Elektronový transportní řetězec a Oxidativní fosforylace Vnější a vnitřní membrána • Vnější membrána je hranice mezi matrixem a cytosolem • Je poměrně propustná za velké molekuly • Různé metabolické dráhy jsou lokalizovány v mitochondriích VNITŘNÍ VNĚJŠÍ Tloušťka 5 -7 nm 5 -7 nm Tvar zvlněná-složená hladká Povrch VNĚJŠÍ ČÁST: VNITŘNÍ ČÁST : hladká hladká VNITŘNÍ ČÁST: VNĚJŠÍ ČÁST: pravidelné jednotky nepravidelná Extrakce Fosfolipidů: membrána zůstává intaktní porušena VNITŘNÍ VNĚJŠÍ Permeabilita selektivní propustná pro velké molekuly Poměr fospholipidy/ bílkoviny 0,27 0,82 Obsah kardiolipinu vysoký nízký Obsah Pi vysoký nízký Cholesterol nízký vysoký Koenzym Q přítomen není Monoamine oxidase není přítomen Cytochrom oxidase přítomen není Vnitřní mitochondriální membrána je pro většinu hydrofilních látek nepropustná Specifické transporntí systémy: NADH produkovaný glykolýzou musí získat přístup do řetězce transportu elektronů aby mohl být aerobně oxidován VNITŘNÍ membrána : skládá se z mnoha enzymů – 80% sloučenin jsou proteiny Enzymy komplexu dýchacího řetězce Transportér: malate <--------------> citrate malate <--------------> alpha-ketoglutarate pyruvate <--------------> OHOH- <--------------> Pi Pi <--------------> malate ATP <--------------> ADP GLU <--------------> ASP ornithin <--------------> citrulin Člunky: malát – aspartátový (ve svalech) glycerofosfátový (v játrech) Karnitin transportní systém: přenáší mastné kyseliny do mitochondrie, kde probíhá jejich oxidace Respirační řetězec Dýchací (respirační) řetězech je metabolická dráha, ve které dochází k oxidaci molekul za účelem výroby energie. Energie je následně uchována do chemické vazby ATP. Zahrnuje Glykolýzu, Citrátový cyklus, Elektronový transportní řetězec a oxidativní fosforylaci. Oproti fermentaci (kvašení) je respirační řetězec mnohem účinnější. Nevýhodou je ale tvorba vysoce reaktivních kyslíkových radikálů, které mohou interagovat s proteiny nebo DNA a narušovat jejich funkci. U eukaryot je další fáze respiračního řetězce umístěna do velkých enzymatických komplexů umístěných na vnitřní mitochondriální membráně. Ty jsou také známy jako Elektronový transportní řetězec. Během oxidace molekul dochází k uvolnění elektronů. Pomocí komplexů jsou elektrony transportovány do prostoru vnitřní mitochondriální membrány nebo do mezimembránového prostoru. Hromadění elektronů na druhé straně vnitřní membrány vytváří elektrický potenciál. Společně s elektrony jsou na druhou stranu membrány z mitochondriální matrix transportovány protony. Tím dochází ke zvýšení koncentrace H+ a snížení pH v mezimembránovém prostoru. Tento pH gradient je nakonec využit pro syntézu ATP. Elektronový transportní řetězec Enzymy Elektronového transportního řetězce obsahují kofaktory, umožňující přesun elektronů i protonů. Malé proteiny nesoucí hemovou skupinu - Cytochromy, jako např. Cytochrom c jsou schopny přenášet 1 elektron. Elektrony jsou v respiračním řetězci zachytávány atomem železa v molekule podobné hemu. Cytochrom c je navíc důležitý v regulaci buněčné smrti, apoptózy. Molekula je rozpustná v tucích a může existovat ve třech redoxních stavech. Ubichinon (CoQ) může být redukován 1e a 1 H+ na semichinon. Další elektron a proton napadá druhou ketoskupinu a vzniká druhé hydroxylová alkoholová skupina – ubichinol. Vnitřní mitochondriální membrána je tvořena dvěma vrstvami fosfolipidů. Uvnitř membrány zajišťuje vychytávání a transport elektronů a protonů molekula Koenzymu Q10 (Ubichinon, CoQ). Molekula je složena z benzochinonového cyklu na které je napojeno několik isoprenových jednotek (nenasycené alifatické uhlovodíky, dávají molekule hydrofobní charakter). Nejčastější počet jednotek je 10 (proto také CoQ10). Dalšími kofaktory transportu elektronů jsou molekuly složené s železa a síry – železo/sirné klustry. Molekuly jsou kovalentně vázány k proteinu. Fe má v molekule 4 koordinační vazby. Nachází se i v jiných enzymech (např. Akonitáza). 2Fe-2S klustery Fe je navázáno k proteinům přes 4 cysteiny (nebo v tzv. Rieskeho proteinech přes 2 cysteiny a 2 histidiny). Mezi sebou jsou atomy navázány opět přes síru. Atom železa v redukovaném stavu má oxidační číslo Fe2+, po přijetí elektronu přechází na Fe3+. I když kluster obsahuje dva atomy Fe, je oxidován pouze jeden. 2Fe-2S kluster tedy dokáže přenášet pouze 1 elektron. 4Fe-4S kluster Má kubický tvar molekuly. Vazba Fe k proteinům umožněna přes cysteiny. Komplex je schopen transportovat 2 elektrony (opět dva atomy zůstávají na Fe2+ redoxním stavu). 3Fe-4S kluster Oproti ostatním mohou být všechny 3 Fe oxidovány na Fe3+. Katabolické reakce produkují velké množství redukovaných koenzymů – NADH a FADH2. Uvolněním elektronů z molekuly dochází také k uvolnění velkého energetického kvanta. Neřízená oxidace NADH by vedla k tomu, že by uvolněná energie vedla k nekontrolovatelné reakci. Proto elektrony prochází přes další přenašeče a na každém z nich dojde k malé ztrátě energie procházejícího elektronu. Elektronový transportní řetězec se skládá ze 4 komplexů – KI, KII, KIII a K IV. Komplex II – sukcinát dehydrogenáza je kromě toho i součástí citrátového cyklu. Přesun elektronů a protonů mezi jednotlivými komplexy lze vyjádřit takto: Komplex I (NADH: ubichinon oxidoreduktáza). Největší z komplexů. Komplex I je složen ze 44 polypeptidů a 8 Fe-S klusterů. Pouze 7 poplypetidů je kódováno mitochondriálním genomem. Dochází v něm k oxidaci NADH na NAD+ a H+. Elektrony jsou transportovány řetězcem redoxních kofaktorů do vnitřní mitochondriální membrány na CoQ. Elektrony společně s protony z matrix pak slouží k redukci CoQ na CoQH2. Enzymatický proces může být reverzibilní Komplex obsahuje membránovou a mitochondriální hydrofilní doménu. Hydrofilní doména obsahuje všechny redoxní centra a místo pro vazbu NADH. V první fázi se NADH naváže do katalytického místa Komplexu I. Dojde k jeho oxidaci a uvolnění 2 elektronů. Oba se přenesou na první redoxní kofaktor FMN (flavinadenin mononukleotid), molekula podobná FAD). Ten se redukuje na FMNH2. Následně jsou elektrony transportovány přes sérii Fe-S klusterů na CoQ. Redukovaný CoQH2 je poté redukován na Komplexu III. NADH:ubichinon oxidoreduktáza Průtok elektronů komplexem vede ke změnám redoxního stavu aminokyselin a následné změny jeho struktury. Dojde k otevření protonového transportéru a přenesení 4 H+ na vnější stranu vnitřní mitochondriální membrány. Komplex II (sukcinát dehydrogenáza) Enzym citrátového cyklu. Oxidací sukcinátu na fumarát vede k uvolnění elektronů, které jsou pak využity pro redukci CoQ. Skládá se ze 4 podjednotek. Hydrofilní podjednotka obsahuje kofaktory transportu elektronů – FAD a 3 Fe-S proteiny. Hydrofobní podjednotky ukotvuje komplex do vnitřní mitochondriální membrány. Tato podjednotka obsahuje molekulu hemu a vazebné místo pro CoQ. Sukcinát je donorem dvou elektronů. Ty jsou přeneseny přes FADH2 na Fe-S centra (vždy po jednom elektronu). Role hemu v komplexu není známá, myslí se že slouží jako molekula skladující první elektron. Po vazbě CoQ je pak jeden z elektronů předem přichystaný v oxidovaném hemu a druhý jde z Fe-S klusterů. Mechanismu může vést k přímé redukci CoQ na CoQH2 a zabránit příliš dlouhé přítomnosti semichinonu (schopného tvorby kyslíkových radikálů). Komplex II má podobnou funkci jako KI. Ale nefunguje jako protonová pumpa a netransportuje přímo přes membránu další protony. Proto je energetický výtěžek KII mnohem nižší. Redukovaný CoQH2 transportuje elektrony a protony na komplex III (CoQH2: cytochrom c reduktáza). KIII je transmembránový protein kódovaný mitochondriální i jaderným genomem. Komplex katalyzuje přenos elektronů na cytochrom c. Zároveň oxiduje/redukuje molekuly CoQH2/CoQ. Komplex obsahuje 4 kofaktory: cytochrom c1, cytochrom b-L, cytochrom b-H a 2 Rieskeho proteiny (s Fe-S klustery). Komplex má více katalytických míst. CoQH2 vzniklý z KI a KII je transportován do místa Qo v blízkosti Rieskeho proteinů a cytochromu b-L. Dochází k oxidaci CoQH2 na CoQ. Uvolněné protony jsou vypuštěny do mezimembránového prostoru. Oxidací vznikají 2 elektrony – jeden z nich je předán Fe-S klastry na cytochrom c (a redukuje Fe3+ na Fe2+). Po redukci se ve vodě rozpustný cytochrom c odpojí od komplexu do mezimembránového prostoru. Dalším vazebným místem je Qi – zde dochází k vazbě CoQ. Elektron procházející přes cytochromy b-H a b-L je využit pro jeho redukci a tvorbě semichinonového radikálu. Pro plnou redukci je třeba druhé molekuly CoQH2 v Qo místě. Druhý uvolněný elektron plně redukuje semichinon na CoQH2. Protony pro ubichinol jsou získány z mitochondriální matrix. Tak v průběhu 2 otáček KIII dochází ke vzniku 2 redukovaných cytochromu c, dvou molekul CoQ a jedné molekuly CoQH2. Dva protony jsou transportovány dovnitř membrány, další 4 ven do mezimembránového prostoru. Komplex VI (cytochrom c oxidáza) je velký transmembránový proteinový komplex. Z volného cytochromu c z mezimembránového prostoru přijímá elektrony, které slouží k redukci atomárního kyslíku O2 na dvě molekuly H2O. Pro syntézu 2 H2O je třeba 4 elektronů. Navíc komplex slouží jako protonový transportér a v průběhu reakce transportuje 4 protony přes membránu do mezimembránového prostoru. Komplex IV obsahuje 2 hemy – cytochrom a a cytochrom a3. Další kofaktory jsou dvě centra obsahující atomy mědi – CuA a CuB. CuA CuB cytochrom a3 cytochrom a Cytochrom c se přesune do katalytického místa komplexu v blízkosti CuA a odevzdá elektron. Následně je elektron transportován do binukleárního centra (ve které je CuB a cytochrom a3 v těsné blízkosti). V binukleárním centru se Fe v cytochromu redukuje 2 elektrony na Fe2+ (z Fe3+) a na Cu+ (z Cu2+). V procesu je také důležitá AMK tyrosin, která se v blízkosti centra nachází. Do katalytického centra přistoupí molekula kyslíku. Ta se naváže na cytochrom a3 a je redukována díky dvěma elektronům na (Fe4+ ; =O) formu. Druhý atom kyslíku přijímá první elektron z Cu+ (ta se oxiduje na Cu2+) a druhý elektron společně s protonem z tyrosinu. Z tyrosinu se stává tyrosilový radikál. Proton z matrix pak interaguje s hydroxidovým iontem vázaný k Cu za vzniku první molekuly vody. 4 Fe2+-cytochrome c + 8 H+ in + O2 → 4 Fe3+-cytochrome c + 2 H2O + 4 H+ out Třetí cytochrom c přináší elektron nutný pro regeneraci tyrosilového radikálu. Proton k obnovení tyrosinu je opětovně získán z mitochondriální matrix. HO-Y tyrosin Čtvrtý elektron společně s dalším protonem slouží k redukci Fe4+=O na Fe3+-OH. Další proton pak vytváří druhou molekulu vody. Ta se uvolní z komplexu. V dalším cyklu dochází k nové redukci binukleárního centra 2 elektrony a uvolnění dvou molekul vody z komplexu. KI – na 1 molekulu NADH – přečerpání 4H+ a 2H+ sloužící k redukci CoQ na CoQH2 KII – na 1 molekulu sukcinátu - 2H+ sloužící k redukci CoQ na CoQH2 KIII – na 2 molekuly CoQH2 - přečerpání 4H+ a 2H+ sloužící k redukci CoQ na CoQH2 KIV – na 1 molekulu kyslíku - přečerpání 4H+ a 4H+ sloužící k redukci O2 na H2O Enzymy elektronového transportního řetězce přečerpávají protony z matrix do mezimembránového prostoru. Navíc jsou volné protony v matrix utilizovány chemickou vazbou do nových molekul (např. H2O). Velký rozdíl v koncentracích protonů na obou stranách membrány je následně využit v procesu oxidativní fosforylace. Je to proces ve které se vytváří nové molekuly ATP v Komplexu V – ATP syntáze. ATP-syntáza vytváří vazbu mezi ADP a anorganickým fosfátem (Pi) ADP + Pi ATP + H2O Energie potřebná pro reakci je zprostředkována průtokem protonů z mezimembránového prostoru do matrix. Oxidativní fosforylace ATP syntáza se skládá ze 2 velkých oblastí. F1 doména se nachází v matrix mitochondrií. Skládá se z 5 podjednotek – α, β, γ, δ, ε. Podjednotky γ a ε jsou upevněny k C proteinům z protonového kanálu. Katalytickým jádrem je hexamer složený ze 3 α a 3 β podjednotek. Středem hexameru prochází γ protein. Hexamer je ještě ukotven přes dimer B proteinu a δ podjednotkou. Fo doména (Fo- nikoliv F0, je pojmenována podle antibiotika oligomycinu, který doménu inhibuje). Fo se nachází v membráně a skládá se ze 3 hlavních podjednotek (A, B, C) a 6 vedlejších ukotvující doménu do membrány. Celkový komplex se skládá z A, 2B a 10- 14C podjednotek. C podjednotky jsou součástí protonového kanálu. ATP syntázu lze rozdělit na dvě nezávislé mechanické jednotky. Protonový kanál společně s ε a γ jsou rotorem. Stator představuje zbytek komplexu. Samotná syntéza ATP probíhá v F1 části v hexamerní podjednotce (α3β3). Obě podjednotky obsahují vazebné místo pro nukleotidy, které se nachází v prostoru mezi α a β. Ke katalýze dochází pouze v β podjednotkách. V katalytickém místě jsou substráty (ADP, Pi) v chemické rovnováze s produktem (ATP). Vznik ATP tak není energeticky náročný – většina energie vzniklá průtokem protonů je využita pro vazbu substrátů a vypuzení produktu z katalytického místa. Po průchodu protonu Fo podjednotkou dochází k ionizaci a změně proteinové konformace A a C podjednotek. Zkroucení Fo podjednotky je přenášeno na γ podjednotku, která je asymetrická. Rotací γ podjednotky v centrálním kanálu hexameru vede k přenosu konformačních změn na podjednotky α3β3. Jak se jednotka pohybuje ve směru hodinových ručiček, konformace katalytických míst zaujímá tři polohy. https://www.youtube.com/watch?v=PjdPTY1wHdQ V aktivním (open) stavu je katalytické místo připraveno pro přijetí substrátů – ADP a Pi. V další otáčce se konformace β mění a dochází k uzavření katalytického místa. Molekuly ADP a Pi ještě nejsou tlačeny k sobě (loose stav). Další otáčkou dojde k přiblížení substrátu (tight) a vzniku nové vazby. Vzniklé ATP je pak vytlačeno z katalytického místa následnou otáčkou γ podjednotky – a katalytické místo je znovu připraveno pro přijetí dalších subtrátů. Fo motor přeměňuje transmembrány potenciál do rotačního pohybu γ podjednotky. Nicméně enzym může využívat tuto rotaci i k obrácenému ději – hydrolýze ATP. S jediným rozdílem, a to že γ podjednotka rotuje opačným směrem. Pokud je H+ potenciál velký, Fo motor je hlavní hnací jednotkou a otáčí γ podjednotku ve směru hodinových ručiček – a vedoucí k syntéze ATP. Pokud je potenciál malý, přebírá iniciativu F1 podjednotka a využívá hydrolýzy ATP k transportu protonů do mezimembránového prostoru. Pro tvorbu jedné molekuly ATP je třeba jedné celé otáčky – a průchodu 3 – 4 protonů. Efektivita ATP syntázy je téměř 100%. ATP se z matrix mitochondrií dostává do cytosolu pomocí ADP/ATP translokázy (která tvoří až 10% všech proteinů v mitochondriální membráně). ATP molekula nese negativní náboj a proto neprochází přes membránu. Translokáza je antiportér a přenáší ATP ven z mitochondrií výměnou za ADP z cytosolu. Kolik ATP buňka získá z 1 molekuly glukózy? V glykolýze vzniká přímo 2 molekuly ATP a 2 NADH. Oxidace NADH v mitochondriích vytváří protonový gradient umožňující vzniku 3 ATP. V glykolýze je ale NADH v cytosolu a je transportován do mitochondrií buď přes malát-aspartátový člunek nebo další alternativní drahou – Glycerol-fosfátovým člůnkem. Dihydroxyaceton-P je konvertován cytosolickou Glycerol-3P dehydrogenázou 1 na glycerol-3P. V reakci dochází k oxidaci NADH na NAD+. Na vnitřní mitochondriální se nachází Glycerol-3P dehydrogenáza 2, která zpátky konvertuje glycerol-3P na Dihydroxyaceton-P. Protony a elektrony ale nejsou přenášeny na NAD+ kofakor, ale na FAD. FADH2 pak redukuje CoQ – který vstupuje do Elektronového transportního řetězce. Z FADH2 je výtěžkem pouhé 2 molekuly ATP – proto se udává výtěžek 2ATP z cytosolického NADH. Kolik ATP buňka získá z 1 molekuly glukózy? V glykolýze vzniká přímo 2 ATP a 2 NADH (4 ATP). V mitochondrii probíhající: Dekarboxylace pyruvátu (2 pyruváty) – 2 NADH (6 ATP) Dekarboxylace acetyl-Coa (2 acetylové skupiny) – 6 NADH (18 ATP), 2 GTP (2 ATP), 2 FADH2 (4 ATP). Oxidací glukózy lze získat až 36 molekul ATP.