Nádorové transformace buněk. Marie Kopecká, Biologický ústav LF MU Brno 2006 Nádorová transformace linie myších fibroblasts 3X3^ pomocí lidské nádorové DNA (=transfekce) DfSJA from human tumor cells Transfect mouse 3T3 cells DNA isolovaná z lidských nádorových buněk Xransfekce myších fibroblasts lidskou nádorovou DN Culture for 2 weeks Focus of transformed ľvJ I H/3T3 ceils growln ■j-i'i Long u n t r a n sfo Í Extract tr^nsf o- D 4SI A. rm ne\Aŕ mouse cells běuů[Vi cveie Po 2 ľýdnech vzniká ohnisko myšícn transformovaných buněk Druhý cyklus transfekce DNA isolovaná z ohniska transformovaných myších fibroblastu +______Z isolované DNA konstrukce g e no mové knihovny ve fágových vektorech olonie bakterií obsahující fágové vektory (genomová knihovna transformovaných myších buněk) *£\Jlj profc>e Rephca ort f i Iter fj-aper [identifikace lidského onkogenu Uoísh a kol. (IÔm)""*^ V ^Ší DNA P°m0CÍ A|U SOn^ • Podstata nádorové transformace je genetická. • Mutace postihují geny signálních drah, kontrolních bodů buněčného cyklu, buněčné diferenciace, apoptosy, reparace DNA... • V proběhu buněčných dělení jedné kmenové buňky nastává postupná akumulace několika mutací v uvedených skupinách genů, které resultují v její nádorovou transformaci. Nádorová transformace nastává postupnou akumulací několika mutací v životně důležitých genech kmenové buňky a mutation gives one cell an advantage epithelial cell growing on basal lamina CELL SURVIVAL AND PROLIFE RATION a second mutation increases the advantage a trhircl mutation increases the advantage further 1CELL RROL SURVIVAL AIM D LIFERATION i DANGEROUS CELL SURVIVAL, PROLIFERATION AľSID INVASION Alberts a kol. (2004) První mutace: Buňka začíná proliferovat bez růstových faktorů Druhá mutace: Buňka přežívá a dál proliferuje bez růstových faktorů (benigní nádor) Třetí mutace Buňka přežívá nebezpečně douho, neustále proliferuje a začíná invase do okolí vzniká maligní nádor • mají poruchu regulace buněčného cyklu, • nereagují r\a signály z okolí buněk, • vykazují autonomní („asociální") chování, • nejevící odchylky od výchozí buňky a • dělící se v místě svého vzniku • jsou buňky nádoru benigního (menší riziko), • odchylující se od výchozí buňky, • Vyznačující Se invazivitOU („prorůstáním" do okolí) a • vytvářející vzdálené metastázy, jsou buňky nádoru maligního (vysoká úmrtnost). Prubeh nádorového onemocnění lze shrnout do tří údobí: 'Iniciace: nevratná mutace určitého kritického genu (např. genu kontrolního bodu buněčného cyklu). 'Promoce: bývá dlouhá (i desetiletí), nenápadný vývoj, mutované buňky stimulovány dalšími faktory k výraznější proliferaci. Může, ale nemusí vést k výrazné manifestaci choroby. 'Progrese: nárůst mutací genů stimulace růstu, genů kontrolních bodů buněčného cyklu, transkripčních faktorů... Nádor se stává invazivní (prorůstá do okolí), metastazuje na vzdálená místa, vaskularizuje - (prorůstání cévami). BREAST CANCER * Normal Duct In sttu Cancer Histologický řez mlékovodem ■** v počátečním (promočním) - stadiu nádoru prsuľ "^g^v \ v Human breast cancer - in situ 1991:324:1-8? Nádorově transformovaná buňka maligního nádoru: 1) Nekontrolovaná prolíferace (bez přítomnosti stimulu k dělení) 2) Invaze 3) Kolonizace nových teritorií-metastázy. \ (cancer cells) Primární nádor v epitelu se šíří přes bazálni laminu do pojivové tkáně, do krevních i lymfatických cév. (Alberts a kol. 2004) Nádory benigní a maligní nádory benigní: buňky proliferují nadměrně, nádor odstranitelný chirurgicky, pr.: papilom (z epitelu), adenom (ze žláz.epitelu); nádory maligní: buňky proliferují nadměrně, invase buněk do okolní tkáně, do krevních a lymfatických cév, kolonizace nových teritorií, vznik sekundárních nádoru {metastáz) pr.: karcinom (z epitelu), adenokarcinom (ze žláz. epitelu), obtížně odstranitelný; Príklady nádoru Nádory benigní (nezhoubné): z povrchového epitelu*, ze žlázového epitelu*, z pojiva*, z chrupavky, z kosti*. ze svalu*. papilom adenom fibrom Chondrom osteom my o m Nádory maligní (zhoubné): karcinom adenokarcinom fibrosarkom Chondrosarkom Osteosarkom myosarkom Stádia vývoje nádoru v colon: normální sliznice —► polyp -» adenom —► kolorektální adenokarcinom. Dědičná predisposice: adenomatosní polyposa coli (mutace 1 alely genu APC). adenomatösen polyposa coli (mutace genu APC) This is wnat poiyps iqok hks msiae tne colon olorektalni adenokarcinom Nádorová onemocnění vznikají kaskádou mutací genu. Geneze kolorektálního karcinomu (Vogelstein). 7 Mutations Lead to Colorectal Carcinoma První mutace,druha muta^ Normal epithelium \ 1P 2. AP C - adenomatous polyopsis coli hyperproliferative epithelium j*. early adenoma \ 3. K-ras intermediate adenoma \^ 4? 5. DCC - deleted in colon carcinoma late adenoma v 6?7. p53 carcinoma \ Other changes See Fearon & Vogelstein metastasis Při vzniku kolorektálního nádoru první mutace je v APC v signální dráze „Wnt pathway". A) vlevo dráha vypnutá, B) vpravo dráha „zapnutá. Mutace APC—»vznik nádoru. Jak? Mutovaný APC nedeqraduje ve vypnuté dráze Ď-catenin,který stimuluje transkripci genů, tím proliferaci buněk—>nádor. bez Wnt signály > WITHOUT Wnt SIGNAL (B) WITH Wnt SIGNAL Wnt inaktivní receptor 1 inactive inaktivní signálníreceptor protc i n i inactive signaling protein active'' ">"" receptor 1 Rktivrií APC O active Ai contain mplex pegraduje ß-cateni&greKiation v^ ^ q I of ß-cateh'rn-... qkö I ......*o o mutace APC \ 1 Wnt signál* i aktivovaný receptor I aktivuje signální protein inaktivuje'' APC O active signaling protein inactive APC containing complex vypnutá transkripce ■i proliferace. nactive TCF complex I stable ß-catenin active TCF complex nedegraduje ß-catenin! i DNA Wnt-RESPONSIVE GENES OFF nádor / aktivace transcription of Wnt- transkripce RESPONSIVE GENES ■a proliferace Figure 21-50 The APC protein keeps the Wnt signaling pathway inactive when the cell is not exposed to Wnt protein, it does this by promoting degradation of the signaling molecule ß-catenin. In the presence of Wnt, or in the absence of active APC, free ß-catenin becomes plentiful and combines with the gene regulatory protein TCF to drive transcription of Wnt target genes. Alberts a kol. 2004 * Stupňovité hromadění mutací v proběhu nádorové transformace postihuje: • proto - onkogeny (projekt hugo - asi 100 protoonkogeno v lidské somatické buňce); • tumor-supresorové geny (projekt HUGO -asi 40 tumor-supresorových genů v lidské somatické buňce) ■ a některé další .... Proto-onkogeny a onkogeny. Proto-onkogeny: jsou součástí genomu každé lidské buňky, kódují cykliny a cyklin-dependentní kinázy řídící buněčný cyklus, kódují růstové faktory a jejich receptory, kódují proteiny transdukující signály (tzv.nereceptorove proteinkinázy) a transkripční faktory, kódují proteiny buněčné diferenciace, apoptosy... Příklady proto-onkogenQ: Ras, Abl, Src, cyklin Dl, CDK4, Myc... Onkogeny: vznikají mutací proto-onkogenQ, mají tumorigenní charakter. Mutace dominantní: k expresi stačí mutace 1 alely. Mechanismy vzniku: - genová mutace - genová amplifikace - virová transdukce - virová inzerce - chromosomová přestavba (Klener, 2002). Při nádorové transformaci nastává transkripce onkogenQ onkoproteiny—»nádor. Príklad Ras proto-onkogenu a Ras onkogenu Ras protein leží na vnitřní straně plasmamembrany. Je součástí signální dráhy od receptoru plasmamembrany do jádra. V normální buňce se signální dráha „zapíná", když se růstový faktor naváže na receptor PM—► aktivace RAS (RAS-&TP)—► přenos signálu na další protein—>inaktivace RAS (RAS-£ĎP)—»vypnutí signální dráhy. Mutace proto-onkogenu Ras —► onkogen Ras: Mutovaný Ras-ôTP neustále vysílá signál a aktivuje MAPKinásovou dráhu transkripce a proliferace i bez růstových faktoru =^> nekontrolovaná proliferace „jako když se pokazí zvonek u dveří —► zvonek neustále zvoní, aniž někdo u dveří zvonľ. Poruchy signalizace u nádorové buňky •Př.: Ras, Abi, Src-kódují proteiny signálních drah buňky. •Ačkoliv je receptor inaktivní, mutovaný signální protein navozuje dělení nádorové buňky (vpravo) i v nepřítomnosti růstového faktoru. nadiv« grúwch fiKlor íocflptor ■growl h fa&tcw L gonoroquSrod fur till [irqliterrtliůn aetivacad growth loctor rcííptor inícliuato growth -" (actor reco-plor NORMAL RESTING CELL IB) NORMAL PflOLI FE RATING CELL (CI PROLIFERATING CANCER CELL Tumor-supresorové geny. V nenádorové buňce kódují proteiny, které brzdí buněčný Cyklus („molekulární brzdy"), a proteiny reparující DNA. Jejich mutace vede k nekontrolované buněčné proliferaci,a k hromadění mutací v genomu. Mají recesivní charakter, k jejich expresi je třeba mutace obou aleI.Mohou být zděděny (5-10%). Př: Retínoblastomový gen Rb - mutace retinoblastomového genu ve zhoubném nádoru sítnice retinoblastoma ale i v dalších lidských nádorech. Jeden z prvních objevených tumor-supresorových genů. Nemutovaný gen přítomen v buňkách a zapojen do regulace buněčného cyklu v tzv. restrikčním bodu v 61 fázi. Jiné příklady: geny p53, APC, BRCA 1,2, NF... Kontrola bodu R („reštrikční bod") přechodu buňky z Gl do S fáze (R bod v Gl fázi) je založena na regulaci vazebné aktivity proteinu pl05 Rb (retinoblastomový protein). Gen Rb byl poznán jako mutovaný v nádoru sítnice oka - retinoblastoma Později zjištěno, že jeho nemutovana forma přítomna v normální lidské buňce, kde protein pRb váže transkripční faktory E2F, které jsou nutné pro přechod buňky z Gl do S fáze. Inaktivace pRb závisí na fosforylaci pomocí CÓK4,6+ cyklinö D. Fosforylace proteinu pRb změní jeho konformaci a tím se uvolní transkripční faktory E2F, které stimulují transkripci genů pro cykliny E,A a další geny, nutné pro postup buňky do 5-fáze. HOW ARE S PHASE PROTEINS ACTIVATED? ^> É2F ATP AD P 1. In normal cells, the Rb 2. If growth factors arrive and protein binds to E2F and activate the cyclin-CdK complex, Shuts down the cell Cycle, Ab becomes phosphorylated. C^> t 1 S phase proteins mRMA + t 3, E2F is released. M?ttHtfWt#%#%*te DNA 4. E2F stimulates the production of S phase proteins, Ještě jednou Gl fáze buněčného cyklu a průchod do S fáze: cyklin Ď- CĎK f OSf orylují pRb, tím se uvolní transkripční faktory E2F, které spustí expresi cyklinu E a A, a enzymů replikace DNA: dhfr, tk, dna pol-a, CbCZ, E2F. Cyklin E- CĎK2 dokončí fosforylaci pRb —► výstup z restrikčního bodu 61—► autonomní průběh, nezávislý na mitogenních faktorech. Sherr (1996) Replication machinery (ORCs. MCMs. CDC6) Replication ** machinery RetinoblastomovQ dráha a dráha proteinu p53: šedé čtverce ^potenciální onkogeny (Ras/CyklinĎ/CĎK4..)/ bílé čtverce ^tumorové supresory (INK4/Rb/p53..). V lidských nádorových buňkách jsou mutace v těchto genech, které ruší molekulární „brzdy" v buněčném cyklu a způsobují poruchy kontroly buněčného dělení. Mitogen! c Signals RetinoblastomovQ dráha ARF dráha proteinu p53 Sherr, 2000 DNA Damage -O* Proliferation Growth Arrest & Apoptosis • Alfred G. Knudson (1971)-autor dvouzásahové hypotézy vzniku nádorů, vysvětlující, proč yzácnýoční nádor retiny se v dědičně postižených rodinách vyskytuje castěji, než nádor vzniklý náhodnou mutací u jedinců z dědičně nezatížených rodin. U rodin s dědičnou predisposicí jedinci mají jednu aleíu £6 genu mutovanou ve všech svých buňkách (isou heterozygot!' Rb/rb), mutace druhé alely (vznik rb/rb) během života u nich vyvolá retinoblastom. Naproti tomu u jedincůjdědičně nezatížených (homozygotů Rb/Rb) mutace jedné alely chorobu nevyvolá (vznikne jen heterozygot Rb/rb) a ke vzniku nádoru musí nastat „druhý zásah" působící mutaci i druhé alely homologního chromosomu (musí vzniknout homozygot recesivní s oběma nefunkčními alelami rb/rb). •The child above has advanced retinoblastoma. The tumor is protruding from the left orbit, after removal of the eye approximately two months earlier. (A) overactivity mutation (gain of function) single mutation event in proto-oncogene Proto-onkogen —► onkogen: dominantní mutace —> hyperaktivní produkt creates oncogene norma! cel excessive survival and proliferation activating mutation enables oncogene to stimulate ceil survival (B) underactivity mutation (loss of function) Tumor-supresorový gen: recesivní mutace —> ztráta funkce normal cell mutation event -------------»- inactivates tumor suppressor gene no effect of mutation in one gene copy second mutation event inactivates second gene copy excessive survival and proliferation Alberts a kol.(2004) two inactivating mutations functionally eliminate the tumor suppressor gener stimulating cell survival and proliferation DNA r DNA damage } inactive e p53 1 A CT I V P VATION I OF -»—-J )53 + ŕZZ \±fJ ^- active p53 Při poškození DNA p53 zastaví BC v Gl fázi pomocí transkripce p21. i c ACTIVE p53 BINDS TO REGULATORY REGION OF /i^V GENE ps?/ gene l "l 1 X 1-------1 TRANSCRIPTION I-------- I p2 1 rnRNA TRANSLATION Inhibitor p21 blokuje funkce CĎK p2 1 ÍCdk inhibitor protein) ^-p~ ACTIVE S phase cyclin-Cdk compl ex INACTIVE p2 1-S phase cyclin-Cdk compl ex iEilüüf; |-üiC'l ühJTi DIIRI ir-UlkJi- Ďalší funkce p53\ • Poškození DNA detekují kinasy ATM/ATR /od názvu choroby Ataxia teleangiectasia mutatedX • Tyto kinasy aktivují: • CHK2 kinasu kontrolních drah poškození DNA, která fosforylací stabilizuje protein ^53, který je doležitýrn faktorem při rozhodování o dalším osudu buňky • a produkt genu BRCA1 ^Breast Cancer 1), aby mutace mohla byt reparována. • Po zástavě cyklu a reparaci buňka pokračuje v buněčném cyklu. • Nelze-li reparovat, je navozena apoptosa. Lodish a kol. (2004) DNA damage Cell-cycle arrest Apoptosis DNA repair •Mnohostrannost p53 naznačuje, že jeho mutace je zdrojem řady poruch. Mutace p53 jsou naíézány u poloviny všech lidských nádoru (sarkomy,leukémie, karcinomy plic, mléčné žlázy, tlustého střeva). Paralelní dráhy monitorující poškození DNA („checkpoint pathways") u člověka a kvasinek v časné 61 a pozdní 62 fázi buněčného cyklu vykazují jisté homologie. Parallel pathways in early and late S phase checkpoint response Humans S. pombe 5. cerevisiae ATM/R Rad3 Mecl J \ Í \ i x Chk2 Chkl Cdsl Chkl Rad53 Chkl / 1 \ 1 v 1 „53 Cdc25 ■-> Cdc25 ? P