PRAKTIKUM č. 22
Biologický ústav LF MU Brno, 2006
Zásady práce s malými objem
a enzvm
Při pipetování malých objemů roztoků a enzymů se ujistíme že:
(1) používáme při manipulaci se zásobními roztoky vždy novou, sterilní špičku (zabráníme tak vzájemné kontaminaci zásobních roztoků)
(2) máme jednorázovou špičku ponořenou v roztoku, který odebíráme
(3) pipetovaný objem je správný (vyžaduje zkušenost)
(4) jsme skutečně přenesli požadovaný roztok do další zkumavky a tento neulpěl na stěnách (případně krátce zcentrifugujeme)
(5) enzym přidáváme do reakce až po přidání příslušného pufru
(6) enzymy uchovávány ve směsi pufru s glycerolem - při pipetování ulpívá velké množství zásobního roztoku na špičce z venku - proto ponořujeme špičku do zásobního roztoku pouze nezbytně hluboko pod hladinu
Nasazení PCR reakce
Podle tabulky v protokolu pripravíme
master mix pro 4 PCR reakce
K alikvotním podílům (25ul) přidáme 3 p DNA jednotlivých pacientů (vzorky A-D)
Promícháme, zcentrifugujeme a vložíme do amplifikátoru
Amph
e trvá
MTHFR
Methylentetrahydrofolátreduktáza
podílí se na metabolismu homocysteinu
Mutace v mthfr genu vedou v konečném důsledku ke zvýšení rizika žilní trombózy a onemocnění koronárních arterií
Záměna C^^T^ k tvorbě termolabilního proteinu (MTHFR-T)
DETEKCE GENOTYPU V GENU PRO
MTHFR
PCR amplifikace části genové sekvence mthfr(o délce 198bp)
PCR produkt podroben štěpení Hinf I
Cílové místo restriktázy Hinf I
5'...GTANT   C...3'
3...C   TNAaG...5'
PCR PRODUKTY A MISTA Hint I
Standardní protein:
tgaaggagaaggtgtctgcgggagCCgatttcatcatacgcagcttttcttt gaggctgacacattcttccgctttgtgaaggcatgcaccgacatgggcatca cttgccccatcgtccccgggatctttcccatccaggtgaggggcccaggaga gcccataagctccctccaccccactctcaccgcaccgtcct
Mutovaná termolabilní forma:
tgaaggagaaggtgtctgcgggag Cgatttcatcatcacgcagcttttctt tgaggctgacacattcttccgctttgtgaaggcatgcaccgacatgggcatca cttgccccatcgtccccgggatctttcccatccaggtgaggggcccaggaga gcccataagctccctccaccccactctcaccgcaccgtcct
Klíč Dro hodnocení výsledků
Pacienti: MTHFR C677T Pacient 2: MTHFR C677T Pacient 3: MTHFR C677T
negativní
požiti vní/heterozygot
pozitivní/homozygot
Výsledky vyšetření 6 pacientů
úkol: podle klíče v protokolu určete jejich genotypy
marker 100 b p
isotop
VÝSLEDKY VYŠETŘENI
V KLINICKÉ PRAXI
reštrikční štepení
Do 4 označených zkumavek přepipetujeme po 5 pi příslušného PCR produktu
Do každé reakce přidáme 1 pi NEB pufru č. 2, 3,5 pi vody a 0,5 pi enzymu Hinf I
Po promíchání a krátké centrifugaci inkubujeme vzorky 3 hodiny při 37 °C
Poté budou vzorky zamrazeny a uchovány do příštího týdne, kdy provedeme ELFO analýzu a vyhodnocení genotypů pacientů v genu mthfr