Mutace, poškození DNA,Mutace, poškození DNA,
,,DNA,,DNA repairrepair""
MUDr. Iva Slaninová, Ph.D.
Biologický ústav LF MU
Typy mutací
Genomové (numerické aberace
chromozomů)
Chromozomové (strukturní
aberace chromozomů)
Euploidie Aneuploidie
Genové (bodové)
mutace
Chromozomové mutace
Praktická cvičení 12-05
DELECE,
DUPLIKACE,
INVERZE,
INZERCE,
RING,
TRANSLOKACE
Genové mutace
Praktická cvičení 11-05
Nečas a kol., 2000
Mutace v somatických a
zárodečných buňkách
Somatické mutace projeví se v jediné buňce ­ pokud se
dělí klon buněk - žádný fyziologický vliv nebo zánik
buňky nebo vede k nádorové transformaci ­ vliv
na daného jedince
Mutace zárodečných buněk- přenášené na potomky -
intrauterinní zánik plodu, nebo vrozené vývojové
vady -vliv na vývoj druhů
Pravděpodobnost vzniku ,,úspěšné" germinativní mutace
je nízká: 1:1000000.
Mutace
Tisíce změn denně
Jen 1 z asi 1000 změn DNA vede k permanentní
mutaci
Opravy
Evoluce Genetická
stabilita
xx
Mutagenní faktory
Fyzikální ­ záření ­ ionizující (X, , neutrony, protony,
elektrony). Kovalentní vazby nukleotidů, zlomy DNA.
- neionizující (UV)- specifičtější ­ konjugované dvojné
vazby bází pohlcují specificky UV o vlnové délce 260-
280 nm ­ dimery thyminu
Chemické ­ genotoxiny ­ alkylační činidla (yperit) ­
předávají DNA alkylové skupiny (methyl, ethyl)
Silná oxidační činidla (peroxidy, kyselina osmičelá)
Desaminující látky (dusitany)
Interkalační látky (akridiny)
Aromatické aminy (benzidin, naftylamin)
Mutagenní faktory
Aromatické nitrosloučeniny (nitrofurany, nitropyren)
Azobarviva a triazenová barviva
Hydrazin a jeho deriváty
Urethan a jeho deriváty
Mn, Ni ­ narušení replikace
Nepřímo působící mutageny - látky mutagenní po změně
buněčnýmy enzymy ­ polycyklické aromatické uhlovodíky,
mykotoxiny, nenasycené MK
Typy poškození DNA
Depurinace a deaminace
Chemické modifikace nukleotidů
Poškození DNA ultrafialovým zářením
Další
Depurinace a deaminace
Asi 5 -10000 purinových (A,G) bází denně mizí ztráta baze delece
Asi 100-600 deaminací cytosinu za vzniku uracylu ­ chemická
modifikace baze, záměna
Deaminace
Chemická modifikace
Chemická modifikace (ROS, záření), například
oxidací thyminu ­ thymin glycol
http:saturn.roswellpark.org/huberman/DNA_Repair/damage_types.htm
Důsledky chemické modifikace nukleotidů
 Espero Publishing, s.r.o.
Deaminace C ­ U ­
při replikaci místo G-
A ­ záměna bází
Depurinace ­ ztráta
nukleotidového páru v jedné ze
vznikajících dceřinných DNA -
delece
Poškození DNA ultrafialovým
zářením
 Espero Publishing, s.r.o.
Vznik kovalentních vazeb mezi sousedními thyminy ­
thyminové dimery (pirimidinové dimery). Ty jsou
překážkou v replikaci a transkripci - mutace nebo
smrt buňky.
Další
Mischamsches ­ nesprávné párování ­ chyby v replikaci
Zlomy -SSB single strain break ­ 1 řetězec
DSB ­ double strand break ­ 2 řetězce
Kovalentní vazby mezi bazemi - crosslinks
Frekvence mutací v 1 lidské buňce za 1 den
50000 single strand break
10000 depurinací
600 deaminací
2000 oxidačních lézí
5000 alkylací
10 double strand breaks
Opravy mutací ­ DNA repair
K mutacím dochází nejčastěji během proliferace.
Většina je jich opravena už v průběhu replikace DNA
,,kontrolním čtením" DNA polymerázou - korektura.
DNA je jediná molekula, která je opravována,
ostatní jsou vyměněny !
Enzymatické odstranění chyb v DNA, které vznikly v
průběhu replikace, rekombinace nebo působením
vnějších vlivů
Oprav DNA
se účastní
asi 130 genů
DNA repair or DNA damage checkpoint pathways
(collectively known as the DDR) phenotypes overlap with
the protein interaction map. Shown is part of the DDR
protein interaction map derived from two-hybrid
interactions detected in the matrix and in proteome-
wide screens.
Science
Obecný princip oprav
DNA
1) Rozeznání a odstranění
chybného místa
2) Vyplnění mezery
3) Spojení řetězce DNA
Body 2-3 téměř stejné u
různých typů oprav, v
bodu 1 jsou u různých
oprav zúčastněny různé
proteiny
Základní typy oprav
Přímá chemická oprava ­
oprava alkylací a metylací
Glykosylázy opravují špatně zařazený T na C ­ není potřeba
zlomu
Fotoreaktivace
Excizní reparace ­ poškozená báze je odstraněna a
vyměněna za správnou ­ 3 typy
1. Base excision repair (BER)
2. Nucleotide excision repair (NER)
3. Mismatch repair (MMR)
Fotoreaktivace
Opravy (štěpení) pyrimidinových dimerů ­ absorpcí
kvant viditelného záření ­ porušení kovalentních
vazeb ­enzym CPD photolyáza ­ není u savců!!! Je
aktivován světlem vlnové délky 340-400 nm
Excizní reparace
Odstranění poškozeného úseku 2 řetězcové DNA
excizní endonukleázou a zaplnění vzniklé mezery
opravnou syntézou (DNA polymerázou). Nový segment
je napojen DNA-ligázou.
BER ­Base excision repair
V každé b našeho těla proběhne
asi 20000 x denně. Opravy
důsledků oxidačního stresu
1. Odstranění porušené baze
DNA glykosylázou
2. Odstranění deoxyribóza
fosfátu (endonukleáza a
fosfodiesteráza)
3. Výměna za správný nukleotid ­
DNA- polymeráza  (1 z 11
polymeráz)
4. Spojení ligáza (ATP)
NER - Nucleotide Excision Repair
Rozdíly od BER
Používá jiné enzymy. Přestože je
špatná jen 1 báze, je jich
vystřiženo a opraveno více
(12). Opravuje např.
thyminové dimery nebo
důsledky oxidačního stresu,
modifikované baze.
1. Rozpoznání proteinovými
faktory (podjednotky
endonukleázy - UvrA,B,C) - na
základě deformace DNA
2. Vystřižení postiženého místa i
s okolím v obou směrech
(nukleáza).
NER - Nucleotide Excision Repair
3. Rozmotání DNA ­
bublina (transkripční
faktory IIH, TFIIH)
DNA-helikáza
4. Syntéza na základě
komplementárního
vlákna (DNA
polymeráza  a )
5. Spojení DNA ligázou
Chyby ­ Xeroderma
Pigmentosum
MMR - Mismatch Repair
Opravuje chyby v párování,
špatně zařazené nukleotidy
Existuje celý komplex proteinů
pro tyto opravy ­MutS protein
nasedá s MutL na špatně
zařazenou bázi a aktivují MutH,
který vytvoří štěrbinu v nově
vznikajícím řetězci. Takto
porušený řetězec je vyštěpen
exonukleázou, resyntetizován
DNA polymerázou a spojen
DNA ligázou. U eukaryont
homology MutS=MSH,
MutL=MLH
Chyby ­ predispozice k
nádorům střev
Mechanismus opravy
chybného párování
bází u eukaryot
 Espero Publishing, s.r.o.
Chybné párování bází v DNA a jeho oprava
 Espero Publishing, s.r.o.
a) Pokud nedojde k
opravě vzniká
permanentní mutace v
jedné z DNA molekul
vznikající při další
replikaci
b) Pokud je k opravě
použit nově
syntetizovaný řetězec
jako templát, oba
řetězce vznikající další
replikací jsou mutované
c) Pokud je jako
templát použit
starý řetězec,
mutace je
eliminována
Zlomy DNA - DSB Double strain breaks
Homologní rekombinace ­
zlomené konce jsou opraveny
na základě informace
neporušených sesterských
chromatid (G2) nebo
homologních chromozomů
(G1). ,,DNA-damage binding
protein". RecAp,Rad50
skupina proteinů, BRCA1 a
2p. Poškozený ch. se dostává
do synapse s nepoškozenou
homologní DNA, probíhá
především v S a G2 fázi.
Holyday junction
www.riken.jp/.../info/ release/news/2004/may/
Přímé spojení zlomených
konců ­ vyžaduje rozpoznání
a vazbu konců a jejich
přiblížení pro ligaci. Není
nutná homologie ani synapse.
Probíhá především G0 a G1
fázi.
Protein Ku u eukaryont
katalytická podjednotka
DNA-dependentní protein
kinázy,
DNA ligáza IV, Rad50p-
NBS1 komplex (exo a
endonukleázy), často i DNA
polymeráza
Výsledkem delece
Spojení nehomologních konců
Chyby ­ translokace ­ Burkitův
Lymfom, Philadelphský
chromozom (CML),
Leukémie B buněk
SOS- reparace
Koordinovaná syntéza enzymů a činnost
odpovídajících opravných mechanismů indukovaná
poškozením DNA u bakterií
Účastní se jí produkty genů uvrA, uvrB, uvrC
(protomery endonukleázy)
Gen recA ­kóduje RecA protein ­ proteáza štěpící
represor LexA a umožňuje transkripci genů uvrA,
uvrB, uvrC ­ odstraňování tyminových dimerů
Další geny ­ umuC ­ ruší mutační účinky a nepřesné
opravy
Epstein. Human Molecular Biology. Cambridge
University Press. 2003
Mutace a rakovina
KancerogenezeMutageneze
Korelace je zřejmá pro chemické kancerogeny ­
jednoduché lokální změny sekvencí, ionizační a rentgenové
záření (chromozomové zlomy a translokace) a viry
(cizorodá DNA v buňce)
Mutace a rakovina
V lidském těle za život ­
1016 buněčných dělení
V prostředí bez mutagenů
10-6 pravděpodobnost
vzniku mutace na buněčné
dělení a gen , takže za
život 1010 mutací na
každý gen
!?!Otázka není proč
rakovina vzniká, ale proč
vzniká tak málo často?!?
Výskyt
rakoviny
jako funkce
věku
 Espero Publishing, s.r.o.
!!! 1 mutace nestačí; většina mutací je opravena !!!
Poruchy reparačních systémů
zvýšený výskyt malignit
přecitlivělost vůči látkám poškozujícím DNA
přecitlivělost vůči UV-záření
onemocnění nervového systému
některé poruchy imunitního systému
Xeroderma pigmentosum
zvýšená citlivost vůči UV
defektní excize thyminových dimerů,
defektní reparační syntéza DNA
zvýšená frekvence výměny sesterských
chromatid po UV
vyšší mutační rychlost po působení
mutagenů,
zvýšená citlivost vůči ionizujícímu záření,
snížená aktivita apurinové endonukleázy
Rakovina kůže, zvýšená frekvence
ostatních rakovin Epstein. Human Molecular
Biology. Cambridge
University Press. 2003
Dědičné nádory střev - Hereditary non-polyposis
colon cancer (HNPCC)
Výskyt v nízkém věku
AD dědičnost, vysoká penetrance
Asociace s mutacemi genů zúčastněných v mischmatch
repair (MSH2 a MLH1)
Další choroby
Ataxia teleangiectatica - progresivní mozečková ataxie,
teleangiektazie kůže, defekty imunity, častá
lymfoproliferativní onemocnění ­ leukémie, lymfomy
Cockaynův syndrom - postižení kostry, kůže, nervového
systému, degenerace sliznic a demyelinizace neuronů,
snad vliv zpomalené reparace
Bloomův syndrom ­ mutace v genu pro helikázu ­
genetická instabilita, malý vzrůst, defekty imunity,
diabetes, rakovina
Fanconiho anemie - aplastická anemie, retardace, akutní
myeloidní leukémie
Další choroby
Alberts et al., 2002