\^j ovy BLOK VÝVOJOVÁ I. Úvod do vývojové biologie II. Základní principy a mechanismy vývojové biologie III. Kmenové buňky IV. Růstové faktory a signální transdukce Kmenové buňky: definice a kritéria 1. Co je to kmenová buňka? transientní populace öle původu jsou kmenové buňky označovány jako a)embryonální "1 b)fetální f c)dospělé (organové, tkáňové) öle diferenciační kapacity existují kmenové buňky a)totipotentní b)pluripotentní c)multipotentní d)oligopotentní e)unipotentní 2. Proč je znalost biologie KB tak důležitá pro medicínu? k léčbě nádorových onemocnění!!! možnost manipulovat s KB in vitro, případně řídit/kontrolovat jejich • v ^\\\t:Aú*\*W*mi*\\t:Aú:Aí\^ 3. Replíkační kapacita KB in vivo a in vitr m IN VITRO Pro srovnání ^33 3. Kl ona lita KB - „self-renewal" H! . o Buněčná smrt Diferenciační kapacita KB - teorie ES = embryonální KB MAPC = multipotentni dospělé progenitorove buňky HSC = hematopoeticke KB «»»••»9j^f Tissufl and Ong^n Diversification Zygote Slaslula Gaslrula ■JWiiraqETiH- 2S3 ES2S EÜK32S3- Monopolen! KB jsou pluripote C jsou multipotentni "Ser, Nové objevy však ukazují na něco jiného !!! s*A Nflf.fl Cßll ***** OthörS Nerve Cell í^llrV- PoocneatkL Cŕlls ES / l X Úiteobteste / w Hopfliocytea MAPC CMhefs -b- y NM OtftärS Dttwi i \ Her^opoieHc Otfwi MorvcCeJis ETeSf^ HSC Cnhe's Myogenic COHS embryonální KB í kapacita KB - prax -> multipotence -» olígopotence -^ unipotence hematopoetícke KB *-. CFU-E & BFU-E CFU-GM Pôvod a derivace kmenových buněk 1. Historie embryonálních a hematopoetických KB 1855 Virchow 1917 Pappenheim 1950-75 kolektiv 1961 kolektiv 1970 kolektiv 1981 kolektiv 1980-X kolektiv 1998 kolektiv „omnis cellula e cellula" KB v krvi přenosy jader a rozdílná reprogramační kapacita in vitro Colony-Forming Assay {C?A) embryonální karcinomové buňky (EC buňky) myší embryonální KB (mES buňky) různé dospělé KB lidské embryonální KB (hES buňky) Czech stem-cell work heightens calls for EU ruling Alison Abbott Czech scientists say they have derived three human embryonic stem-cell lines from spare embryos stored at tin hi vitro fertilization clinic in Brno. This makes the Czech Republic the first of the eastern European countries poised to join the European Union (fcU) to move into L hi st controversial research area. It also adds to pressure on the EL1 to decide whether to fund research on newly derived stem-edl lines. This research is C 02 allowed under strict ethical supervision in some EU countries» such as Britain and Sweden, but is banned in others, including Germany and Italy. Lust week the Spanish government changed sides and approved a proposed Jaw to allow the production nf cell lines from s pa re embryos tor research. The Czech Republic has no law controlling human embryonic stem-cell research. But Eva 5)'ková» head of the Centre for Cell Therapy and tissue Repair at Charles University in Prague, who developed ihc three cell lines together with colleagues at the Mendel University of Agricuh n re and Forestry in tirnoisays they are working to high ethical standards* They received informed consent from donor couples undergoing in vitro fcrt i lízat ion, she points out. The scientists are now characterizing the lines, and plan to study the celíš* potential to develop into differentiated cells such as neurons, which they believe could have therapeutic potential. They presented their results at a meeting in Prague last month, ■ MATURE VOL 11A17 AUGUST 2003 \ www.Tiatiiw.L-Lnii/n.imrr 2. Izolace/derivace KB Embryonální KB IH3B5í BlasTocysTa +Z.K ICM 7 dní první posaz Buněčná linie!!! ICM 24 hodin 3 dny po pasáži Hematopoetické KB • „niche" (hnízdo) KB • mobilizace KB • bunecne tndeni CĎ34+ CĎ133* c-kiť HLA-ĎR- Ü38- Ü71- Buněčná subpopulace Dospěle KB a jejich „niche1 Obecná struktura a funkce „niche Niche cell Adhesive molecule ECM Basement membrane Stem cell Progeny cell Spkl e* IDiirärĽiiUiibŕd Diffiren|ie|ln9 Cell« -EncefMrtdocrin* -Enberocyte 1U \ ŕ \ t TA = tzv. „transient amplifying" buňky -,\ rvu-, \ / * # Hematopoeticke KB v kostní dřeni Endothelium Accessory cells 1-7 = signály kontrolující prostředí «niche11 8 = adhezní molekuly napomáhající přežívání hematopoetických KB Osteoblasts Signály definující «niche" intestinálních KB a regulují jejich proliferaci a diferenciaci - Wnt, BMP, Notch, Ihh *! Stromal cells P liehe" je soubor podporných buněk, | ^ „Inicmc yc auuuui puupurriyun uuncr\, ixtracelulérní matrix a signálních molekul Charakterizace KB - příklad 1 Růstové charakteristiky, morfologie a systém proteinových, cukerných a genových markeru definují typ/stav KB Nediferencované lidské embryonální KB Diferencované lidské embryonální KB rRA-l-60/PI Wim''' i<^m^^':^0^^i *íyl BlluB rRA-rigP£gf a^L 3&*vD ^N" * **' 'í-Víí-, < v.' - SsÄ /•■* SSEA-4/F í# Linie CCTL12 Linie CCTL14 8 days -%$ | 8 days •r — •«* : — * v:'*. , :- >: ■ £> Thy-t/PÍ: ^vn|^ ^ 1 15 dl 15 Oct4 CCTL9 MEFs 5 + 10 days 5 + 10 days Charakterizace KB - příklad 2 Průtoková cytometrie a membránové markery lidských embryonálních KB CCTL9 CCTL14 0) > 60.00 +■> w o ^ 40.00 1 i ■ W n 1 iL, inpn 1-1 J III ml II III ,nl J 1 kfhJI 1 Ml 1 LnJ 1 ■ CCTL9 TP ■ CCTL9 TP (D > 60.00 W O O- An nn Jki IdUír |dCCTL14TP' CCTL14TP: >■ £2 °P O O £ H IT) CN m CD a: z > a: l_ r- "^ l_ CD CO 3 8 t- LO CD < < < < CN 2 < OĹ o: o: o: z > OĹ CCTL12 100.00- W o Q. 40.00 u fi-n—■- M i«fk, Ä rinJ DCCTL12TP DCCTL12TP X m en cm co t ií) CM lO (D J. J. Jľ! fO ' < < < < C\l z < 0Ĺ Ol Ol Ol Z. > 0Ĺ Antibocty Code A Ant igen Comment A2B5 01 G T3 Gsngliosideglycoli pid B159 02 NC AM GCTM2 03 GC TM2 Kerstan Sulphate rel ated* GCTM343 04 Ger M343 Kerstan Sulphste rel ated* MC480 05 SS EA1 MC631 06 SSEA£ MC813-70 07 SSEM TG30 08 CD9 Thy-1 09 THY1 VM&32 10 HLAA-B-.-C TRA-1-81 11 TRA-1-81 Kerstan Sulphste related* TRAr1-85 12 Ok(a) TRAr2-49 13 L-ALP TRA-2-54 14 L-ALP VIN2Pb22 15 GD2 Ganglioside glycolipid VINIS56 16 GD3 Gsngliosideglycolipid TR/V1-60 17 TR/V1-60 Kerstan Sulphste related* P3X control * GCIM2,GCIM343 TRA-1-81 andTRA-l-60recogiiseafairn> of related molecular weight glycoproteins, carrying keratan sulphäe. 848428�9 In vitro diferenciace lidských embryonálních KB - současné pokroky • Neurony, astrocyty, oligodendrocyty • Kardiomyocyty • Endoteliální buňky • Pankreatické ß buňky • CĎ34+ hematopoeticke progenitorove buňky • Antigen-prezentující buňky a NK buňky • Buňky plicního epitelu • Osteoblasty , • Hepatocyty • Melanocyty • Buňky prostaty Vývoj účinných diferenciačních protokolu Příklad: In vitro diferenciace hematopoetických buněk Embryonální KB Knock-out/Knock- \r\ Analýza genové exprese JWezodermalní buňky Hematopoetické progenitory Zralé krevní buňky Časná hematopoéza Diferenciace hematopoetických KB Diferenciace B buněk Diferenciace osteoblasts Ď14 Hematopoctíckc ppogenítopy ppo transplantace??? Použití lidských embryonálních KB •Studium vývoje člověka na buněčné a molekulární úrovni •Nádorová biologie - nádorové KB •Tvorba modelu různých onemocnění •Studium „genových cílu" pro nová léčiva •Testování léčiv, teratogenních a toxických sloučenin •Studium mechanismu regenerace tkání •Buněčná terapie Krok 1 důkladná charakterizace a srovnám všech existujících linií lidských embryonálních KB !!! Ist ISCI meeting, August 4-6, 2005 Bar Harbor, Maine, USA a mnoho dalších úkolu COMMENTARY «II iteration and funding support for stem ::'[[ research ffiblt I.1- The International Stem tcĽ Initiative grew t-u t of t meeting held under the- auspices of ths Forum in Undon In May 2ŮÚÍ. The meeting brought together «perte in hES cell research from around the world to plan an international collaborative effort to establish b set oF standards foi the characterization of hES cell lin«. The group decided to begin with what was envisioned to be a reEativefr simple project, namely to collect as many hES cell lines as possible and carry out a baste set of char-acteriittion studies on them under defined conditions.The exercise, which is supported by funding torn the Forum members, is being conducted with the cooperation of the Uli Stem Gelt Bank as a central hub for collection and distribution of materials. Forum members were invited to nominate laboratories to submit their hES ceD lines to the Initiative, Prospective participating laboratories were ashed to certify that their hES cd lines had been derived following generally accepted ethical guidelines and to agree that all information generated by the Initiative would be placed in the public domain. Seventeen laboratories from 11 Forum member countries agreed to participate and are contributing a total of 7S hES cell lines to the study {Hg. 11 These laboratories are carrying out surEace* antigen espres» n analyses on theirovmcefls and preparing nucleic acids and other samples for study by several other central reference laboratories. o? Characterization tttjtflst JSJvTh? studies include flow cytometric analysis of Bflphe expression of 17 sur Esce antigens* qu-antita- ^^ tive KT-PCR analysis of the transcript levels of -100 genes characteristic of plunpotent stem «lis and their early differentiated derivatives, snd in srimination s f haw the expression Table 1 Member* erf the lute in:,[ tonal Slam Cell Fof urn ■:". ■:■ 11 r 11 r; ŕ- ■ UK Thi Czech Sweeten Finland im Uemeilfindt f^řuWic H -u-'-.il :' .■jl-.iif* Canada« NithHtarris« C»rt|f'l]|JUt.|PLJ í ", .--.■.'..■' OtfWTmk '■>-"!-:--* ílWKĚ S^lííéľiärM Gřimani Uli* Finland* USA* Iff Mr« h-'-'n.ii...mi ii"ľi:-' J'jhsiiId [> ubite. F.YiíJKh Uundadon Flpift 1 Cůunliits oi cíifli'i ,: hF "■ ■---ľ in«, in ttiHnitiathnj ßtiniks indica+t-Turnbw ůf hFS. t*ll lin« oŕrtlributrf bf ttth oounfry pattern of these -100 genes changes in response to a simple differentiation protocol involving embryoid body formation. The antigens chosen are those commonly used by many groups to define hES cells. They include markers such as S3EA3hS3EA4,rrJTl and the antigens de&ned by antibodies TRA*l-rO and GCTM2, all of which have been previously reported to be-characteristically expressed by undifferentiated hES celts, To ensure standardizalionhagr*e-ment was reac hed with theewners of all the key hybridomas that define these marker antigens. to deposit them in an archive at the National Institute of Biological Standards and Control in thelTKhthe home of the UK Stem CetlBarut and i WHO EeFerenee Laboratory The gene expression studies are («used on molecules that are widely reported to be good markers of human pluripotent stem eells^ including some whose functions are likety essential to maintenance of pluripotential-itjV such as fOUSFl [also known as OCH), NANQG> SOU ZFPH (also known as XEX1), LTTI, GDF3, fCKßf, TERT> FGH> and others, such as UFR and LRPPRC íafeo known a& GP130), whoee role in maintaining pUiripoten-tiality is more controversial, Also included in the analysis are genes whose expression marks particular differentiation lineiges, for example» T (at» known a* BRAGTfVRY; mesoderm), MYFS miMYODl (mustle marker*):. GJJA4 {endoderm), I4T (hepitocytes}, and IMS (pancreatic beta ..ill: "i Addi tiůrií litudire are aimed it assessment of thtepi genetic «hUlccf the t*J line* (incpresiion of imprinted genes}, examination of spa* tial patterns of marker expression in grow* ing colonies by immunostaining m situ, and histological evaluation of teratomas formed by the cell lines. In addiltonh each Lne will be subjected to DNA fingerprinting, to provide definitive markers for identifying each line in future studies, and to microbiological analysis that will include a screen for possible endo* genous retrovirus expression. KaryotypingwtE not be performed, but participants will be asked to provide karyotype data for each of their lines. Li toewise, although the Initiative will not exam* inexenograft tumor production, participating laboratories, have been invited to submit hisbo* logical slides of any xenografts that they have produced from their line« for review by a histo-pathologistwith expertise in this area. The Fík* examination of the preliminary dataset will take place at a two-day meeting of the Initiative participants at the Jackson Laboratory, in Ear Harbor, Maine, in August 2005, The entire analysis sho uld be completed by the end of 2005. ATI the data will be placed in the public domain and will be available from the Es mm website. Goals oT in* Initiative What are the expected outcomes of this firsl phase of the bit iative? Moslresearehers anticipate that expression of canonical cell-surface markers and pluripotency genes will be fairly consistent across the panel of cell lin** but in fait in exercit* Oh this stale mi/ tum Up outliers with highly informatiw properue\ VOLUME23 NUMBER 7 JULY 2QD5 V*ILRI[ Napr. vývoj nových kultivačních systému pro KB Funkční hydrogely jako nosiče embryonálních KB a prostředí pro jejich diferenciaci 4 dayi 6 days S days Nové objevy v oblasti KB 2006 - populace velmi malých buněk v kostní dřeni, které se podobají embryonálním KB a které mají morfologii a markery nediferencovaných KB Sca-1+ lin- CĎ45" buňky jsou asi 2-4jim velké Sca-1+ lin- CĎ45+ hematopoetické buňky jsou asi 8-lOjim velké SSEA-l # DAPI • Oct-4 • • ♦ * J] ĎAPI Nanog • r\ ĎAPI Ratajczak a kol., 2006 a diferencující in vitro do kardiomyocytu, neuralních a pankreatických buněk neurosfery ??1 ibryoidní tělíska ??? multiliniová diferenciace !!! -- a oktinin DAPI troponin I m OA nestin \ VMPI| DAPI ** •• * E tubu PI c-peptíd DAPI — 1 4p Ratajczak a kol., 2006 Základní terminoloaie v oblasti KB: •Totipotence- schopnost diferencovat do jakéhokoliv buněčného typu, včetně zárodečných buněk a trofoblastu; absolutní „univerzálnost" (oplozené jednobuněčné embryo - zygota) •Pluriootence- •MultiDotence- •OliqoDotence- (embryonální kmenové buňky) schopnost diferencovat do mnoha buněčných typů v rámci jedné tkáně nebo orgánu (napr. hematopoetické KB) schopnost produkovat více než jeden typ zralých buněk (např. myeloidní progenitory) •Proqenitorove buňky-termín Často zaměňovaný s termínem KB; označuje buňky vzniklé z KB, které mohou lIKXSliiJ! IJfsMMWII Buněčná linie •Plasticita- Transdiferenciace- Knock-out- buňky které mohou být udržovány a množeny in vitro a jsou imortalizované (nesmrtelné) nebo vykazují neomezeně dlouhou životaschopnost (nádorové linie, embryonální KB) termín používaný pro vyjádření schopnost KB vytvářet specializované buňky různých tkání a orgánů schopnost určitých buněk jednoho orgánu nebo tkáně, včetně KB nebo progenitoru diferencovat do buněk typických pro jiné orgány nebo tkáně (např. hematopoetické KB - kardiomyocyty nebo hepatocyty) technika molekulární genetiky sloužící pro inaktivaci (umlčení) genu, většinou homologni rekombinací technika molekulární genetiky sloužící pro vložení genu do buňky Prezentace přednášky bude přístupná na: https://is.muni.cz Studijní materiály Biologie - přednášky (jaro 2006)