fMRI (funkční magnetická rezonance)

Funkční magnetická rezonance neboli funkční MRI (fMRI) je postup funkčního zobrazování založený na technologii MRI, při kterém se měří mozková aktivita. V nejzákladnějším přístupu vychází z propojení toku krve a nervové aktivace – když se používá nějaká oblast mozku, zvyšuje se také tok krve v ní.

Primární forma fMRI používá tzv. BOLD kontrast (kontrast závislý na okysličené krvi). Postup je v principu podobný vyšetření MRI, používá však rozdíly v magnetických parametrech krve bohaté na kyslík a krve s nízkým obsahem kyslíku. Od 90. let 20. století je to jedna z dominantních metod výzkumu funkcí mozku, jelikož nevyžaduje zásah do integrity pacienta/účastníka výzkumu – nemusí podstoupit operaci, užívat léky, přijít do kontaktu s nebezpečným zářením atd. K dispozici jsou kombinované metody s EEG a NIRS, rozvíjí se biomarkery jiné než BOLD kontrast.

Fyziologický podklad

Mozek používá jako hlavní zdroj energie glukózu, není ji však schopen efektivně uskladnit ve větším množství. Po aktivaci neuronů je však potřebné k dosažení původního polarizovaného stavu nutné přečerpat ionty přes buněčné membrány a k tomuto procesu je nutná glukóza. Tento problém je v přírodě řešen změnou průtoku krve v aktivovaných oblastech, ke které dochází v oblasti 2-3 mm kolem maximální nervové aktivace. Změny koncentrace kyslíku (hemoglobin vs. deoxyhemoglobin) jsou základem magnetických vlastností krve zkoumaných při fMRI (konkrétně rychlejší ztráta magnetizace molekuly deoxyhemoglobinu – T2).

Tato hemodynamická odpověď – změna MR signálu v závislosti od neuronální aktivity – trvá přibližně 10 sekund, s maximem asi po 4 sekundách a následným poklesem. Opoždění za vlastní aktivací nervové tkáně je 1 až 2 sekundy (cévám chvíli trvá, než zareagují na zvýšenou potřebu). Mechanizmus řízení tohoto procesu je značně komplexní, řekněme pouze, že je částečně kontrolován uvolňováním glutamátu v rámci aktivace nervových buněk, na který reagují podpůrné buňky (tzv. astrocyty).

Rozlišení

Prostorové rozlišení se měří ve voxelech – třírozměrných kostkách, kterých velikost závisí od tloušťky řezů MRI (vzdálenosti rovin snímání), plochou řezu a dalších parametrů. Studie celého mozku tudíž používají větší voxely, studie specifických oblastí zájmu typicky menší voxely (nezapomínejme však na velikost oblasti zvýšeného průtoku kolem aktivace na úrovni 2-3 mm, voxely s velikostí pod 1 mm tudíž neposkytnou výrazně vyšší množství validních informací). Malé voxely obsahují méně nervových buněk (pořád ale řádově několik milionů neuronů a desítek miliard spojení mezi neurony) a zahrnují menší průtok. Jejich nasnímání však trvá déle, co může vést k nepohodlí subjektu v zobrazovacím systému, zvýšení šumu i dalším záležitostem.

Časové rozlišení určuje nejkratší perioda nervové aktivity, kterou je fMRI schopno spolehlivě odlišit. Zvýšení časového rozlišení lze dosáhnout opakovaným použitím stimulů a následnou statistickou analýzou. Časové rozlišení samozřejmě závisí i od charakteru snímaného signálu. Zpracování obrazové informace (přenos z fotoreceptorů v oku do příslušných oblastí mozku, včetně asociačních s analýzou tvarů a přiřazením významů viděnému) trvá 100 ms, rychlá „reflexní“ reakce na základě takových informací (kupř. úhybný manévr před nebezpečím) může trvat kolem 200 ms. Vlastní uvědomění události a přesnější analýzou trvá asi 500 ms, vzpomínání na podobné události 2-3 sekundy. Zobrazovací studie trvá několik desítek minut. Získáme tím více informací, ale zvyšujeme také riziko nechtěných pohybů hlavy, ztráty koncentrace, učení (tzn. procesy, které v úvodu řídí určité oblasti mozku, postupně převezmou jiné oblasti nebo jenom část původních oblastí).

V počátcích vývoje této metody výzkumníci srovnávali signál získaný touto technikou se signály z implantovaných elektrod (většinou u opic) a elektrickými či magnetickými signály (EEG a MEG). Signál BOLD však není schopen zcela odlišit zpětnou vazbu a další zpracování („návrat“ signálu zpět do této oblasti po zpracování v jiných oblastech) – limitace vychází z pomalého průběhu vaskulární odpovědi, kdy končený signál představuje souhrnnou verzi sítě celé oblasti. Signál BOLD také neodlišuje inhibiční („deaktivační“) a excitační („aktivační“) signály nervových buněk, rozdíl samozřejmě pro funkci nervových sítí zcela zásadní, jelikož se dokonce tyto dva vlivy můžou funkčně nakonec vynulovat.

Klinické použití

Lékaři hodnotí pomocí fMRI rizikovost operace na mozku. Zjistí, které oblasti mozku jsou důležité pro zásadní funkce jako mluvení či pohyb. Můžou tak lépe naplánovat výkon s ohledem na maximální benefit pro pacienta, aby při operaci nádoru vyřízli pouze minimum funkčně důležité tkáně. fMRI lze také používat ke kontrole hemisferické asymetrie pro jazykové funkce, testovat účinky léků nebo behaviorální terapie, rozvoj nemocí jako kupř. Alzheimerova demence.

Obecně však klinické využití fMRI nedosahuje rozměrů výzkumného použití. Vyšetření pacientů s poškozením mozku je složitější než vyšetření zdravých dobrovolníků. Tumory a jiná poškození můžou měnit tok krve způsobem, který ne zcela odpovídá změnám nervové aktivity, a v takovémto terénu se nelze zcela spoléhat na korelaci změn průtoku s funkční aktivitou vyvozenou ze studií na zdravé tkáni. Také léky můžou ovlivňovat hemodynamickou odpověď.

Komerční použití

Několik společností se snaží zavést fMRI jako detektor lži, vycházející z některých studií, dle nichž je prefrontální kortex aktivnější při lhaní. Cena za vyšetření je kolem 5000 $ a právní použití je přinejmenším kontroverzní. Většina vědců se shoduje, že schopnost fMRI detekovat lež u jednotlivců v reálných podmínkách není zcela jasně prokázaná a výsledky ze skupinových studií nelze s dostatečnou jistotou použít pro konkrétní jednotlivce.

Analýza údajů

Cílem analýzy údajů je najít korelace mezi aktivací mozku a úkolem, který subjekt během snímání provádí. Jelikož je však signál BOLD vcelku slabý a obsahuje mnoho zdrojů šumu, je nutné údaje předem zpracovat v několika krocích. Následující postup v žádném případě není úplný, hodně kroků je výrazně zjednodušeno. Uvádíme jej pouze pro názornost a představu. Ve vlastním výzkumném použití je nutné provést výrazně více nastavení…

K postupu budeme potřebovat program Matlab, který má MUNI pro studenty k dispozici. Naleznete jej na adrese http://www.muni.cz/services/software#Matlab.
Také bude potřebný software pro statistické parametrické mapování SPM - http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/.
Stáhněte si také v této složce na IS MUNI soubor ukázkových údajů jednoho subjektu, který budeme analyzovat. Jsou to data z úkolu na odhad a načasování. Úkol měl hlavní část (označeno jako A na obrázku níže), ve které z levé strany obrazovky vylítl míček s určitou rychlostí a subjekt měl ve správný okamžik stisknout tlačítko, kterým z děla v pravém dolním rohu vypustil náboj. Ten letěl asi 1 sekundu vertikálně nahoru. Cílem bylo sestřelit míček. Kvůli nízké rychlosti náboje to však nebylo zcela jednoduché a proces vyžadoval významné plánování a komplexní odhad pohybových parametrů letícího míčku a čas. Kontrolní úkol (část b obrázku níže) již neobsahoval toto komplexní načasování. Subjekt musel stisknout tlačítko, když se míček nacházel na vyznačeném křížku.

Tyto 2 úkoly jsme vytvořili k tomu, abychom viděli, které části mozku jsou potřebné přímo na odhad času. V úkolu A i B se aktivují oblasti mozku potřebné pro sledování míčku očima, stisknutí tlačítka prstem, ale pouze úkol A obsahuje složité načasování. Když tedy odečteme aktivitu v mozku při úkolu B od úkolu A (A – B), dostaneme pouze oblasti důležité pro načasování.

A nyní již vlastní analýza

- Spusťte Matlab.

- V příkazovém řádku zadejte „spm fmri“ (musíte mít nainstalovaný program SPM dle pokynů na výše uvedené stránce, včetně nastavení v Matlabu).

- Otevře se několik oken – zvolte položku Realign a následně Realign:Estimate & Reslice. Proces slouží k zarovnání snímků a korekci nechtěných pohybů subjektu.

o Klikněte na položku „Data“ a zvolte možnost „new session“.

o Klikněte na položku „Session“ a tlačítko „Select Files“. Zvolte všech 200 snímků (název souborů 20131115_084329ep2dboldINTERCEP2s002a001_ číslo), které obsahuje složka SUBJECT ve složce, jež jste si stáhli z IS MUNI (klikněte pravým tlačítkem myši na pravou polovinu okna se seznamem souborů, v otevřené nabídce pak zvolte „Select All“).

o Z dalších nastavení změňte pouze v položce Reslice Options nastavení Resliced images, zvolte hodnotu „Mean Image only“. Postup je rychlejší než ukládání jednotlivých snímků, jelikož zapisuje posuny a rotace do textového souboru.

o Klikněte na zelené tlačítko Go (trojúhelník vpravo nahoře) a počkejte, než proces skončí.

- V dalším kroku můžeme provést korekci načasování, pro zjednodušení ale přeskočíme a přejdeme k normalizaci. Cílem procesu je upravit tvar mozku subjektu do tvaru odpovídajícího „normální“ šabloně. Každý z nás máme hlavu trochu jinou a potřebujeme si být jisti, že při srovnávání výsledků bude v určité oblasti u všech subjektů skutečně ležet zraková kůra, mozkový kmen apod.

- V hlavním okně zvolte položku Normalise / Normalise – Estimate & Write.

o Dvakrát klikněte na Data a nastavte následující položky:

§ Dvakrát klikněte na "Source Image" – zvolte soubor "mean20131115_084329ep2dboldINTERCEP2s002a001_001.nii“ vytvořený v předchozím kroku

§ "Images to write" -->"select files". Nastavte filtr na "^2013*.*" a zvolte všechny původní soubory.

o Níže zvolte "Template Image" -->"Select Files" – a vyberte soubor "EPI.nii"

o Opět klikněte na zelené tlačítko Go a chvíli počkejte.

- Dalším krokem bude vyhlazení snímků – možnost Smooth v hlavním okně SPM8 Menu

o Zvolte položku "Images to smooth" a nastavte filtr "^w*.*" (předponou „w“ jsou označené normalizované soubory z předchozího kroku. Zvolte všechny soubory s touto předponou.

o Ostatní nastavení neměňte, postačí nám standardní výchozí hodnoty.

o Stiskněte zelené tlačítko Go a počkejte.

- Nyní můžeme začít se statistickým srovnáním. V hlavním okně zvolte položku „Specify 1st-level“

o Dvakrát klikněte na "Directory", zvolte „SPM“ v pravém sloupci a tlačítko „Done“.

o Nyní nastavíme parametry vlastního úkolu

§ „Units for design“: „Seconds“

§ Interscan Interval: 2.46 (použijte tečku, ne čárku)

§ V nastavení Data & Design

§ "New Subject/Session"

§ V části Session zvolte možnost „Scans“, stiskněte „Select Files“. Jako filtr zvolte "^sw*.*" („sw“ označuje soubory, které přešly předchozím krokem normalizace).

§ Nyní je nutné nastavit intervaly, které nás zajímají. Software bude potřebovat určit začátky a trvání těchto intervalů. Pro zjednodušení obsahuje soubor, který máte k dispozici na ISu také soubor „setting.mat“. Klikněte na položku „Multiple Conditions“ a zvolte právě tento soubor.

§ Ostatní nastavení nás opět pro zjednodušení nezajímají, stiskneme zelené tlačítko Go a počkáme

§ SPM vytvoří grafický model (levý sloupec odpovídá hlavnímu úkolu, pravý kontrolnímu úkolu).

§ Nyní už jenom jednoduchá softwarová analýza modelu – v hlavním okně SPM stiskněte položku Estimate, zvolte soubor „SPM.mat“, který jsme vytvořili v předchozím kroku a stiskněte zelené tlačítko Go.

§ A můžeme se podívat na výsledky. Stiskněte tlačítko „Results“.

§ Opět zvolte soubor „SPM.mat“ a stiskněte tlačítko „Done“.

§ Otevře se okno správce kontrastů. Vytvoříme 4 kontrasty.

1. Stiskněte „Define new contrast“

§ Nastavte položku Name na „Hlavni uloha“ – bude obsahovat oblasti aktivované při hlavní úloze

§ Jako typ zvolte „t-contrast“

§ Jako hodnotu do většího okna zadejte 1 0

§ Stiskněte OK

2. Stiskněte „Define new contrast“

§ Nastavte položku Name na „Kontrolni uloha“ – bude obsahovat oblasti aktivované při kontrolní úloze

§ Jako typ zvolte „t-contrast“

§ Jako hodnotu do většího okna zadejte 0 1

§ Stiskněte OK

3. Stiskněte „Define new contrast“

§ Nastavte položku Name na „Hlavni > Kontrolni“ – bude obsahovat oblasti aktivované při hlavní úloze více než při kontrolní

§ Jako typ zvolte „t-contrast“

§ Jako hodnotu do většího okna zadejte 1 -1

§ Stiskněte OK

4. Stiskněte „Define new contrast“

§ Nastavte položku Name na „Kontrolni > Hlavni“ – bude obsahovat oblasti aktivované při kontrolní úloze více než při hlavní

§ Jako typ zvolte „t-contrast“

§ Jako hodnotu do většího okna zadejte -1 1

§ Stiskněte OK

§ Správce kontrastů nyní obsahuje výše uvedené kontrasty. Zvolte první z nich (hlavni uloha) a stiskněte tlačítko „Done“.

§ Jako masku nastavte „none“.

§ Zobrazí se název kontrastu, stiskněte jednoduše enter.

§ Vzhledem k malému množství údajů nebudeme provádět korekci na vícečetné srovnání, v běžném výzkumu je to však zásadní, abychom snížili pravděpodobnost falešně pozitivních výsledků. Zadejte teď také „none“

§ Jako hladinu významnosti hodnotu 0.01.

§ Velikost shluku voxelů (cluster) nastavte na 30 a stiskněte enter.

§ Zobrazí se tzv. glass brain s výsledky.

§ V okně, kde jste dělali tato nastavení, ještě zvolte položku „Display“, rozbalovací nabídku „overlays“ --> „sections“ soubor single_subj_T1.nii, který byl k dispozici v hlavní složce DATA stažené z IS MUNI.

§

§ Ve spodní části okna napravo se zobrazí anatomické řezy mozku s překrytím funkčních výsledků. Posunem modrých křížů na těchto obrázcích si můžete prohlédnout jednotlivé oblasti.

§ Podívejte se pak i na další kontrasty – v malém okně nalevo, kde jste dělali nastavení hladiny významnosti, masky atd. (výše) zvolte položku „Contrasts“ a podívejte se na aktivace pouze při kontrolní úloze i rozdíly.

Při výzkumu se samozřejmě srovnávají výsledky od více účastníků ve výrazně složitějším procesu s výrazně větším objemem dat a při náročnějších statistických hladinách významnosti.