Izolace, purifikace a identifikace sulfát redukujících bakterií Úvod: Obsah sulfátů jsme stanovovali metodou turbidimetrickou, při které se ionty síranu usazují s chloridem barnatým za vzniku síranu barnatého, při čemž vzniká bílá barva. Jako stabilizátor se používá glycerol. Postup: Příprava precipitačního roztoku - Do odměrné baňky o objemu 500 ml jsme navážili 20 g chloridu barnatého - Přidali jsme 300 ml destilované vody a 60 ml kyseliny chlorovodíkové v koncentraci 1 mol/l - Po rozpuštění chloridu barnatého jsme objem roztoku upravili po značku menisku a promíchali - Výsledný roztok jsme smíchali s glycerolem v poměru 1:1 Příprava kalibračních roztoků síranu sodného - Do odměrné baňky o objemu 1000 ml jsme navážili 14,2 g bezvodého síranu sodného a rozpustili v destilované vodě. Objem jsme následně doplnili po meniskus - Poté jsme do 100 ml odměrné baňky napipetovali 8 různých objemů tohoto roztoku (1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10 a 12 ml) a doplnili destilovanou vodou po rysku - Po smíchání s precipitačním roztokem jsme změřili absorbanci při vlnové délce 520 nm - Podle rovnice vycházející z kalibrační křivky jsme spočítali koncentraci sulfátů Stanovení koncentrace sirovodíku - Do 5 ml vodného roztoku octanu zinečnatého jsme napipetovali 0,5 ml vzorku - Následně jsme přidali 1 ml p-aminodimethylanilinu a nechali jsme směs stát 5 minut při pokojové teplotě - Poté jsme přidali 0,25 ml roztoku chloridu železitého a opět nechali 5 minut připokojové teplotě - Směs jsme centrifugovali 5000 g při 23 °C - Při vlnové délce 665 nm jsme stanovili absorbanci centrifugovaného supernatantu pro měření sulfidových iontů - Kalibrační roztoky jsme připravili v naředěním destlilovanou vodou do koncentrací 6,25; 12,5; 25; 50 a 100 μM sulfidu sodného Výpočty: Tabulka 1: Závislost absorbance na koncentraci síranu sodného koncentrace síranu sodného [mmol/l] E[520] naše E[520] (skup. 2) E[520] průměr SE 2 0,079 0,065 0,072 0,010 4 0,159 0,076 0,1175 0,059 8 0,21 0,088 0,149 0,086 16 0,223 0,189 0,206 0,024 24 0,276 0,228 0,252 0,034 32 0,329 0,356 0,3425 0,019 40 0,386 0,421 0,4035 0,025 48 0,432 0,488 0,46 0,040 Zákal (%) Vs (mg) V (mg) 90 13853,3 13841,3 80 14393,2 14381,3 70 13103,7 13092,0 Bacillus subtilis Zákal (%) Hmotnost bakteriální sušiny (mg/ml) 1. skupina Hmotnost bakteriální sušiny (mg/ml) 2. skupina Hmotnost bakteriální sušiny (mg/ml) průměr 90 0,55 0,65 0,60 80 0,50 2,50 1,50 70 0,40 13,6 7,00 Graf 1: Závislost absorbance na koncentraci síranu sodného Na základě rovnice vycházející ze spojnice trendu kalibrační závislosti byla stanovena praktická koncentrace SO[4]^2- v modifikovaném médiu před založením kultivace. E[520] média s SO[4]^2- přepočítaná koncentrace [mmol/l] 0,958 109,247 Teoretická koncentrace SO[4]^2- v modifikovaném médiu před založením kultivace: sloučenina navážka [g] v roztoku [l] % molární zastoupení SO[4]^2- hmotnost SO[4]^2- [g] Na[2]SO[4] 3,0 1 68 2,029 (NH[4])[2]SO[4] 0,2 73 0,145 MgSO[4] . 7H[2]O 0,1 39 0,039 Teoretická koncentrace byla přepočítána a vztažena na SO[4]^2-. Rovná se 23,03 mmol/l. Zkumavka č. Koncentrace albuminu (μg/ml) Absorbance (1. skupina) Absorbance (2. skupina) Absorbance (průměr) 1 0 0,000 0,000 0,000 2 200 0,188 0,151 0,1695 3 400 0,321 0,285 0,303 4 600 0,433 0,450 0,4415 5 800 0,585 0,495 0,540 6 1000 0,687 0,611 0,649 Tabulka 2: Absorbance a koncentrace zredukovaných/nezredukovaných sulfátů v médiu různých vzorků po 7denní kultivaci vzorek E[520] koncentrace nezredukovaného sulfátu [mmol/l] koncentrace zredukovaného sulfátu [mmol/l] TV1 0,552 59,123 50,123 TV2 0,776 86,778 22,469 TC3 0,652 71,469 37,778 644 0,705 78,012 31,235 TC4 0,747 83,198 26,049 S7 0,532 56,654 52,593 TC2 0,635 69,370 39,877 642 0,684 75,420 33,827 Tabulka 3: Závislost absorbance na koncentraci sulfidu sodného Koncentrace sulfidu sodného [mmol/l] OD[665] 6,75 0,04 12,5 0,09 25 0,2 50 0,46 100 0,96 Bacillus subtilis Zákal (%) Absorbance 1. skupina Absorbance 2. skupina Koncentrace bílkovin (μg/ml) 1. skupina Koncentrace bílkovin (μg/ml) 2. skupina Koncentrace bílkovin (μg/ml) průměr 90 0,132 0,083 171,000 89,333 130,167 80 0,106 0,042 127,667 21,000 74,334 70 0,080 0,037 84,333 12,667 48,500 Graf 2: Závislost absorbance na koncentraci sulfidu sodného Tabulka 4: Absorbance a koncentrace H[2]S v médiu různých vzorků po 7 denní kultivaci vzorek E[665] Koncentrace H[2]S [µmol/l] Koncentrace H[2]S [mmol/l] TV1 1,706 175,939 0,175939 TV2 0,42 46,040 0,04604 TC3 1,012 105,838 0,105838 644 0,05 8,667 0,008667 TC4 0,148 18,566 0,018566 S7 1,996 205,232 0,205232 TC2 0,208 24,626 0,024626 642 1,11 115,737 0,115737 Tabulka 5: Procentuální zastoupení zredukovaného/nezredukovaného SO[4]^2- v médiu v různých vzorcích po 7 denní kultivaci TV1 TV2 TC3 644 TC4 S7 TC2 642 nezredukované SO[4]^2- (%) 54,119 79,433 65,42 71,409 76,156 51,859 63,499 69,036 zredukované SO[4]^2- (%) 45,881 20,567 34,58 28,591 23,844 48,141 36,501 30,964 Tabulka 6: Procentuální zastoupení jednotlivých složek v médiu/biomase vzniklých zredukováním SO[4]^2- (sulfit, sírovodík) různých vzorků po 7 dnech kultivace TV1 TV2 TC3 644 TC4 S7 TC2 642 zredukované SO[4]^2- (%) APS a SO[3]^2- 45,72 20,53 34,48 28,58 23,83 47,95 36,48 30,86 H[2]S 0,16 0,04 0,10 0,01 0,02 0,19 0,023 0,11 Graf 3: Procentuální zastoupení jednotlivých složek v médiu/biomase vzniklých zredukováním SO[4]^2- (sulfit, sírovodík) různých vzorků po 7 dnech kultivace Závěr: V tomto cvičení jsme se snažili o izolaci sulfát redukujících bakterií z různých vzorků z prostředí. Po týdenní kultivaci se kultivační médium zbarvilo do černa a byl z něj cítit zápach sirovodíku. Ve vzorcích, které nám byly ve cvičení přiděleny, bylo ověřeno, že sulfát redukující bakterie jsou schopny přeměnit disimilační cestou SO[4]^2- na H[2]S. Ve všech vzorcích došlo k úbytku sulfátu z média, největší úbytek byl zaznamenán u vzorků S7 a TV1. U vzorku S7 se zredukovalo 48,141 % SO[4]^2-, u vzorku TV1 45,881 % SO[4]^2-. U S7 se vyskytovalo 0,188 % ve formě konečného produktu disimilační redukce sulfátu – H[2]S a 47,953 % ve formě meziproduktů – APS a SO[3]^2-. Vzorek TV1 obsahoval 0,161 % H[2]S a 45,72 % meziproduktů – APS a SO[3]^2-. Pravděpodobně došlo k chybě při stanovení množství H[2]S v médiu, jelikož zápach sirovodíku byl zřetelný. Praktická koncentrace SO[4]^2- v médiu byla stanovena na 109,247 mmol/l, zatímco teoretická koncentrace v námi připraveném médiu byla 23,03 mmol/l.