DNA knižnice



O/    Čo je to DNA knižnica?

  l     Súbor naklonovaných rekombinantných plazmidov nesúcich rôzne fragmenty DNA



O/    2 typy DNA knižníc:

  l     Genómová

  l     cDNA

  

O/    Genomová knižnica obsahuje celú informáciu obsiahnutú v genóme (geny a nekódujúce sekvencie)





O/    cDNA knižnica obsahuje iba gény exprimované v určitom štádiu vývoja organizmu alebo v
špecifickom tkanive









  

  

                                     Čo je to genómová knižnica

*      Genómovou knižnicou nazývame zbierku naklonovaných fragmentov bunečnej DNA

                                  Príprava genómovej knižnice DNA

Ÿ     Izolácia celkovej DNA zo vzorku tkaniva alebo bunečnej štruktúry

Ÿ     Rozštiepenie celkovej genómovej DNA na menšie praktickejšie úseky

Ÿ     Štiepenie prebieha buď mechanicky alebo restrikčnou endonukleazou

Ÿ     Každý z fragmentov bunečnej DNA je zložený do klonovacieho vektora a pomnožený v
hostiteľskej bunke (E. coli)



                                        Tvorba DNA knižnice



                  Alternatívna stratégia -- použitie RNA a vytvorenie cDNA knižnice

                                           cDNA knižnica

Ÿ      DNA vyšších organizmov obsahuje intróny, ktoré sú pre DNA knižnicu nepotrebné (cDNA
knižnica obsahuje len čisté kódujúce sekvencie!!!)

e  Vhodnejšie použiť RNA (mRNA) 

Ÿ      V bunke došlo k transkripcii z DNA do RNA, prepísali sa len kódujúce sekvencie, intróny
vystrihnuté

Ÿ      RNA je špecifická pre danú bunku!!! (všetky bunky neobsahujú tu istú RNA, ako to bolo
pri genómovej knižnici)

                                        Tvorba cDNA knižnice

Ÿ      Potreba prepísať RNA do sekvencie DNA -- enzým reverzná transkriptáza (RT)

Ÿ      RT vyžaduje primer (krátky úsek DNA)

Ÿ      Vytvára komplementárne vlákno k RNA -- tzv. cDNA vlákno (complementary DNA)

Ÿ      Vzniká heteroduplexná dvojreťazcová RNA/DNA molekula

Ÿ      Čiastočná degradácia RNA reťazca (enzým RNasa H)

Ÿ      Dosyntetizovanie degradovaného reťazca DNA polymerázou, zbytok RNA slúži ako primer



                                        Tvorba cDNA knižnice

Ÿ     Výsledok: dva reťazce DNA = dvojreťazcová cDNA

Ÿ     Následne rovnaký postup ako pri tvorbe genómovej knižnice



Ÿ     cDNA knižnica = súbor klonov cDNA fragmentov, pripravených z mRNA izolovanej z určitého
tkaniva



                                 Genómová knižnica -- cDNA knižnica

                                         Genómová knižnica

O/  Získanie dostatočného množstva genetického materiálu pre určenie sekvencie genómu

O/  Len niekedy na izolovanie žiadaného génu

  l    Bakteriálne gény (kódujúce oblasti neporušené nekódujucími sekvenciami)

  l    Identifikácia:

    *   hybridizácia so značenou sondou

    *   Vnesenie do mutantného hostiteľa

                                          Vyššie organizmy

O/  Kódujúce sekvencie porušené intronmi

eSpätný prepis mRNA do DNA

                                           Knižnica cDNA

O/  Obsahuje len tie kódujúce sekvencie, ktoré sú v danej bunke v daný čas exprimované

O/  Umožňuje zistiť sekvenciu AK v bielkovinách

                                      Ďalšie typy DNA knižníc



                                                EXPRESNÍ GENOMOVÁ KNIHOVNA

vychází z cDNA knihovny, která je ale umístěna v expresních vektorech (klonovací vektory, které
navíc transgen v nich obsažený exprimují do proteinu) Používají se pro hledaní genů pokud známe
pouze protein, který kodují (pomocí protilátky)

                                                CHROMOZOMOVÉ KNIHOVNY

obsahují informaci pouze z jednoho chromozomu (jsou menší)

                                               

                                                HYBRIDNÍ KNIHOVNY

systém pro studium interakce protein- protein, bait vector (návnada) obsahuje gen pro protein, který
studujeme a fish vector (obsahuje danou cDNA expresní knihovnu)