PRAKTIKUM č. 25
DIAGNOSTIKA P
BAK
ENNICH
Identifikace patogennic
E. coli Domoci PCR amolifikace
Biologický ústav LF MU Brno, 2006
Diaanostika EIEC
El EC = enteroinvazivní E. coli
způsobují těžká průjmová onemocnění
obsahují virulenční plazmid
diagnostika založena na důkazu přítomnosti genů virulenčního plazmidu (konkrétně - c/rB)
pozitivní kontrola - gen na chromozomu
E. coli tonB
Nasazení PCR reakce (1
Podle tabulky v protokolu pripravíme 2x
master mix (A,B)
) s primery TonBUEC a TonBLEC ) s primery TonBU2 a TonBL
kumavek (alikvot 1>
Master mix B rozpipetujeme po 6 označený zkumavek (alikvot 13 pl)
Nasazení PCR reakce (2
Do jednotlivých zkumavek přidáme 2 ul DNA izolovaných s různých kmenů E. coli (1 pozitivní kontrola (+), 1 negativní kontrola (-), vzorky A-D
Obsah zkumavek promícháme, zcentrifugujeme a vložíme do amplifikátoru
Spustíme program A: 60 PATOGEN Amplifikace trvá cca 75minut
Příprava 1% agarózového
0,6 g agarózy smícháme se 60 ml TAE pufru a rozvaříme v mikrovlnné troubě po dobu 90 sekund
Necháme zchladit na cca 50 °C a přidáme 5 Ml Ethidium bromidu (POZOR TOXICKÝ - pracujeme v rukavicích)
Poté nalijeme do elektroforetické vany, vložíme hřebínky a necháme zatuhnout
Nanášení vzorků
Gel vložíme do elektroforetického aparátu a vyjmeme hřebínky
Vyjmutím hřebínku vznikají v gelu jamky, do kterých se nanáší vzorky
Do 1. jamky naneseme DNA marker (t.j. žebříček DNA fragmentů o známé délce - NEB 1kb)
K 15 ul v každé zkumavce přidáme 4 ul nanášecího pufru a naneseme do příslušné jamky
Přiklopíme aparát a aplikujeme napětí 130 V po dobu 20-30 minut
1kb marker
Detekce tonB
Ikb marker
C     D