Izolace DNA

                                            Izolace DNA

*       Izolace genetického materiálu (DNA) je prvním   

     krokem většiny molekulárně genetických technik.

*       Skládá se z rozbití tkáně a buněk, izolace a čištění a

     stanovení koncentrace a čistoty získané DNA.

*       Izolace DNA spočívá v uvolnění DNA z vazby na

     jaderné proteiny a následném odstranění

     kontaminujících komponent.

*       Jadernou DNA je možné izolovat z lidských

     buněk,tkání a orgánů , a to přímo z buněk bez v

     předchozí izolace jader.

*       Podstatou metody je desintegrace komplexů DNA-

     protein a nasledná extrakce čisté nerozštepené DNA

     bez RNA a proteinů.

                                             Typy metod

                                  Fenol-chloroformová deproteinace

1. homogenizace tkáně v pufru (např. dodecylsíran sodný, SDS- rozpustí buněčné membrány )

    -  rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinasy K ( teplotní optimum kolem 60 °C).

2. denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu (DNA je disociovaná, proteiny
se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze )

3. DNA se vysráží z vodného roztoku

4. vysrážená DNA se promývá v 70% ethanolu, který rozpustí zbytky solí a bílkovin, samotná DNA však
zůstane nerozpuštěná

                                  Izolace DNA z neseparované krve

1. Odebrat krev do EDTA-etylendiamintetraoctová kyselina [například smícháním 50 ul 50 mM (nebo 2%)
EDTA s 0,5 ml krve].



2. Do 1,5 ml zkumavky vpravit 1 ml DNA vazebného pufru, 50 ul DNA bind partikulí (po extensivním
protřepání a míchání) a 50 ul krve s EDTA. Směs inkubovat 10 min. , zkumavky stočit na mikrofuze 30
sec.



3. Peletu DNA bind a nukleových kyselin postupně opláchnout:

      - 1 x 1 ml DNA vazebný pufr

      - 2 x 1 ml promývací pufr

      - 1 x 1 ml acetonu a pak( vysušit peletu 10 min. při 56oC )

                            Izolace DNA z neseparované krve-pokračovaní

4. K vysušené peletě přidat 100 ul elučního pufru, vortexovat a inkubovat 10 min při 56oC; dojde k
uvolnění DNA z DNA bind.

5. Vzorek  centrifugovat  1  min.  na  mikrofuze a supernatant s DNA (přibližně 1 ug) přenést do
nové zkumavky.



                                            DNA Lego kit

*       základ moderní soupravy  pro izolaci čistých

      preparátů DNA

*       využívá poznatku o kapacitě křemičitých 

      mikropartikulí vázat DNA v přítomnosti    chaotropních látek

*       ve srovnání s klasickými metodami izolace DNA je

      rychlejší (nevyžaduje etanolovou precipitaci a

      vysoušení), bezpečnější (nevyžadují fenolovou

      extrakci) a izolované preparáty DNA jsou podstatně

      čistější

*       zrychlení procedury izolace DNA a větší výtěžky

      izolované DNA jsou dosaženy nahrazením řady

      centrifugačních kroků podtlakovým promýváním

                                      DNA Lego kit-pokračování

*       Komponenty DNA Lego kitu:

*       DNA bind, 25 ml, křemičité mikropartikule                          

*       DNA vazebný pufr, 150 ml                       

*       Promývací pufr, 500 ml

*       Minikolonky a nástavce, 25/250 ks



                                                  KONEC