PRAKTIKUM č. 24
KLONOVANI DN
Základy genového inženýrství
Klonovani PCR produktu do vektoru a transformace E
Biologický ústav LF MU Brno, 2006
Komerčně dostupný vektor
CR®2.1-TOPO a princip TOPO
klonování ílnvitroaen
+1
pCR®2.1-TOPO® 3.9 kb
CCCTT
GGGAl
PCR Product
JAGGG TTCCC
>o®
'ZHin
&
HO
Klonují se PCR produkty mající A přesah - amplifikované Taq polymerázou
Vektor dCR®2.1-TOPO
Obsahuje fragment genu lacZa, který kóduje část enzymu ß-galaktozidazy
Chromosom hostitelské bakterie obsahuje fragment Q
Kombinací těchto fragmentů vzniká aktivní
ß-galaktozidaza
Aktivitu tohoto enzymu lze detegovat
Přidáním derepresoru /ac-promotoru (IPTG) do media dosáhneme exprese fragmentu genu lacZa z vektoru
V případě přítomnosti chromogenního substrátu (X-gal) v mediu, je tato bezbarvá látka aktivitou ß-galaktozidázy přeměněna na barevný produkt
5-bromo-4-chloro-indoyl ß-D galactoside
CH2OH
OH
—i—O -^ H           OH^
OH         H
ß-galactosidase
5-bromo-4-chloro-indigo
X-gal
ß-galaktozidaza
Modrý produkt
Klonování PCR d rod u kt u
Voda pro mol. biologii Komerčně dostupný klonovací vektor pCR® 2.1 -TOPO
Klonovaný PCR produkt (přiDravenv ve cvičení č. 22
Inkubace 5 minut při lab. teplotě
Inkubace 2 minuty na ledu
Následuje transformace vzniklého konstruktu
Příprava ploten oro transformaci
Budeme mít k dispozici agarové plotny obsahující ampicilin (konc. 100 m g/m I)
Pro vyvinutí barevné reakce musíme přidat IPTG (derepresor exprese z /ac-promotoru) a chromogenní substrát X-gal
Na jejich povrch rozetřeme hokejkou 50 ul roztoku IPTG a 50 ul roztoku X-gal
Po půl hodině jsou misky připraveny k vysetí transformačních směsí
Transformace vzniklého
konstruktu do buněk £. coli
Do zkumavky na ledu přidáme 50 ul kompetentních buněk (= schopných přijmout cizorodou DNA)
Paralelní zkumavka bude obsahovat 50 ul kompetentních buněk a 1 ul cirkulárního plazmidu pCR 2.1 TOPO
Obě zkumavky inkubujeme 20 minut na ledu a podrobíme teplotnímu šoku ve vodní lázni >=> 42 °C po dobu 90 sekund
Znovu inkubujeme na ledu po dobu 10 minut a vysejeme na plotny s ampicilinem, IPTG a X-gal