Hlavní mechanismy rezistence. In vitro testování citlivosti a rezistence. Základy antimikrobiální terapie -- VSAT081 Týden 4 Ondřej Zahradníček Rezistence mikrobů na antimikrobiální látky * Primární rezistence: všechny kmeny daného druhu jsou rezistentní. Příklad: betalaktamová atb nepůsobí na mykoplasmata, která vůbec nemají buněčnou stěnu. * Sekudndární rezistence: vznikají necitlivé mutanty, a ty při selekčním tlaku antibiotika začnou převažovat. (Escherichie mohou být citlivé na ampicilin, ale v poslední době výrazně přibývá rezistentních kmenů Mechanismy rezistence I * Mikrob zabrání vniknutí antibiotika do buňky * Mikrob aktivně vypuzuje atb z buňky * Mikrob změní cílový receptor nebo nabídne antibiotiku falešný receptor * Mikrob prodělá metabolické změny, jež atb zabrání vyvinout účinek v obvyklých cílových strukturách * Mikrob enzymaticky štěpí antibiotikum (například betalaktamázy štěpí betalaktamová antibiotika) Mechanismy rezistence II: vzájemné rozdíly mezi nimi * Některé rezistence jsou kódovány chromozomálně * Jiné naopak plasmidově, přičemž plasmidy mohou být předávány vnitro- i mezidruhově Mechanismy rezistence: I. Betalaktamová antibiotika * Změna penicilin-vázajících proteinů (penicilin binding proteins, PBP), např. u MRSA (podrobněji příště) * Snížená permeabilita membrány * Produkce betalaktamáz, například: -- Stafylokokové penicilinázy -- Penicilinázy enterobakterií -- Cefalosporinázy různých mikrobů -- Širokospektré betalaktamázy (podrobněji příště) Betalaktamázy * Existuje jich různé typy, mohou být účinné proti všem či většině betalaktamových atb či jen proti některým z nich * Mohou být kódovány chromozomálně i plasmidově * Principem je vždy rozštěpení betalaktamového kruhu Klasifikace betalaktamáz dle Bushe Mechanismy rezistence: II. Aminoglykosidy a makrolidy * Snížená vazba na cílové ribozomy * Snížená permeabilita buněčné stěny * Produkce inaktivujících enzymů Mechanismy rezistence: IV. Tetracykliny * Nedostupnost cílových ribozomů * Aktivní buněčný eflux (vylučování atb z buňky) Mechanismy rezistence: VI. Sulfonamidy, trimetoprim * Rezistence syntetázy kyseliny dihydrolistové * Rezistence reduktázy kyseliny dihydrolistové * Snížená permeabilita Další důvod in vitro neúčinnosti: Bakterie v biofilmu Následujících několik obrazovek je převzato, přeloženo a upraveno z prezentace mé kolegyně: Stádia rozvoje biofilmu * Přímý kontakt planktonických bakterií s povrchem + * Přilnutí na tento povrch * Adhese, růst a shlukování bakterií do mikrokolonií * Produkce polymerické matrix * Vytvoření třidimenzionální struktury známé jako biofilm Hlavní význam tvorby biofilmu Neúčinnost antibiotik může být způsobena * Polyanionickým nábojem usazených buněk * Sníženým množením bakterií * Difusní bariérou glykokalyxu * Reakcí s matrix biofilmu * Tvorbou chráněných fenotypů * Mechanismy intercelulární signalizace (quorum sensing) * Vlivem imunitní odpovědi hostitele Příklad: citlivost kmene Staphylococcus aureus číslo 351 Řešení * Myslet na reálnou skutečnost, že bakterie nežijí jen v planktonické formě, ale i ve formě biofilmu (zejména u některých typů infekcí) * Využívat synergických kombinací antibiotik * Vedle MIC vyšetřovat i MBIC, a to nejen na jednotlivá atb, ale i na kombinace Tato problematika je v současnoti předmětem výzkumných úkolů. Realitou je i to, že in vivo může být terapie úspěšná i tam, kde podle in vitro stanovení MBIC by být neměla Metody zjišťování citlivosti in vitro * Zjišťování citlivosti in vitro = v laboratoři * Nezaručí stoprocentní účinnost léčby * Přesto vhodné u většiny nálezů kultivovatelných patogenních bakterií Difúzní diskový test * Na MH (nebo jiný) agar se štětičkou plošně naočkuje suspenze baktérie * Pak se nanášejí tzv. antibiotické disky -- papírky napuštěné antibiotikem * Atb difunduje (prostupuje) z disku agarem dál * Koncentrace atb klesá se vzdáleností od disku * Pokud mikrob roste až k disku, nebo má jen malou zónu, je rezistentní (necitlivý) * Je-li kolem disku dost velká zóna citlivosti (větší než stanovená hranice), je citlivý. Difúzní diskový test E-testy * Podobné v principu difúznímu diskovému testu * Místo disku se však použije proužek * V proužku stoupající koncentrace atb od jednoho konce ke druhému (získáno díky speciální technologii -- proto jsou tak drahé) * Zóna není kruhová, ale vejčitá. * Test je kvantitativní * Na papírku je stupnice -- jednoduché odečítání (viz obrázek na další obrazovce) E-test: ukázka Mikrodiluční test * Atb je v řadě důlků v plastové destičce, koncentrace postupně klesá * Nejnižší koncentrace, která inhibuje růst, představuje hodnotu MIC * V přiložené šabloně je zpravidla označen breakpoint. Je-li MIC nižší než breakpoint, je kmen cilivý. Je-li MIC vyšší, je rezistentní * Jedna destička se zpravidla použije pro jeden kmen, např. 12 antibiotik, každé v 8 různých koncentracích (přesněji: dvanácté jen v sedmi, rohový důlek vpravo nahoře je kontrola růstu) Mikrodiluční test -- ukázka Interpretace stanovení MIC * Ideální je nastolit stav aktivní spolupráce klinického oddělení a mikrobiologie * Pokud se stanovení MIC používá jen kvalitativně (jako "lepší diskový test"), je to škoda * Klinik by měl chtít vědět, jaký je poměr mezi MIC a breakpointem pro jednotlivá antibiotika, a při výběru ATB volit i podle tohoto poměru. * Na druhé straně, konečný výběr antibiotika je na klinikovi -- mikrobiolog nezná další souvislosti (alergie, stav jater a ledvin pacienta apod.) Interpretace testu I Interpretace testu II Kdy nestačí "citlivost" * U močových infekcí by nás měl zajímat breakpoint odvozený od koncentrací dosažitelných v moči, nikoli v séru. (U většiny močových infekcí se ovšem MIC nezjišťuje) * U abscesů, procesů v kostech a zejména u meningitid: breakpointy jsou vyjádřením koncentrace atb především v séru, a že v různých místech těla mohou být mnohem nižší * Je také nutno počítat s tím, že mikroby mohou existovat ve formě biofilmu -- nutno určovat hodnoty např. minimální biofilm eradikující konc. Určování MBIC a MBEC Zjišťování faktorů rezistence * Někdy je lépe speciálními metodami zjišťovat přítomnost konkrétních faktorů rezistence, např. betalaktamáz. * Může se jednat o diagnostické proužky (chemický průkaz daného enzymu) nebo testy na jiném principu. * Používá se zejména tam, kde testy citlivosti nedávají spolehlivé výsledky (z různých důvodů, např. nepůsobí testovaná látka přímo, ale jeho metabolit, a podobně) Testování kmenů na produkci běžných betalaktamáz Testování na produkci širokospektrých betalaktamáz Děkuji za pozornost