PRAKTIKUM č. 23
REŠTRIKČNÍ MAPOVÁN
Konstrukce reštrikční ma
plazmidové DNA
) Biologický ústav LF MU Brno, 2005 Připravili: David Šmajs, Petra Matějková
Reštrikční stečeni
Do 3 označených zkumavek připravíme podle tabulky v protokolu 3 paralelní reštrikční reakce (enzym vždy jako poslední)
Promícháme a krátce zcentrifugujeme
Inkubujeme 60-75 minut při 37 °C
V mezičase připravíme elektroforetický
Příprava 1% aqarózového
pro vzorky A-C restrikčního štěpení plazmidu
pDS1
1 g agarozy smícháme se 100 ml TAE pufru a rozvaříme v mikrovlnné troubě po dobu 90 sekund
Necháme zchladit na cca 50 °C a přidáme 5 ul Ethidium bromidu (POZOR TOXICKÝ-pracujeme v rukavicích)
Poté nalijeme do elektroforetické vany, vložíme hřebínek a necháme zatuhnout
Nanášení vzorků
Gel vložíme do elektroforetického aparátu a vyjmeme hřebínek
Vyjmutím hřebínku vznikají v gelu jamky, do kterých se nanáší vzorky
Do 1. jamky naneseme DNA marker - 1 kb NEB
(t.j. žebříček DNA fragmentů o známé délce)
10 pl každého vzorku (A-D) smícháme s 2,5 pl nanášecího pufru a naneseme do příslušné jamky
Priklopíme aparát a aplikujeme napětí 130 V po dobu 20-30 minut
Orientace aelu v el.
DNA je negativně nabitá a proto v el. poli putuje ke kladně nabité elektrodě
Při práci s elektroforetickým aparátem respektujeme barevná označení pro jednotlivé elektrody
Červená ■=> + pól
Černá
■=>   - pól
a r k« r
Cla I    Spv I
Cla
Závěr navržená mapa plazmidu
,C/al 'Spel
r
pDS1 (10,8 kb)
\
Odoovědi na otázkv k řešení:
1. Klonovaný fragment má velikost 7,4 kb.
2. Po štěpení oběma enzymy současně vznikají fragmenty o velikosti:
- 2,6 kb (C/ala Spe I)
-  3,4 kb (C/ala Spe I)
- 4,8 kb (C/ala Spe I)
3. Existuje pouze jedna varianta mapy plazmidu.
4. Rozdíl délek představuje vzdálenost mezi místy Cla I a Spe I v MCS (42 bp), a takový fragment nelze na 1% gelu detegovat.