvitin značí proteiny, které budou rozštěpeny v proteazomu • Sumoylace – peptid sumo1 značí proteiny, které jsou transportovány z cytoplazmy do jádra Každý děj může probíhat i reverzně -> defosforylace (pomocí fosfatáz deaktivuje funkce proteinu). ubikvitin fosfátový zbytek acetyl myristoyl Sekundární struktura • 3D struktura lokálních segmentů proteinu • Stabilizovace H-můstky mezi C=O a -NH- v peptidické vazbě • Konformace: • α-helix (Met, Ala, Leu, Glu, Lys) • β-skládaný list (Trp, Tyr, Phe, Leu, Val, Thr) • Uspořádání AMK navozuje konformaci • Gly - velkou volnost (H- stéricky nezavází) • Pro – fixace struktury, ohyb šroubovice α-helix (α-šroubovice) • Pravotočivá šroubovice • 3,6 AMK na 1 závit (α) • 5 AMK na 1 závit (π) – není stabilní • Vertikální stabilizace H-můstky • Donory vždy jedním směrem, akceptory druhým = silný elektrický dipól • Tvorba H-můstků = snížení polarity proteinu β-skládaný list • Pravidelné uspořádání do struktury skládaného papíru (3-10 AMK na list) • Extendovaný typ – ne příliš kompaktní, spíš roztažený do stran • Rovnoběžné uspořádání AMK • Paralelní – sousední řetězce směřují stejným směrem • Antiparalelní – sousední řetězce směřují opačným směrem • Spojení β-otáčkou • Fibroin (základní složka hedvábí) výhradně z β-skládaný list fibroin Méně běžné sekundární struktury • Prolin-rich helix (Pro, hydroxyPro) • Tvorba trojšroubovic (až 290nm) • Stabilita kolagenu • Ohebnost, pružnost, pevnost v tahu • β-helix • Skládaný list v helikálním uspořádání (solenoidová doména) • Otáčka bohatá na Gly • H-můstky, interakcemi mezi proteiny nebo atomy kovů Terciární struktura • 3D struktura celého proteinu v prostoru • Popisuje vzájemné orientace a interakce jednotlivých segmentů • Stabilizace domén (segmentů) pomocí zbytků AMK • Hydrofobní – sbalení do vnitřních struktur proteinu (nevystavovat se vodě) • Hydrofilní – vystavení na povrch proteinu • Další intramolekulární interakce • Bisulfidické můstky • Van der Waalsovy síly • Iontové interakce • Dělení proteinů: • Fibrilární (vláknitá): kolageny, myosin, aktin, … • Globulární (klubková): albumin, globuliny, fibrinogen, … Chaperon (gardedáma) • Speciální protein napomáhající skládání proteinu do správného prostorového uspořádání • Umožnění proteinům vykonávat funkci v buňce • Hydrofobní AMK vazba na chaperon -> navození změny konformace (Hfobní k sobě) pomocí ATP a na povrch Hfilní -> změna konformace chaperonu a uvolnění Cap -> vypuštění správně seskládaného proteinu Chaperony jsou: • ATPázy podobné enzymům (ale nejsou specifické svým ligandům) • Stress proteins nebo heat shock proteins • Syntetizovány při buněčném stresu (změny teploty, vliv detergentů, změny pH, účinek toxických látek) Zástupci: • Hsp70 – export proteinů z buněk, konformace replikačních komplexů, odbourávání poškozených proteinů • Hsp60 „chaperoniny“ – stabilizují proteiny určené k exportu do mezibuněčného prostoru • Hsp90 – inhibice aktivity tirozinkinázy Kvartérní struktura • Uspořádání podjednotek v aglomerátech tvořících 1 funkční protein • Extramolekulární vazebné interakce • Nekovalentní vazby (H-můstky, hydrofobní efekt) • Kvartérní strukturu nemají všechny proteiny • Myoglobin jen terciární • Hemoglobin kvartérní Myoglobin Hemoglobin Hemoproteiny Hemoglobin (krevní barvivo) • Tetramerní metaloprotein (součást erytrocytů) • Sférický tvar • 4 podjednotky – 2α a 2ß • každá složena z • bílkovinná část globin – 4 polypeptidy (různá afinika k O2) • prostetická skupina hem – tetrapyrolové jádro s atomem Fe2+ • Přenos krevních plynů (zejména O2) Proč je hemoglobin důležitý? Váže na sebe kyslík! Jak to celé funguje? • Buňky potřebují O2 k výrobě energie (spotřeba za vzniku CO2) • Při nedostatku O2 dochází k zadušení (nelze udržet homeostázu buněk) • Pasivní difúze O2 -> pomalá a neefektivní (nutnost transportu O2 na velké vzdálenosti a uvolnění dle potřeby tkáně) • Hemoglobin jako přenašeč O2: syntéza při vývoji červených krvinek • Koncentrace O2 v krvi není stejná • V plicích je parciální tlak O2 nejvyšší (vazba O2 na hemoglobin) • Ve tkáních je pO2 nižší (vyvázání O2 z hemoglobinu) Hem • Koordinační vazba Fe2+ (ve valenční vrstvě chybí 2e-) • Vazba mezi centrálním iontem (koordinační centrum) a ligandy • Sdílení celého vazebného páru (2e- se stejnou energií) ve vnější valenční vrstvě • Vazba: 1. Tetrapyrolové jádro přes dusík 2. Globin přes histidiny • Vzdálený (distální) přes H-můstek k O • Blízký (proximální) přes dusík k Fe • Vysunutí atomu Fe z roviny hemu • Navázání O2: • Oxidace Fe2+ na Fe3+ (Fe poskytne další e-) • Posun atomu Fe do roviny hemu • Stabilizace přes H-můstky k distálnímu histidinu (změna ve struktuře globinu) Regulace hemoglobinu • Globinová podjednotka bez O2: deoxygenovaná T-forma (tense) • Nízká afinita k O2 (zabalený protein neumožňuje snadné pronikání O2 k hemu) • Plíce: • Hb se 4 podjednotkama v T-stavu • Vysoký pO2 -> zvyšení šance vazby O2 na T-formu s menší afinitou • Po navázání prvního O2 -> řetězová reakce (zvýšení afinity k O2) -> přeměna Tformy na oxygenovanou R-formu (relaxed) -> efektivní a rychlé nasycení Hb O2 Faktory mající vliv na stav Hb je pO2 a pCO2, pH, teplota a molekula 2,3-bisfosfoglycerátu. • Závislost afinity Hb k O2 vůči pO2 v okolí • Sigmoidní křivka je dílem kooperativní regulace podjednotek hemoglobinu • U hemoglobinu jde z křivky vyčíst, že v plicích dochází 97% nasycení Bohrův efekt • Závislost saturace Hb na změnách cO2, pH a T • Mechanismus zajišťující tkáním s vysokou aktivitou přednostní dodávku O2 (a odstranění H+) • Buňky v procesu dýchání vytvářejí CO2 (čím víc jsou energeticky aktivní, tím více CO2 vyprodukují) • CO2 reaguje s vodou za vzniku H2CO3 (pomalý proces) • CO2 difundující do erytrocytů je katalyzován enzymem karboanhydráza za vzniku H2CO3 -> disociace ve vodě za uvolnění H+ • uvolnění O2 z komplexu, redukce Fe, protonace histidinu ->stabilizace T-stavu Hb Při nízkém pH se křivka posouvá doprava a dochází k uvolnění většího množství kyslíku. Jak je transportován CO2 ven z těla? • V plicích díky velké koncentraci O2 dochází k opětovnému navázání na Hb • To vede k uvolnění p+ z histidinů • p+ reagují s hydrogenuhličitanovým aniontem za vzniku CO2 a H2O • CO2 se poté dostává do plic • 5-10% CO2 se váže na místo kyslíku v hemu • Vzniká karbaminohemoglobin, který stabilizuje T-stav • Snížením pH v plicích dochází k jeho uvolnění Oxyhemoglobin Carbaminohemoglobin Carboxyhemoglobin R - globin • Další důležitou molekulou je 2,3-bisfosfoglycerát (vznik při glykolýze) • Molekula se váže do centrální štěrbiny mezi 4 podjednotky (prostorově se vejde pouze u deoxygenovaného Hb v T-stavu) • Po vazbě změní konformaci dalších podjednotek, což vede k uvolnění O2 • 2,3-BPG stabilizuje T-stav Hb • Nízká hladina O2 vede ke zvýšené produkci 2,3- BPG • Vazba O2 na hem vede k vyvázání 2,3-BPG Hb Fetální hemoglobin (HbF) • Nutnost velkého množství O2, ale není přímý zdroj pro plod • O2 do krevního řečiště plodu přes placentu – koncentrace O2 nižší než v plicních arteriích • Syntéza globinu δ (ne globin β) • Vznik HbF (2α a 2δ podjednotky) - vyšší afinita k O2 Fetální hemoglobin se v placentě sytí kyslíkem na 60 %, nedosahuje tedy hodnot saturace adultního hemoglobinu v plicích (97 %). Shrnutí 1. AMK – struktura a funkce Aminoskupina Karboxyskupina Postranní funkční řetězec na alfa uhlíku Vodík α 3. Proteiny • Peptidová vazba • Struktura • Funkce 2. Zástupci AMK 4. Hemoglobin Pojmy: • Esenciální a neesenciální AMK • Glukoplastické a ketoplastické AMK • Enantiomery (centrum chirality) • Amfolyt a izoelektrický bod • Peptidická vazba • Rozdíl mezi peptidem a proteinem • N- a C-konec proteinu • α-helix a β-skládaný list • H-můstky, S-S můstky, van der Waalsovy síly • Globulární a fibrilární proteiny • Hemoglobin